Method Article

تنقية فعالة والتنمية LC MS/MS-المستندة إلى تحليل لأحد عشر-عشرة إزفاء-2 5-ميثيلسيتوسيني ديوكسيجيناسي

DOI:

10.3791/57798

⸱

October 15th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, University of Missouri-Kansas City

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، فإننا نقدم بروتوكول لتنقية خطوة واحدة بكفاءة الإنسان معلم نشط إزفاء عشر-11-2 (TET2) ديوكسيجيناسي 5-ميثيلسيتوسيني باستخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني والتحليل استخدام كتلة سائل اللوني-جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-MS/MS)-النهج القائم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنظيم النسخ جينية توسط 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) لعبت دوراً حاسما في تنمية حقيقية النواة. يتم إنجاز demethylation هذه علامات جينية باكسدة متسلسلة بعشر-أحد عشر إزفاء ديوكسيجيناسيس (TET1-3)، تليها إصلاح الختان جليكوسيلاسي-تعتمد على قاعدة ثايمين-الحمض النووي. المنظمة الجينات TET2 بسبب الطفرات الوراثية أو عن طريق آليات جينية أخرى يقترن سوء تشخيص في المرضى الذين يعانون من سرطانات متنوعة، خصوصا من المكونة للدم الأورام الخبيثة. وهنا يصف لنا تنقية كفاءة خطوة واحدة من النشطة انزيماتيكالي ديوكسيجيناسي TET2 معلم البشرية باستخدام كروماتوغرافيا تبادل الأيونات الموجبة. كذلك نقدم نهجاً سائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS) التي يمكن فصل وتحديد مقدار أربع قواعد الحمض النووي العادي (A و T، ز وج)، فضلا عن أربع قواعد السيتوزين المعدلة (5-ميثيل، 5-هيدروكسيميثيل، 5-فورميل، و 5-الكربوكسيل). يمكن استخدام هذا الفحص لتقييم نشاط نوع البرية والمسخ ديوكسيجيناسيس TET2.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

موقف C5 قواعد السيتوزين داخل دينوكليوتيديس البد هو الموقع مثلايشن الغالبة في جينومات الثدييات1(5mCpG). وبالإضافة إلى ذلك، عدد من الدراسات التي أجريت مؤخرا كشفت C5 واسعة السيتوزين مثلايشن (5mC) في مواقع غير المعبأة (5mCpH، حيث ح = A, T, أو C)2،3. تعديل 5mC بمثابة كاتم الصوت النسخي على ريتروترانسبوسونس الذاتية والجينات المروجين3،،من45. مثلايشن الحمض النووي في 5mC كما تلعب أدواراً هامة في المنظمة كروموسوم إكس، طابعة الجينات، وإعادة برمجة النووي والجينات الخاصة بالانسجة التعبير5،،من67. مثلايشن سيتوزين في موقف C5 تضطلع ميثيلترانسفيراسيس الحمض النووي، والطفرات في هذه الإنزيمات تسبب عيوب إنمائية كبيرة8. تبدأ إزالة علامات 5mC TET1-3 5mC أوكسيداسيس،من910. تحويل هذه الأسرة تيت ديوكسيجيناسيس 5mC إلى 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيلسيتوسيني (5caC) عن طريق الأكسدة متسلسل الخطوات11،،من1213. وأخيراً، يستبدل ثيمين-DNA glycosylase إف سي 5 أو 5caC على السيتوزين غير معدلة باستخدام مسار إصلاح الختان القاعدة11.

واعتبرت TET2 الجينات البشرية كثيرا ما تحور جين في الأورام الخبيثة المكونة للدم المتنوعة بما في ذلك myelodysplastic المتلازمات (حركة الديمقراطيين الاشتراكيين)14،،من1516، حركة الديمقراطيين الاشتراكيين myeloproliferative الأورام ( مدسمبن)، واللوكيميا النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) التي تنشأ من حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، وحركة الديمقراطيين الاشتراكيين MPN16. مستويات تعديل 5hmC في نخاع العظام الحمض النووي أقل في المرضى مع الطفرات TET2 مقارنة بتلك التي مع نوع البرية (wt)-TET214. ووضعت عددا من المجموعات TET2-خروج المغلوب الماوس نماذج توضيح دورها في هيماتوبويسيس العادية وتحول النقوي17،18،،من1920. كانت هذه الفئران مع حدوث طفرات في الجين TET2 في البداية طبيعية وقابلة للاستمرار، ولكن تظهر الأورام الخبيثة المكونة للدم المختلفة كما أنها تتراوح أعمارهم في التسبب الوفاة المبكرة. وأظهرت هذه الدراسات الأدوار الهامة التي تقوم بها الوزن TET2 في تمايز المكونة للدم العادي. في هذه النماذج الماوس ومتخالف الخلايا الجذعية المكونة للدم (TET2+/- هسكس) متماثل TET2-/- قد هسكس ميزة تنافسية على هسكس TET2 وزن متماثل في إعادة إسكانها يكونوا الأنساب المكونة للدم ككل TET2+/- ووضع TET2-/- هسكس الأورام الخبيثة المكونة للدم متنوعة17،18. تبين هذه الدراسات أن هابلوينسوفيسينسي TET2 ديوكسيجيناسي يغير وضع هسكس والنتائج في الأورام الخبيثة المكونة للدم.

مشابهة للفئران مع الطفرات في الجينات TET2، معظم مرضى اللوكيميا المجاهرة هابلوينسوفيسينسي TET2 ديوكسيجيناسي النشاط. تشمل هذه الطفرات الجسدية معظمهم متخالف الطفرات تحول الإطار وهراء المنتشرة في جميع أنحاء الجسم الجينات TET2 بينما مغلطه الطفرات الأكثر متفاوت في المجال ديوكسيجيناسي12. حتى الآن، يقال توصيف قليلاً من TET2 wt والمسخ في الأدب أساسا بسبب صعوبات في إنتاج ديوكسيجيناسي TET2 وبه المقايسة21. هنا، نحن التقرير على تنقية خطوة واحدة بسيطة ديوكسيجيناسي TET2 الأصلية باستخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني. علاوة على ذلك، كان مقايسة LC-MS/MS كمية الأمثل والمستخدمة لقياس النشاط الأنزيمي من الأم TET2 ديوكسيجيناسي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-الاستنساخ وتنقية ديوكسيجيناسي TET2 البشرية غير المميزة

  1. استنساخ البشر TET2 ديوكسيجيناسي (1129-1936، TET2 Δ1481-1843) إلى ناقل الوجهة pDEST14 استخدام تقنية جزئ الخاصة بالموقع كما هو موضح سابقا22.
    ملاحظة: قد أثبتت الدراسات السابقة أن المجال ديوكسيجيناسي (1129-1936، TET2 Δ1481-1843) ج-محطة TET2 هو21،مجال نشاط حفازة الحد الأدنى23. من أجل التعبير عن ليس تمييز المجال ديوكسيجيناسي TET2 باستخدام ناقلات pDONR221، أدرجت متواليات تلميع دالجارنو وكوزاك في التمهيدي إلى الأمام خلال PCR (الجدول 1).
  2. من أجل التحول البكتيري، إضافة 1 ميليلتر من ناقلات التعبير المؤتلف pDEST14 التي تحتوي على ديوكسيجيناسي TET2 معلم البشرية (1129-1936، TET2 Δ1481-1843) إلى 100 ميليلتر من كيميائيا المختصة كولاي BL21 الخلايا (DE3) في أنبوب 1.7 مل. الحفاظ على الجليد الخليط لمدة 15 دقيقة على الأقل تليها صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية في حمام مائي.
    1. فورا بعد صدمة الحرارة، إبقاء الخلايا مرة أخرى على الجليد للحد الأدنى من 2 دقيقة. وفي أعقاب ذلك، إضافة 250 ميليلتر من مرق سوبر الأمثل مع القمع كاتابوليتي (S.O.C وسائل الإعلام) إلى الخلايا. احتضان الخلايا البكتيرية ح 1 في 37 درجة مئوية في شاكر.
    2. وبعد الحضانة، تدور أسفل الخلايا قبل سينتريفوجينج الأنبوبة في س 9,000 ز لتجاهل الحد الأدنى 1 70% المادة طافية من بيبيتينج حل بيليه في اليسار عبر وسائل الإعلام.
    3. نشر تعليق خلية على طبق أغار لوريا مرق (رطل) تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. احتضان لوحة ح 16 عند 37 درجة مئوية.
  3. حدد أحد مستعمرة معزولة وتطعيم ذلك إلى 10 مل الإعلام الأمبيسلّين رطل في أنبوب 50 مل. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية في شاكر لبين عشية وضحاها. وفي أعقاب ذلك، استخدام 100 ميليلتر للثقافة من أنبوب 50 مل لتطعيم 100 مل الإعلام الأمبيسلّين رطل. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية على شاكر 180 لفة في الدقيقة واستخدامها كالثقافة الأولية. في اليوم التالي، استخدم مل 6 كل من الثقافة الأولية لتطعيم قوارير 15، كل الوسائط التي تحتوي على مل 600 رطل-الأمبيسلّين. والآن، احتضان قوارير 15 في 37 درجة مئوية على شاكر 180 لفة في الدقيقة.
    ملاحظة: للتحقق من استنساخ محولة، إجراء الهضم تسلسل أو تقييد الحمض النووي مع بلازميد عزل الحمض النووي.
  4. للتحقق من كثافة ثقافة البكتيرية، قياس لها OD600 باستخدام جهاز المطياف الضوئي. بعد الثقافة تصل إلى كثافة 0.8 في التطوير التنظيمي600، الحث على التعبير عن البروتين TET2 مع 300 ميليلتر من 1 م (تركيز النهائي من 0.5 مم في 600 مل) إيبتج في كل قارورة، وكذلك تنمو ثقافة ح 16 في 17 درجة مئوية.
  5. بعد 16 ساعة، نقل ثقافة البكتيرية لزجاجات أجهزة الطرد المركزي. الطرد المركزي ثقافة البكتيرية التعبير عن إنزيم TET2 في س 5,250 ز 45 دقيقة استخدام بيليه البكتيرية لتنقية TET2.
    ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات المتبقية في تنقية البروتين على الجليد أو عند 4 درجة مئوية.
  6. ريسوسبيند بيليه البكتيرية في 100 مل من 50 مم مس (2-(ن-morpholino) حمض اثانيسولفونيك) المخزن المؤقت، الرقم الهيدروجيني 6، و sonicate عن 5 × 30 ثانية في السلطة 20 مع 60 s فترات التبريد.
  7. تدور جمع المادة التي تحتوي على الإنزيم TET2 القابلة للذوبان طافية في س 5,250 ز عن 45 دقيقة ويمر 0.45 ميكرومتر مرشحات قبل التحميل على نظام فبلك.
    ملاحظة: في هذه التجارب، كان الإنزيم TET2 مستقرة جداً، ولكن إذا لزم الأمر حوزتي المانع كوكتيل يحتوي على 1 مم بينزاميديني-HCl، وفلوريد فينيلميثيلسولفونيل 1 مم (بمسف) و 0.5 مم 1,10-س-فينانثروليني يمكن أن تضاف إلى الخلية إلى منع تدهور إنزيم TET2. تجنب استخدام يدتا أو عطا في المانع الكوكتيل هذه قد تتداخل مع كروماتوغرافيا تبادل الأيونات الموجبة التالية.
  8. علبة 30 مل راتنج تبادل الأيونات الموجبة القوية في عمود فبلك. حجته العمود مع 10 مجلدات سرير الغسيل المخزن المؤقت (العازلة مس 50 مم، الرقم الهيدروجيني 6) بمعدل تدفق ثابت من 0.3 مل/دقيقة باستخدام نظام فبلك.
  9. تحميل توضيح على العمود قبل متوازن والمياه والصرف الصحي مع ∼10 سرير حجم المخزن المؤقت الغسيل حتى يصبح من الواضح التدفق من خلال.
  10. الوت TET2 استخدام 0-100% التدرج من المخزن المؤقت الغسيل إلى شطف المخزن المؤقت (العازلة مس 50 مم، الرقم الهيدروجيني 6، 1 م كلوريد الصوديوم) في 15 سرير حجوم متبوعاً بعقد في المخزن المؤقت شطف 100% لوحدات التخزين اثنين سريراً.
    ملاحظة: جمع عينات (100 ميليلتر في كل) خلية قبل وبعد العمود تحميل جنبا إلى جنب مع جميع الكسور شطف وتحليل على 10 ٪ حل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
  11. تجمع الكسور التي تحتوي على بروتين TET2، وتجميد الجافة، حل البالته الإنزيم في 10 مل ماء ومخزن في-80 درجة مئوية.

2-أكسدة 5mC من ديوكسيجيناسي TET2

  1. أداء جميع ردود الفعل ديميثيليشن في ثلاث نسخ مع 3 ميكروغرام من الركازة (25-مير الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة، الجدول 2).
    1. إضافة 100 ميكروغرام لتنقية TET2 الإنزيم في 50 ميليلتر من رد فعل مجموع المخزن المؤقت الذي يحتوي على 50 مم حبيس (pH 8.0)، 200 ميكرومتر فيسو4، 2OG 2 مم (2-أوكسوجلوتاراتي/α-كيتوجلوتاراتي)، واسكوربات 2 مم واحتضان في 37 درجة مئوية ل 1 ح21.
    2. إخماد تفاعلات أكسدة TET2 حفزت مع 5 ميليلتر 500 مم يدتا.
  2. بعد تبريد ردود فعل TET2، إعداد العينات للتحليل LC-MS/MS بفصل الحمض النووي من خليط رد فعل TET2 باستخدام أعمدة تنقية اليغو.
    1. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم اليغو ميليلتر 55 تطفئ رد الفعل.
    2. وفي أعقاب ذلك، إضافة 400 ميليلتر من الإيثانول 100% إلى الخليط. تمرير هذا الخليط من خلال عمود ربط اليغو.
    3. يغسل الحمض النووي منضم مع 750 العازلة أغسل ميليلتر والوت في 20 ميليلتر المياه.
  3. هضم الحمض النووي المعزولة مع وحدات 2 من الدناز أنا ووحدات 60 من نوكلاس S1 في 37 درجة مئوية ح 12 لإنتاج الفرد نوكليوزيد-مونوفوسفاتيس.
  4. وبعد الهضم، إضافة وحدات 2 للعجل الفوسفاتيز القلوية المعوية (سياب) في العينات واحتضانها لإضافة ح 12 في 37 درجة مئوية لإزالة مجموعات الفوسفات الطرفي من نوكليوزيد-مونوفوسفاتيس للحصول على نوكليوسدس.
  5. التحديد الكمي لجميع نوكليوسدس، وبخاصة تعديل سيتوسينيس، استخدام الأسلوب LC-MS/MS الموصوفة أدناه.

3-كمية الإنزيم LC-MS/MS-تعتمد التنمية

  1. إعداد 100 ميكرومتر الأسهم حل جميع نوكليوسدس السيتوزين تم التعديل [5-الميثيل-2 '-ديوكسيسيتيديني (5mdC)، 5-هيدروكسيميثيل-2'-ديوكسيسيتيديني (5hmdC)، 5-فورميل-2 '-ديوكسيسيتيديني (5fdC)، و 5-كاربوكسي-2'-ديوكسيسيتيديني (5cadC)] وقواعد الحمض النووي العادي (الأدنين، ثايمين، سيتوزين، وجوانين) في المياه [هبلك]-الصف لتطوير أسلوب LC-MS/MS.
  2. تحسين نوكليوزيد-تعتمد على MS/MS المعلمات عن طريق غرس حلول الأسهم، في وقت واحد، في مطياف الشامل بمعدل تدفق 10 ميليلتر/دقيقة في EMS وضع الالتقاط بالماسح. تحسين أثر المعلمات: ديكلوستيرينج المحتملة (DP) ومدخل المحتملة (EP) والاصطدام خلية مدخل المحتملة (CEP)، الطاقة الاصطدام (CE) والاصطدام خلية الخروج المحتملة (ككسب) لكل نوكليوزيد الحمض النووي باستخدام الآلي التحسين الكمي ميزة البرنامج.
  3. تحسين معلمات MS/MS تعتمد على المصدر بالحقن ميليلتر 10 من الأسهم الحل باستخدام تدرج مع المذيب 25% ب بمعدل تدفق 0.3 مل/دقيقة حيث المذيبات A خلات الأمونيوم 10 ملم (pH 4.0) ومذيب ب 20% الاسيتو الانيتريل مع خلات الأمونيوم 10 ملم (pH 4.0). تحسين أثر المعلمات: ستارة الغاز (لئيم): 10-50، درجة الحرارة: 0-600 درجة مئوية، 1 تدفق الغاز (GS1): 0-50، 2 تدفق الغاز (GS2): 0-50، كوليسيونالي المنشط الانفصال (CAD): منخفض-متوسط-مرتفع، وأيون رذاذ الجهد (ق. أ): 4000-5500 لكل نوكليوزيد الحمض النووي باستخدام دليل التحسين الكمي ميزة في البرنامج في وضع الاتحاد الدولي للسيارات (تحليل تدفق الحقن).
  4. لفصل كل ثمانية نوكليوسدس الحمض النووي، نفذ اللوني السائل باستخدام التدرج التالي: المذيبات 0% ب (0-2 دقيقة)، 0-20% المذيب ب (2-5 دقائق)، 20-60 ٪ مذيب ب (5-9 دقيقة)، 60-0% المذيب ب (9-10 دقيقة) وحجته ثم مع المذيب A لمدة 5 دقائق بمعدل تدفق 0.3 مل/دقيقة على عمود C18 (حجم الجسيمات: 5 ميكرومتر، "حجم المسام": 120).
  5. استخدام معلمات MS/MS الأمثل (الخطوة 3، 2 و 3-3) مقترنة بالتدرج اللوني السائل المذكور أعلاه (الخطوة 3، 4)، تحديد الرد الخطي، والحد من الكشف عن (اللد)، والحد الأدنى للقياس الكمي (للوق) باستخدام تمييع شقين المسلسل خليط القياسية 100 ميكرومتر، يحتوي على جميع نوكليوسدس ثمانية. رسم المنحنيات القياسية لكل ثمانية نوكليوسدس الحمض النووي.
  6. كشف وتحديد جميع نوكليوسدس، وبخاصة تعديل سيتوسينيس، أنتجت في الخطوة 2، 4 باستخدام أسلوب LC-MS/MS والمنحنيات القياسية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعديل الديناميكي ل 5mC في الحمض النووي من ديوكسيجيناسيس تيت-الأسرة تلعب أدواراً هامة في الأنظمة النسخي جينية. كثيرا ما يتم تحور ديوكسيجيناسي TET2 في الأورام الخبيثة المكونة للدم متنوعة12. للتحقيق في دور إنزيم TET2 في التطور الطبيعي والمرض، ونحن قد المستنسخة مجالها حفازة نشطة الحد الأدنى دون أي علامة تقارب إلى ناقل pDEST1422. وأنتج ديوكسيجيناسي TET2 معلم ∼5 في المائة من مجموع البروتين للذوبان بتحليل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي في البكتيريا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطفرات في الجينات TET2 بعض التغييرات الوراثية المكتشفة الأكثر شيوعاً في المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة المكونة للدم المتنوعة. حتى الآن مئات من الطفرات TET2 المختلفة، التي تشمل هراء وتحول الإطار والطفرات مغلطه، قد حددت في12من المرضى. المرضى الذين يعانون من الطفرات TET2 إظهار مستويات منخفضة من 5hmC الجينوم في نخاع العظام مقارنة بتلك التي مع wt TET214. وقد لخص TET2 متحولة تدق في التجارب آثار هذه الطفرات على مستويات 5hmC في الخلايا ترانسفيكتيد

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفين لها أية مصالح مالية تعلن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومولت هذه البحوث "وزارة الدفاع الأمريكية" في شكل فكرة جائزة (W81XWH-13-1-0174)، وفقر الدم اللاتنسجي ومنحة من مؤسسة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، ومنحة أومرب للمؤلف م. م. أشكر جايسوال هامور وبهار سوبهراديب لاستنساخ الأولية من TET2 في ناقلات pDEST14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
هيبسكربوسينثFH31182
كبريتات الحديد (II) هيبتاهيدراتسيجما ألدريتشF8633
& ألفا حمض كيتوجلوتاريك (2-حمض أوكسوجلوتاريك)سيجما ألدريتشK1750
حمض الأسكوربيكسيجما ألدريتشA4544
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك حمض ثنائي الصوديوم ثنائي الهيدراتسيجما ألدريتشE5134
أسيتات الأمونيومسيجما ألدريتشA1542
أسيتونيتريلفيشر Scientific75-05-8
HPLC درجة المياهفيشر Scientific7732-18-5
أوليغو نظيفة ومكثفةZymo ResearchD4061
DNAse Iنيو إنجلاند BiolabsM0303S
S1 NucleaseThermo ScientificENO321
CIAP (الفوسفاتيز القلوي المعوي في العجل) نيوإنجلاند بيولابسM0290S
LB وسائل الإعلامAffymetrixJ75852
IPTGCarbosynthEI05931
MES [2- (N-Morpholino) حمض الإيثان سلفونيك مونوهيدرات]CarbosynthFM37015
كلوريد الصوديومفيشر Scientific7647-14-5
GlycerolSigma-AldrichG7893
SP SepharoseFisher Scientific45-002-934
2'-Deoxy-5-methylcytidineTCID3610
2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidineTCID4220
2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, saltBerry & امبير; شركاهPY 7593
5-Formyl-2'-deoxycytidineBerry & الشركاءPY 7589
2'-DeoxycytidineBerry & AssociatesPY 7216
2'-DeoxyadenosineCarbosynthND04011
2'-DeoxyguanosineCarbosynthND06306
2'-DeoxythymidineVWR Life Science97061-764
Gateway technologyThermo Fisher11801016
Beckman Allegra X-15R أجهزة الطرد المركزي  بيكمان كولتر392932
سونيك ديسمبراتور 550فيشر ساينتفيكXL2020
& Auml ؛ نظام KTA FPLCPharmacia (GE Healthcare)18116468
FreeZone 4.5 نظام تجميد جافLabconco7750020
Zymo Oligo أعمدة تنقية   ؛Zymo ResearchD4061
BDS Hypersil C18 العمودKeystone Scientific, INC105-46-3
3200 Q-Trap مطياف الكتلةAB Sciex
HPLC Shimadzu HPLC 
XK16 / 20 FPLC عمودالصيدلة (GE Healthcare)28988937

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
  2. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341, 1237905(2013).
  3. Guo, J. U., et al. Distribution, recognition and regulation of non-CpG methylation in the adult mammalian brain. Nature neuroscience. 17, 215-222 (2014).
  4. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature genetics. 33, 245-254 (2003).
  5. Schultz, M. D., et al. Human body epigenome maps reveal noncanonical DNA methylation variation. Nature. 523, 212-216 (2015).
  6. Bonasio, R., Tu, S., Reinberg, D. Molecular signals of epigenetic states. Science. 330, 612-616 (2010).
  7. Feng, S., Jacobsen, S. E., Reik, W. Epigenetic reprogramming in plant and animal development. Science. 330, 622-627 (2010).
  8. Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, 425-432 (2007).
  9. Iyer, L. M., Tahiliani, M., Rao, A., Aravind, L. Prediction of novel families of enzymes involved in oxidative and other complex modifications of bases in nucleic acids. Cell Cycle. 8, 1698-1710 (2009).
  10. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
  11. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333, 1303-1307 (2011).
  12. Ponnaluri, V. K., Maciejewski, J. P., Mukherji, M. A mechanistic overview of TET-mediated 5-methylcytosine oxidation. Biochemical and biophysical research communications. 436, 115-120 (2013).
  13. Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. Distributive Processing by the Iron(II)/alpha-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases. Journal of the American Chemical Society. 138, 9345-9348 (2016).
  14. Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
  15. Langemeijer, S. M., et al. Acquired mutations in TET2 are common in myelodysplastic syndromes. Nat Genet. 41, 838-842 (2009).
  16. Smith, A. E., et al. Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value. Blood. 116, 3923-3932 (2010).
  17. Moran-Crusio, K., et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).
  18. Quivoron, C., et al. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis. Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).
  19. Li, Z., et al. Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies. Blood. 118, 4509-4518 (2011).
  20. Ko, M., et al. Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).
  21. Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155, 1545-1555 (2013).
  22. Jaiswal, M., et al. Convenient expression, purification and quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based analysis of TET2 5-methylcytosine demethylase. Protein expression and purification. 132, 143-151 (2017).
  23. Hu, L., et al. Structural insight into substrate preference for TET-mediated oxidation. Nature. 527, 118-122 (2015).
  24. Mukherji, M., et al. Structure-function analysis of phytanoyl-CoA 2-hydroxylase mutations causing Refsum's disease. Hum Mol Genet. 10, 1971-1982 (2001).
  25. Mukherji, M., et al. Chemical co-substrate rescue of phytanoyl-Co A 2-hydroxylase (PAHX) mutants causing adult Refsum's disease. Chem Comm. , 972-973 (2001).
  26. Mukherji, M., Kershaw, N. J., Schofield, C. J., Wierzbicki, A. S., Lloyd, M. D. Utilization of sterol carrier protein-2 by phytanoyl-CoA 2-hydroxylase in the peroxisomal alpha oxidation of phytanic acid. Chem Biol. 9, 597-605 (2002).
  27. Zhang, T., et al. TET2 expression is a potential prognostic and predictive biomarker in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Journal of cellular physiology. , (2017).
  28. Montagner, S., et al. TET2 Regulates Mast Cell Differentiation and Proliferation through Catalytic and Non-catalytic Activities. Cell Rep. 15, 1566-1579 (2016).
  29. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500, 222-226 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TET2 PurificationCation Exchange ChromatographyLC MS MS AssayDNA Base QuantificationEnzyme Activity AnalysisBacterial Expression SystemProtein IsolationNucleoside DetectionEpigenetic DemethylationModified Cytosine Bases

Related Articles