تنقية القنوات الأيونية في كثير من الأحيان تحديا، ولكن متى تحقق، فإنه من المحتمل أن يسمح التحقيقات في المختبر لوظائف وهياكل القنوات. هنا، يمكننا وصف إجراءات تدريجية للتعبير وتنقية البروتينات بيستروفين الثدييات، وعائلة من Ca2 +-تنشيط قنوات Cl– .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بترميز الجينوم البشري بارالوجس بيستروفين أربعة، هي: BEST1، BEST2، BEST3، و BEST4. هو BEST1، مرمزة بواسطة الجين BEST1 ، Ca2 +-تنشيط Cl– قناة (كاكك) أعرب غالباً في ظهارة صباغ الشبكية (RPE). أهمية BEST1 الفيزيولوجية والمرضية وهو أبرز حقيقة أن ما يزيد على 200 الطفرات المتميزة في الجينات BEST1 ربطت وراثيا بطائفة اضطرابات التنكسية الشبكية خمسة على الأقل، مثل فيتيليفورم أفضل حثل القرنية (المرض أفضل). ولذلك، فهم الفيزياء حيوية القنوات بيستروفين على مستوى جزيء واحد يحمل أهمية كبيرة. ومع ذلك، الحصول على قنوات أيون الثدييات المنقي غالباً مهمة صعبة. هنا، نحن تقرير وضع بروتوكول للتعبير عن البروتينات بيستروفين الثدييات مع نظام نقل الجينات باكولوفيروس باكمام وعلى تنقية بتقارب وحجم الاستبعاد اللوني. تنقية البروتينات لديها القدرة على الاستفادة منها في التحليلات الوظيفية والهيكلية اللاحقة، مثل تسجيل الكهربية في دهن بيلاييرس وعلم البلورات. الأهم من ذلك، يمكن تكييفها لدراسة وظائف وهياكل أخرى قنوات أيون هذا الأنبوب.
المقدمة
بيستروفينس عائلة من قنوات أيون المحافظة عليها من خلال الأنواع المختلفة من البكتيريا إلى البشر1. في البشر، وترميز الجينات BEST1 ، الموجود على كروموسوم 11q12.3، بروتين غشائي بيستروفين-1 (BEST1) التي يتم التعبير عنها في الغالب في غشاء خلايا ظهارة (RPE) صباغ الشبكية من عيون2،3 باسولاتيرال ،4. تتألف من الأحماض الأمينية 585، 350 ~ الأولى التي هي المحافظة جداً بين الأنواع وتحتوي على منطقتها transmembrane، BEST1 بمثابة كاكك في البشر1،،من56. وعلاوة على ذلك، ه....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إنتاج باكمام التعبير باكولوفيروسيس
- إدراج الترميز تسلسل البروتين المطلوب بيستروفين الثدييات في شماعة باكمام ناقلات18 مع تسلسل اعتراف بحوزتي فيروس أحفر التبغ (TEV)، متبوعاً التجارة والنقل-10 × صاحب العلامة في ج-محطة البروتين.
- عابر ترانسفيكت بلازميد التعبير في مادة لاصقة HEK293 الخلايا19،،من2021،،من2223. تحقق من التعبير عن البروتين بروتينات فلورية خضراء-الانصهار تحت مجهر فلوري مع 10 X أو 20 X التكبير ومصدر إثارة نانومتر 488 مرشح انبعاثات 510 نانومتر (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كثافة fluorescence في عابر transfected الخلايا HEK293 لاصقة (الشكل 1A) مؤشر جيد لمستوى التعبير البروتين المتوقعة في تعليق HEK293 و الخلايا (الشكل 1B). إذا ليس جيدا عن البروتين المستهدف أو هو سوء المترجمة في الخلايا HEK293 بعد تعداء عابرة، فمن المستحسن أن تنظر في تعديل بنية التعبير (على سبيل المثال-أو تغيير موضع العلامة بروتينات فلورية خضراء أو صنع الطفرات/ترونكيشنز على البروتين المستهدف). صغير و HEK293 تعليق الثقافات (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويصف هذا البروتوكول خط أنابيب مفيدة للتعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات التي ستستخدم مستقبلا في المختبر التحاليل. بينما الجهاز فبلك مطلوب لحجم الاستبعاد اللوني، مضخة الحقن كافية لجميع خطوات التقارب اللوني بما في ذلك ملزم، والغسيل والتينج. عند استخدام مضخة الحقن إلى حلول دفع (في حقنه) عن طريق عمود، من الضروري أن تقوم عليها الجانب الربيع لتجنب دفع فقاعات الهواء داخل العمود. إذا كان الفعل نقاء البروتين بعد التقارب اللوني كافية للتجارب اللاحقة، يمكن إهماله حجم الاستبعاد اللوني حيث أن جهاز فبلك قد لا يكون مط.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا المشروع من المعاهد الوطنية للصحة منح EY025290، GM127652، وجامعة روتشستر بدء التمويل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| هيبس | فيشر العلمي | AC327265000 | |
| كلوريد الصوديوم | فيشر | AC446212500 | |
| الجلسرين | فيشر العلمي | G33-500 | |
| إيميدازول | فيشر | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | فيشر العلمي | AA4058704 | |
| أبروتينين | فيشر AAJ63039MA | ||
| ليوببتين | فيشر Scientific | AAJ61188MB | |
| بيبستاتين فيشر | AAJ20037MB | العلمي | |
| فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد | فيشر | AC215740050 | |
| DDM سول الصف | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop الطيف الضوئي | ThermoFisher | ND-2000 | |
| الخالط عالي الضغط | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap العمود | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 العمود | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 وحدات تصفية الطرد المركزي | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 وحدات تصفية الطرد المركزي | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 وحدات تصفية الطرد المركزي | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 أجهزة الطرد المركزي Beckman | Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| جل Mini-PROTEAN مسبقة الصب | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| كاشف تعداء PolyJet | SignaGen | SL100688 | |
| pEG ناقل BacMam | تم الحصول عليه من مختبر Gouaux في معهد Vollum |
المراجع
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
