يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زراعة أنسجة المبيض تصور الظواهر في المبيض الماوس

13.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57794

⸱

يونيو 19, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Aichi Medical University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nagoya University Graduate School of Medicine, 3Department of Maternal and Perinatal Medicine, Nagoya University Hospital

في هذه المقالة

ملخص

يمكن أن تستخدم كنماذج الكبدية التنمية والاباضه جريب جريب زرع الأنسجة المبيض وتشير إلى آليات تنظيمية للعمليات الدينامية المبيض.

الملخص

أوفولاتي الإناث الثدييات دورياً على عدد يكاد يكون مستمرا من بويضات خلال كل دورة السفاد. للحفاظ على مثل هذا الانتظام وتواترها، يحدث التنظيم على مستوى محور طائي جوندال الغدة النخامية وعلى تطوير المسام في المبيض. على الرغم من الدراسات النشطة، آليات التنمية المسام ليست واضحة عدة الخطوات التي تنطوي عليها من تنشيط المسام البدائية نائمة للتبويض، وبسبب تعقيد التنظيم التي تختلف في كل مرحلة من مراحل الحبيبي. للتحقيق في آليات التنمية جريب، وديناميات المسام طوال دورة السفاد، قمنا بتطوير نموذج زراعة أنسجة المبيض ماوس التي يمكن استخدامها لمراقبة التنمية المسام باستخدام مجهر. التنمية جريب منتظمة والاباضه دورية الكبدية جريب يمكن جميع تكون مستنسخة في نموذج مثقف المبيض، ويمكن أن تكون شروط الثقافة والتضمين تجريبيا. هنا، علينا أن نبدي بفائدة هذا الأسلوب في دراسة آليات تنظيمية للتنمية المسام وغيرها من الظواهر المبيض.

المقدمة

الماوس الإناث المبايض تحتوي على عدة آلاف من المسام1، ونضوج التبويض الدورية حوالي عشر بويضات في كل دورة السفاد. المسام وتصنف إلى عدة مراحل النمو: البدائي، والابتدائي والثانوي، أنترال، وجراب جرافيان، اعتماداً على شكل طبقة الخلايا granulosa المحيطة بكل البويضات. معظم المسام البدائية نائمة، وبعضهم يتم تفعيلها وتنمو لتصبح المسام الأولية في كل دورة السفاد2. بعد المرحلة الثانوية جرابي، تنظمه التنمية جريب أساسا gonadotropins، جرابي تحفيز هرمون (FSH) والهرمون (LH). بيد أن التنمية جريب البدائية والأولية بشكل مستقل تروج والآليات التنظيمية التي تحكم هذه المراحل تظل سيئة إينديرستود3،،من45. بالإضافة إلى عوامل النمو والهرمونات، ينظم التفاعلات بين المسام6،7المسام البدائية والأولية. ولذلك، بإجراء تحليلات لديناميات جريب في أنسجة المبيض الماوس، والتحقيق في الآليات التنظيمية المرتبطة باستخدام زرع الأنسجة المبيض8،،من910.

هنا، نحن نقدم طريقتين نموذج زراعة أنسجة المبيض. الأولى تستخدم لتحليل التنمية جريب بقياس مناطق جرابي، ويستخدم الثاني لدراسة الآلية التنظيمية أثناء المبكرة جريب من البدائية إلى المرحلة الثانوية المسام مع الفئران المعدلة وراثيا. لتحليل التنمية جريب، استخدمنا أساسا المبايض فئران الإناث 4-الأسبوع القديمة لأنها تسمح للتصور سهلة للمسام. للحث على الإباضة الدورية ونموذج التنمية في فيفو جريب، نحن استنسخت طفرة LH والاباضه الملاحظة، والكبدية المسام وإفراز الاستراديول تحت ظروف زراعة الأنسجة. تم القبض على الصور لاستزراع المبيض، وتم تحليل عمليات التنمية جريب بتتبع التغييرات في منطقة جرابي. ومع ذلك، في الحقل مشرق تحليلات مجهرية، التمييز بين المسام الأولية البدائية وأوائل الواضح. وبالتالي، قمنا بتطوير أسلوب للكشف عن المسام الصغيرة، والتمييز بين البدائي، الابتدائي، ومثقف جريب الثانوية في أنسجة المبيض باستخدام Oogenesin1 pro3 (Oog1)- 9 والمبايض R26-H2B-مشري الفئران المعدلة وراثيا في الأيام 0 و 4 بعد الولادة11. التعبير Oog1 قابلاً للاكتشاف في بويضات بعد الدخول إلى الانقسام، ويزيد تدريجيا مع التنمية المسام، مما يتيح رصد الانتقال من البدائي للمسام الأولية باستخدام الصور الوقت الفاصل بين أنسجة المبيض مثقف11 ،12. على الرغم من أن قد استخدمت الطرق المورفولوجية لدراسة العوامل التي تنشيط المسام البدائية نائمة13،14،،من1516، التنمية جريب الفسيولوجية في المبيضين صعوبة في مراقبة، ولا تزال آثار العوامل المختلفة أونتشاراكتيريزيد. وصممت أساليب الثقافة الحالية لمعالجة هذه الندرة في الوقت الحقيقي تحليلات عوامل الهدف.

في هذه الدراسة، ونحن تتبع التنمية الحبيبي باستخدام طريقة تصوير الوقت الفاصل بين وتتميز عملية التنمية جريب. لدينا أساليب مبتكرة توفر أداة غير مسبوقة للتحقيق فسيولوجيا المبايض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إيواء الفئران في غرفة التحكم بيئياً في 23 ± 1 درجة مئوية مع ح 12 ضوء/12 ح دورة الظلام. بروتوكولات الرعاية الحيوانية وتجارب أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية "التجارب الحيوانية" في جامعة الطب إيشي ووافقت عليها واجب رعاية الحيوانات واستخدام اللجنة.

1-إعداد الثقافة المتوسطة وأطباق

  1. إعداد الأساسية الثقافة المتوسطة، إضافة المصل الجنيني البقري (FBS، 5% v/v)، FSH (100 mIU/mL)، LH (10 mU/mL)، والبنسلين-ستربتوميسين (البنسلين، يو/مليلتر 100؛ ستربتوميسين، 100 مغ/مل) إلى الحد الأدنى الأساسية المتوسطة ألفا (MEM-ألفا) ومزيج في أنابيب 50 مل.
    ملاحظة: مجموع أحجام الوسائط الثقافة المطلوبة تختلف بين التجارب، ولكن 1 مل من الثقافة المتوسطة يكفي بوجه عام عن 3.5 سم أسفل الزجاج ثقافة الأطباق.
  2. صب مختبرين 1 مل من مختلطة الثقافة المتوسطة في 3.5 سم أسفل الزجاج ثقافة الأطباق وتعيين مكان مم 30 خلية إدراج الثقافة في الأطباق. وسائل الإعلام قبل الحارة والاطباق في حاضنة (5% CO2 و 37 درجة مئوية).

2-إعداد أنسجة المبيض

  1. فوسفات الحارة قبل مخزنة المالحة (PBS) (−) والفنزويلية-ألفا التي تحتوي على 5% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 مغ/مل في حاضنة (5% CO2 و 37 درجة مئوية).
    ملاحظة: حوالي 3 مل مختبرين "برنامج تلفزيوني" (−) كل المبيض تكفي للاستخدام أثناء تشريح المبيض، ومختبرين 1 مل من MEM-ألفا كافية لتخزين عابر المبايض واحد في الأطباق 3.5 سم.
  2. المكوس المبايض من الفئران الممثل المدني الدولي (المسماة بعد معهد أبحاث السرطان) الإناث 4-الأسبوع القديمة وقطع الأنسجة المحيطة بالمبيض باستخدام مقص وملاقط تحت مجهر مجسمة. احتياطي المبيض تمت إزالتها في الثقافة المتوسطة (راجع الخطوة 2، 1) حتى الاستخدام.
    1. قبل استعد مكان المبايض واحدة على ورقة تصفية مبلل مع "برنامج تلفزيوني" (−) (راجع الخطوة 2، 1) وشريحة إلى 4 قطع باستخدام شفرة مبضع تحت مجهر مجسمة.
      ملاحظة: المبايض فئران الممثل المدني الدولي 4-الأسبوع القديمة حوالي 2 ملم في القطر. عدد القطع يعتمد على حجم المبيض؛ بيد أن حوالي 500 ميكرومتر سميكة قطعة تسمح للملاحظات جريب السليم (في قطع أكثر سمكا من 500 مم، انخفض الأنسجة الشفافية؛ وكسر المسام antral العديد من القطع أرق من 500 ملليمتر، وفقدت).
    2. بعد التشريح، وضع العينات المبيض شرائح في مستنبت المعالجون مسبقاً في الأطباق 3.5 سم (راجع الخطوة 2، 1).

3. زراعة أنسجة المبيض

  1. إسقاط حوالي 0.5 ميليلتر من المتوسطة الثقافة الواحدة وشرائح أنسجة المبيض على إدراج الثقافة الخلية حيث سيتم أنسجة المبيض تعيين باستخدام ميكروبيبيتي.
  2. ضع كل شرائح العينة إلى انخفاض المتوسط الثقافة على إدراج الثقافة الخلية باستخدام الملقط.
  3. الثقافة أنسجة المبيض في 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
  4. استبدال المتوسطة الثقافة مع متوسط حرارة قبل جديدة كل يومين.
    ملاحظة: الجدول الزمني للتغييرات متوسطة لثقافة المقاطع المبيض من الفئران الممثل المدني الدولي 4-الأسبوع القديم يرد في الشكل 1.
    1. إنتاج طفرة LH, علاج مثقف المبايض الفئران الممثل المدني الدولي 4-الأسبوع القديمة مع المتوسط التي تحتوي على 100 مو/مل FSH و LH ح 12 كل 4 أيام (الشكل 1).

4-المجهر الصور لاستزراع المبيض

  1. بدء التصوير المبايض مثقف بعد يوم 1 عندما انضمت الأنسجة على إدراج الثقافة في الخلية، وإجراء تحليلات مجهر [كنفوكل] أو مقلوب في فترات ح 24 للسماح بنمو جريب كافية بين النقاط الزمنية.
    ملاحظة: الفحص المجهري [كنفوكل] متفوقة على المجهر المقلوب لمراقبة المسام في المبيض كله مثقف.

5-الوقت الفاصل بين التصوير لاستزراع المبيض

  1. تحسين ظروف الوقت الفاصل بين التصوير، بما في ذلك كثافة الليزر وأوقات التعرض لنظام التصوير (الجدول 1).
    1. تحديد العينات المزدوجة المبيض من الفئران واحدة للاستخدام كمجموعات العلاج والتحكم. وتختلف كثافة الليزر ووقت التعرض تحقيق أفضل الصور (الجدول 1).
    2. مقارنة نمو جريب تحت كل شرط الثقافة عن طريق قياس المجالات جريب في صور عينات التحكم في فترات ح 24 وفي الوقت الفاصل بين العينات التصوير (راجع الخطوة 6). وفي الوقت نفسه، عد من بويضات أوفولاتيد في كل مجموعة المبيض واختيار أفضل الظروف الوقت الفاصل بين التصوير.
  2. التقاط الصور في فواصل 30 دقيقة باستخدام الوقت الفاصل بين نظام التصوير ظروف محددة (الجدول 1).

6-تحليل النمو جريب

  1. لتحليل وضع جريب، قياس مجالات جريب في الصور التي تم التقاطها باستخدام برنامج إيماجيج (http://resbweb.nih.gov/ij/).
    1. في البداية، بتعيين حجم الصورة بواسطة النقر فوق "ضبط مقياس" تحت "تحليل" في شريط الأدوات. أدخل طول الجانب من الصورة التي تم التقاطها والأرقام المقابلة بكسل في الحقول الفارغة من "المسافة المعروفة باسم" و "المسافة بالبكسل"، على التوالي.
    2. انقر فوق "اليد الحرة" في شريط الأدوات، ومخطط المسام في الصور الميدانية مشرق الملتقطة.
    3. انقر فوق "إجراء" إطار "تحليل" في شريط الأدوات.
      ملاحظة: إذا هي رغبت في بيانات القياس الأخرى، انقر فوق "تعيين القياس" تحت "تحليل" في شريط الأدوات، والتحقق من المربعات المناسبة في القائمة.

7-تحليل التنمية المسام باستخدام الفئران المعدلة وراثيا

  1. جمع المبايض من شريحة يوما بعد الولادة 0 و 4 (P0 و P4) أنثى الفئران المعدلة وراثيا التي تتضمن في المتسلسلات Oog1pro3.9 و R26-H2B-مشير، والثقافة على إدراج كما هو موضح في الخطوات 1.1 – 3.2، إلا إذا لم تقم بذلك P0 والمبايض P4.
  2. استبدال المتوسطة الثقافة المتوسطة الطازجة، والمعالجون مسبقاً في الأطباق 3.5 سم في حاضنة الذي يحتوي على 5% CO2 في 37 درجة مئوية كل يومين.
    ملاحظة: تركيز LH في الأجلين المتوسط وثقافة من المبايض P0 و P4 يمكن أن تظل ثابتة لأن لا تحدث العواصف LH في الفئران P0 و P4.
  3. تعيين المجهر لتصور فقط إيجابية AcGFP1 المسام الأولية في المبيضين P4 المستزرعة (الجدول 1).
    ملاحظة: المسام الأساسي والابتدائي فقط موجودة في المبيضين الماوس الإناث P4.
  4. التقاط الصور من مثقف P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-مشري المبايض الفئران المحورة وراثيا على فترات 30 دقيقة باستخدام الإعدادات المستخدمة المبايض P4 (راجع الخطوة 5، 2).
  5. تتبع وتحليل التنمية المسام باستخدام الإشارات AcGFP1 ومشري H2B.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 1 البروتوكول المتعلق بالتغييرات في وسائل الإعلام أثناء زراعة أنسجة المبيض. وبعد هذا البرنامج، عمرها 4 الأسبوع الممثل المدني الدولي الفئران المبايض مثقف وتصويرها على فترات 24-ح استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] (الشكل 2). خلال ثقافة أنسجة المبيض لمدة 3 أسابيع، كانت تحولت معظم المسام أنترال والثانوي قبل الكبدية المسام وبعضها أوفولاتيد (الشكل 2د و الجدول 2). في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة، قمنا بتطوير أسلوبي جديد لدراسة التنمية جريب في المبيضين الماوس. الأسلوب الأول ينطوي على ثقافة الفئران الكبار المبيض شرائح الأنسجة متبوعاً بتحليلات للتنمية جريب، والثاني ينطوي على استخدام الوقت الفاصل بين التصوير لتصور التنمية جريب المبكرة مرحلة مستقلة تروج. سابقا، استخدام أسلوب زراعة أنسجة المبيض الحالي لتقييم أثر العوامل المثبطة اللوكيميا والبروجسترون على جريب التنمية8،9، وتبين أن آثارها تختلف مع مرحلة التركيز والمسام. في هذه الدراسة، شرائح أنسجة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونحن نشكر الدكتور مينامي ناوجيرو (جامعة كيوتو) لتوفير الفئران Oog1pro3.9 . أيد هذا البحث JSPS (كاكينهي # JP15H06275) ومؤسسة نيتو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هرمون تحفيز الجريب من الغدة النخامية البشريةSIGMAF4021
هرمون التشحيم من الغدة النخامية للخيولSIGMAL9773
محلول البنسلين والستربتومايسينWako Pure Chemical Industries168-23191
MEM a ، GlutaMax ، بدون نيوكليوتيداتThermo Fisher32561037
طبق القاع الزجاجيMatTekطبق P35G-0-10-C35 مم ، غطاء رقم 0 ، قطر زجاجي 10 مم
إدراج ثقافة خليةMillicell PICM0RG50 ميرك ميليبورالقطر: 315 مم ، حجم المسام: 0.4 مم ، المواد: أطباق زراعة الخلايا المحبة للماء PTTE
3.5 سمGreiner bio-one627160
50 مل / أنبوب الطرد المركزي مع غطاء ختم ثلاثيIWAKI2345-050
شفرات منخفضة المستوى يمكن التخلص منها 819Leica14035838925
LSM 710Carl Zeissمجهر متحد البؤر
CellVoyager ، CV1000Yokogawa Electric Corporationتصوير الفاصل الزمني
BZ-X700KEYENCEاللقطات المتتابعة
تصوير

المراجع

  1. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  2. Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
  3. Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
  4. Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
  5. Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
  6. Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
  7. Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
  8. Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18(2015).
  9. Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
  10. Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
  11. Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686(2013).
  12. Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
  13. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
  14. Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
  15. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
  16. Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
  17. Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
  18. Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
  19. Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
  20. Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ImageJ FSH LH mCherry
زراعة أنسجة المبيض تصور الظواهر في المبيض الماوس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.