يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس كمي للأنواع الأكسجين التفاعلية والنمط الظاهري الافرازية المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا الليفية البشرية العادية أثناء الشيخوخة التي يسببها السرطاني

7.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57890

⸱

أغسطس 12, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 2Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

لقد ثبت روس داخل الخلايا تلعب دوراً هاما في تنظيم دورات تعريفية للشيخوخة الخلوية. هنا، يمكننا وصف مقايسة حساسة لقياس مستويات روس أثناء الشيخوخة الخلوية. نحن نقدم أيضا بروتوكولات لتقييم المرتبطة بالشيخوخة الافرازية النمط الظاهري، الذي يقال أن تساهم مختلف الاختلالات المرتبطة بالسن.

الملخص

الشيخوخة الخلوية اعتبرت حالة من النمو الذي لا رجعة فيه القبض عند استنفاد القدرات التكاثري أو التعرض للضغوط المختلفة. الدراسات التي أجريت مؤخرا قد مددت دور الشيخوخة الخلوية لمختلف العمليات الفيزيولوجية، بما في ذلك التنمية والتئام والترصد المناعي والخلل في الأنسجة المرتبطة بالسن. على الرغم من دورة الخلية اعتقال سمة مميزة حرجة للشيخوخة الخلوية، أثبتت أيضا إنتاج أنواع (روس) زيادة أكسجين تفاعلية داخل الخلايا تلعب دوراً هاما في تنظيم دورات تعريفية للشيخوخة الخلوية. وبالإضافة إلى ذلك، كشفت الدراسات الحديثة أن خلايا مسن يحمل الأنشطة paracrine قوية على الخلايا والأنسجة من خلال المرتبطة بالشيخوخة افرازية النمط الظاهري (ساسب) المجاورة. الزيادة الحادة في المصالح فيما يتعلق باستراتيجيات علاجية ضد الشيخوخة الخلوية تشدد على الحاجة إلى فهم دقيق لآليات الشيخوخة، بما في ذلك روس داخل الخلايا وساسب. هنا، يمكننا وصف بروتوكولات لتقييم كمي داخل الخلايا روس المستويات أثناء الشيخوخة الخلوية التي يسببها رأس ح استخدام صبغة الفلورسنت المراعية لروس والتدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم التقنيات الحساسة لتحليل إدخال التعبير مرناً وإفراز عوامل ساسب. يمكن تطبيق هذه البروتوكولات إلى النماذج الشيخوخة الخلوية المختلفة.

المقدمة

أكثر من 50 عاماً، هايفليك ومورهيد كشفت أن الخلايا الطبيعية أدخل النمو لا رجعة فيه القبض عند استنفاد إمكاناتها التكاثري بعد عدد معين من الانقسامات الخلية1. يعرف الآن باسم الشيخوخة ريبليكاتيفي هذه الظاهرة ويعتقد ترتبط بشدة بالشيخوخة العضوي2. على الرغم من التدهور التدريجي التيلومير يعتبر سببا رئيسيا للشيخوخة replicative، تؤكد الخلوية المختلفة، مثل تلف الحمض النووي والتنشيط النمطان والأكسدة، قد أبلغت إلى الحث على نوع آخر من الشيخوخة الخلوية ودعا "الشيخوخة المبكرة" أو "الشيخوخة الناجمة عن الإجهاد". من المثير للاهتمام، الشيخوخة المبكرة يلعب دوراً ورم قمعية قوية عند تفعيل المسرطنة مثل رأس ح وبراف. دراسات نماذج الماوس والأنسجة البشرية قد أنتجت أدلة قوية على أن المؤشرات الحيوية للخلية الشيخوخة كانت موجودة أساسا في الآفات بريماليجنانت حيث يتم تنشيط النمطان Ras وبراف لكن تتضاءل في الأمراض السرطانية الخبيثة التي وضعت من هذه الآفات3،،من45. تتجاوز دورها في الشيخوخة وقمع الورم، أظهرت الشيخوخة الخلوية في دراسات سابقة أن تلعب دوراً في العمليات الفسيولوجية المختلفة، بما في ذلك التئام وإصلاح الأنسجة، ومراقبة محصنة والتنمية الجنينية6.

على الرغم من أن تم القبض على النمو درست على نطاق واسع كسمة مميزة للشيخوخة الخلوية7، تقترح مجموعة كبيرة من الأدلة أن الأنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (روس) يسهم أيضا في الشيخوخة الخلوية8. الارتقاء بمستويات روس خلال مختلف أنواع الشيخوخة الخلوية، بما في ذلك الشيخوخة ريبليكاتيفي والشيخوخة التي يسببها السرطاني (منظمة المؤتمر الإسلامي)، وذكر أصلاً قبل عقود9،10. أكثر مباشرة، يدفع المعاملة الخارجية مع جرعة المقاسة من ح2س2 الشيخوخة11،12. كما يسبب تثبيط الإنزيمات الكسح روس، مثل SOD1، الشيخوخة المبكرة13. في المقابل، تدني الظروف المحيطة الأكسجين وزيادة روس الكسح تأخير ظهور الشيخوخة10،،من1415. لا شك في أن تشير هذه النتائج إلى أن روس هي مهمة الوسطاء أو محددات تعريفية الشيخوخة الخلوية. ومع ذلك، كيف روس يسهم في استحثاث الشيخوخة الخلوية وكيف روس مستويات مرتفعة خلال الشيخوخة الخلوية تتطلب مزيدا من التحقيق.

وأظهرت الدراسات الأخيرة أن مسن الخلايا ذات الأنشطة paracrine قوية على الخلايا والأنسجة من خلال16،ساسب17المجاورة. في الأنسجة، والذين تتراوح أعمارهم بين تعزيز مسن خلايا الأنسجة المرتبطة بالسن الاختلالات الوظيفية عن طريق مسارات كثيرة من خلال ساسب علاوة استنفاد الخلايا التكاثري المتمتعة بالحكم الذاتي. Proinflammatory عوامل مختلفة، مثل إيل-6، إيل-8, TGFβ، ومصفوفة ميتالوبروتيناسيس (يتولى)، يفرز من خلايا مسن، تتسبب في اختلال الأنسجة المرتبطة بالسن من خلال الأضرار بالتوازن الأنسجة، تدمير الهيكل، والأنسجة الشيخوخة من الخلايا المجاورة، والتهاب العقيمة18،19. ومع ذلك، وفقا يمكن آثار مفيدة تبعاً لسياق البيولوجية. وباﻹضافة إلى ذلك، طبيعة وفقا هيتيروجينيتيك يعتمد على نوع خلية مسن ومرحلة الخلية، وإذ تشدد على الحاجة إلى مزيد من البحوث19.

هنا، يمكننا وصف الأساليب المستندة إلى الخلوي السريع والحساسة لتقييم مستويات روس داخل الخلايا أثناء أبحر. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عرض أساليب لتحليل العوامل ساسب استخدام الكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR) وإليزا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-حمل السرطاني الناجم عن الشيخوخة

  1. إعداد ح-لفي RasV12
    1. معطف صحن الثقافة 100 ملم بإضافة 2 مل من 0.001 ٪ بولي-L-يسين/الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. إزالة الحل بولي-L-يسين باستخدام ماصة زجاجية متصل بفراغ وغسل الطبق الثقافة بإضافة 2 مل من 1 x PBS.
    3. لوحة 3 × 106 اكوتروبيك بوس-23 تغليف الخلايا في ثقافة المغلفة طبق مع تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين 1%/ستربتوميسين، والثقافة لهم عند 37 درجة مئوية في ثقافة أنسجة2 CO حاضنة لمد 1.
    4. وفي اليوم التالي ترانسفيكت 2 ميكروغرام من ببابي بورو-ح-RasV12 الحمض النووي جنبا إلى جنب مع التغليف للفيروس الحمض النووي (2 ميكروغرام من بجاج/pol و 0.25 ميكروغرام من بفسفج) استخدام كاشف تعداء لح 8 وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    5. قم بإزالة الوسائط تعداء وإضافة 8 مل وسائط جديدة.
    6. بعد 48 ساعة، جمع الوسائط التي تحتوي على الجسيمات الفيروسية وإزالة أي الحطام الخلوية بالطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق.
    7. تصفية وسائل الإعلام التي تحتوي على فيروس ح-رأس مع عامل تصفية حقنه 0.45 ميكرومتر.
      ملاحظة: تجنب أي تجميد وذوبان الجليد من supernatants الفيروس لعدوى فيروسية تتسم بكفاءة. للحصول على أفضل كفاءة، استخدم أحد فيروسات التي تم حصادها في نفس يوم الإصابة.
  2. إصابة 38 أي الليفية البشرية العادية بلفي ح-RasV12
    1. لوحة 5 × 104 38 أي خلايا في صحن ثقافة 60 ملم مع دميم التي تحتوي على 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين د 1 قبل الحصاد لفي ح-RasV12، والثقافة منهم لمدة يوم واحد في 37 درجة مئوية.
    2. إزالة متوسط النمو في اليوم التالي وإضافة 1 مل ح-RasV12 لفي وسائل الإعلام. إضافة 1 مل إضافية من متوسط النمو الذي يحتوي على 2 ميليلتر لحل بوليبريني الأسهم (8 ملغ/مل بالماء المقطر). احتضان العينة لمدة يوم واحد في هوميديفيد 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة استنبات الأنسجة.
    3. إزالة الخليط لفي RasV12 ح ح 24 في وقت لاحق وتغسل الخلايا 2 x مع 1 x برنامج تلفزيوني. إضافة المتوسطة النمو وعلاج الخلايا مع 2 ميكروغرام/مل من بوروميسين لمدة يومين في هوميديفيد 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة استنبات الأنسجة.
    4. بعد 2 د بوروميسين انتقاء، إزالة المتوسطة النمو، وتغسل الخلايا 2 x مع 1 x برنامج تلفزيوني. إضافة المتوسطة النمو والثقافة الخلايا في هوميديفيد 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة حتى نقطة الوقت المشار إليه (انظر الشكل 1A الرسم تخطيطي).

2-رصد الشيخوخة عن طريق تلطيخ المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي

  1. إعداد الحلول الأسهم التالية.
    1. إعداد 20 ملغ/مل من 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-د-جالاكتوبيرانوسيدي (X-غال) في ثنائي ميثيل ميثلامين (DMF). مخزن الحل عند-20 درجة مئوية.
    2. إعداد المخزن مؤقت فوسفات صوديوم حمض الستريك/بتذويب ز 3.377 نا2هبو4.7H2س (126 ملم) وز 0.708 حمض الستريك (36.8 ملم) في 100 مل ماء المقطر. تعديل درجة الحموضة إلى 6.0، إذا لزم الأمر.
    3. إعداد فيروسيانيد البوتاسيوم 0.5 متر. مخزن الحل في الظلام في 4 درجات مئوية.
    4. تحضير سيانيد البوتاسيوم 0.5 متر. مخزن الحل في الظلام في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: الرقم الهيدروجيني للحل المصبوغة المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي (سا β غال) أمر بالغ الأهمية لنتائج دقيقة.
  2. جعل طازجة سا β-غال المصبوغة حلاً بتمييع الحل الأسهم تحتوي على 150 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم مجكل2، فيروسيانيد البوتاسيوم 5 مم، سيانيد البوتاسيوم 5 مم، العازلة فوسفات الصوديوم حمض الستريك/20% (v/v)، و 1 ملغ/مل من X-غال.
  3. قم بإزالة وسائط الثقافة وتغسل الخلايا 1 x مع 1 x برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا مع 3% فورمالدهايد لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يجب استخدام الخلايا التي هي غير المصابين لفي كعنصر سلبي. ينبغي أن تواصل الخلايا مصابة التحكم تكون باساجيد للحفاظ على مركزها المتكاثرة.
  4. إزالة تثبيت الحل من الخلايا وغسلها ببرنامج تلفزيوني 1 x. إضافة طازج 1 x سا β-غال المصبوغة الحل (1.5 مل في صحن ثقافة 60 ملم). ختم الطبق مع فيلم الكيروسين لمنع تجفيف واحتضان من أجل 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. وبدلاً من ذلك، احتضان الأطباق معا في غرفة رطوبة.
    ملاحظة: ينبغي التخلص الحل مثبت يحتوي على 3% فورمالدهايد من كنفايات خطرة. حاضنة دون CO2 من المستصوب، لمنع التغييرات درجة الحموضة أثناء الاحتضان.
  5. التحقق من حالة الخلايا تحت مجهر المصبوغة اليوم التالي؛ سا β-غال-إيجابية الخلايا تظهر زرقاء في منطقة بيرينوكلير.
    ملاحظة: تظهر الخلايا التحكم المتكاثرة تردد المنخفض من الخلايا β-غال-إيجابية SA. إذا كان تلطيخ خفيفة جداً، يستمر في الحضانة لفترة أطول قليلاً (انظر الشكل 1B للأمثلة التمثيلية).
  6. الحصول على صورة المصبوغة غال β SA مع كاميرا CCD باستخدام 10 X أو عدسة الهدف أكبر. التقاط عدد كاف من الصور لحساب النسبة المئوية المصبوغة (> 200 الخلايا).
  7. حساب النسبة المئوية للخلايا β-غال-الملون SA بالتحديد الكمي لعدد الخلايا β-غال-إيجابية SA بالنسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا.
    ملاحظة: سا β-غال تلطيخ ينبغي تكرار بشكل مستقل x 3 على الأقل، وقيم المتوسط الحسابي أن تحسب بناء على نتائج تجارب نسخ متماثل (الشكل 1 ج). كثافة الخلية المناسبة أمر حاسم للتجربة المصبوغة غال β SA. يمكن أن تتداخل مع التغيير إلى مورفولوجيا المرتبطة بالشيخوخة كونفلوينسي عالية وحمل إشارة إيجابية كاذبة في الخلايا التحكم.

3-التحديد الكمي الاستقراء أنواع أكسجين تفاعلية أثناء الشيخوخة التي يسببها رأس ح

  1. طبق لوحة 2 × 105 38 أي الخلايا في ثقافة 60 ملم واستفزاز الشيخوخة التي يسببها رأس ح كما هو موضح في الخطوة 1.
    ملاحظة: يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أنواع أخرى من النماذج الشيخوخة الخلوية.
  2. إزالة متوسط النمو في النقطة الزمنية المشار إليها (2 أو 4 أو 6 أيام)، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x. فصل الخلايا بمعاملتها مع 1 مل من محلول التربسين/يدتا 0.05% وإلغاء تنشيط التربسين بإضافة 1 مل متوسط النمو الذي يحتوي على 10% FBS. تحديد عدد الخلايا.
  3. نقل الخلايا5 1 × 10 إلى 15 مل أنبوب مخروطي، وجمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق.
  4. إعداد جديد 2 ', 7'-ديتشلوروفلوريسسين اسيتات (المخصوم دا) وسائط الإعلام المصبوغة بإضافة 50 ميليلتر من 10 ملم المخصوم دا إلى 10 مل من الثقافة المتوسطة (تركيز العامل دا منتدى التعاون الإنمائي هو 50 ميكرومتر).
    ملاحظة: دا DCF حساسة للضوء. وينبغي تجنب التعرض للضوء. ويمكن تعديل تركيز المخصوم دا والوقت المصبوغة تبعاً لنوع الخلية.
  5. إزالة متوسط النمو بعناية من أنبوبة مخروطية الشكل 15 مل وإضافة 1 مل متوسطة المصبوغة المخصوم دا الطازجة. ريسوسبيند بيليه الخلية واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام بعناية. وتشمل عينة غير الملون كعنصر تحكم المصبوغة سلبية.
    ملاحظة: ينبغي إعداد تكاثر الخلايا غير ملطخة المخصوم دا كعنصر سلبي.
  6. جمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق وغسلها x 1 مع 2 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. ريسوسبيند الخلايا مع 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني ونقل العينة إلى الخلية المناسبة تنشيط fluorescence فرز أنابيب (نظام مراقبة الأصول الميدانية).
  7. قياس 2 '، 7' ديتشلوروديهيدروفلوريسسين اسيتات (المخصوم دا) الأسفار إشارة استخدام cytometer تدفق مجهزة بمصدر ليزر مناسبة. تثير هذه العينات مع ليزر أزرق (488 نانومتر) وكشف fluorescence المنبعثة مع 530 ± 30 نانومتر كاشف (فيتك) باستخدام مقياس لوغاريتمي.
    1. تحليل خلايا المراقبة السلبية غير الملون أولاً. في مؤامرة نقطة للأمام مبعثر (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC)، حدد الخلايا الحية باستخدام أداة النابضة والقضاء على الخلايا الميتة والحطام الخلوية.
      ملاحظة: تغيير حجم الخلية بعناية رصداً في مؤامرة دوت من منتدى التعاون الأمني مقابل التعاون بين بلدان الجنوب. إذا كان إلى حد كبير هو زيادة حجم الخلايا مسن، يجب مقارنة كثافة المخصوم دا في السكان الخلية من نفس الحجم بعد النابضة في مؤامرة دوت من منتدى التعاون الأمني مقابل التعاون بين بلدان الجنوب.
    2. في رسم بياني واحد-المعلمة عرض المخصوم دا (488 نانومتر) الأسفار بمقياس لوغاريتمي ل العاشر-المحور وعدد الأحداث (عدد الخلايا) بمقياس خطي من y-المحور، ضبط الجهد من 488 نانومتر الليزر مكان الذروة من الخلايا غير الملون على الحافة اليسرى.
    3. تحليل DCF-دا الملون العينات وتسجيل الأحداث 10,000 على الأقل لكل عينة. الحصول على قيمة الأسفار يعني كل عينة باستخدام برمجيات تحليل محدد ل cytometer تدفق.
      ملاحظة: القياسات روس ينبغي تكرار بشكل مستقل على الأقل 3 س، وقيم يعني أن تحسب من هذه النتائج. وتظهر نتائج الشيخوخة التي يسببها رأس ح الممثل في الشكل 2.

4-إيل الكمي-6 والتعبير مرناً إيل-8 المرتبطة بالشيخوخة الافرازية النمط الظاهري تحليل استخدام البلمرة المتسلسل الوقت الحقيقي

  1. مجموع إعداد الجيش الملكي النيبالي
    1. لوحة 3 × 105 38 أي الخلايا في ثقافة 100 مم طبق في دميم التي تحتوي على 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين، والثقافة لهم عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة يوم واحد. إعداد الثقافات المكررة لكل نقطة في الوقت.
    2. حمل الشيخوخة بإصابة الخلايا بلفي ح-RasV12 كما هو موضح في الخطوة 1.
    3. في يوم واحد قبل موسم الحصاد، تغسل الخلايا 2 x مع 1 x برنامج تلفزيوني، وأضف 3 مل دميم دون FBS.
      ملاحظة: تتم هذه الخطوة لإنتاج مكيفة الوسيلة المستخدمة لإليزا كما هو موضح في الخطوة 5. قد يحرض المجاعة المصل تعبيراً عن مرناس إيل-6، وايل-8 في بعض الخلايا الحساسة. وهكذا، إيل-6 والتعبير مرناً إيل-8 في الخلايا المستزرعة مع أو بدون المجاعة المصل ينبغي مقارنة في البداية. إذا كان يدفع الجوع المصل تغييرات كبيرة في التعبير عن إيل-6 أو 8 إيل مرناً، ينبغي أن تعد مجموع الجيش الملكي النيبالي قبكر والمتوسطة مكيفة لإليزا بشكل منفصل.
    4. جمع المتوسطة مكيفة من كل عينة 24 ساعة في وقت لاحق وتخزين المتوسطة في-80 درجة مئوية لإليزا.
    5. فصل الخلايا بمعاملتها مع 1 مل من محلول التربسين/يدتا 0.05% وإلغاء تنشيط التربسين بإضافة 1 مل متوسط النمو الذي يحتوي على 10% FBS. تحديد عدد الخلايا لتطبيع أليسا النتائج كما هو موضح في الخطوة 5. حصاد الخلايا في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل بالطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق.
    6. إزالة المتوسطة بالشفط لطيف وإضافة 1 مل من محلول استخراج الحمض النووي الريبي. ثم، دوامة أنبوب ميكروسينتريفوجي بقوة لمدة 15 ثانية. بعد ذلك، أضف 200 ميليلتر من كلوروفورم وبقوة دوامة الخليط مرة أخرى 15 إضافية s.
    7. الطرد المركزي أنابيب العينة في س 17,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. بعد ذلك، نقل بعناية في المرحلة العليا لأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة.
      ملاحظة: في الطور البيني والمرحلة العضوية أقل ينبغي أن لا يكون الانزعاج أثناء نقل المرحلة العليا إلى أنبوب جديد.
    8. إضافة 400 ميليلتر من الايزوبروبانول يعجل بالجيش الملكي النيبالي ومزجها جيدا بانعكاس لطيف. ثم احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    9. الطرد المركزي الأنبوب في س 17,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. وبعد ذلك، تجاهل المادة طافية، مع الحرص على الاحتفاظ ببيليه الجيش الملكي النيبالي. أغسل الجيش الملكي النيبالي بإضافة 1 مل إيثانول 75% وعكس الأنبوب x 2 – 3. الطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 17,000 س ز في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية.
    10. الجاف لبيليه الجيش الملكي النيبالي في درجة حرارة الغرفة وحل الجيش الملكي النيبالي في 50 ميليلتر من ثنائي إثيل بيروكاربوناتي (ديبك)-يعامل الماء المقطر. استخدام 1 ميليلتر من حل الجيش الملكي النيبالي، قياس تركيز الحمض النووي الريبي الإجمالي مع جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: أوفيردريينج سوف يقلل قابلية الذوبان من الجيش الملكي النيبالي؛ ولذلك، تجنب overdrying الجيش الملكي النيبالي.
  2. إعداد كدنا
    1. إعداد الخليط رد فعل عكسي-النسخ لكل عينة بإضافة ما يلي إلى أنبوب PCR رقيقة الجدران: 2 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي (ضبط حجم الصوت إلى 10 ميليلتر مع المياه خالية من رناسي)، 2 ميليلتر من 10 × RT العازلة، 1 ميليلتر من التمهيدي عشوائية (50 بمول)، ميليلتر 0.8 من 25 x dNTP ميكس (100 مم)، 1 ميليلتر من مملف عكس المنتسخة (50 ش/ميليلتر)، و 5.2 ميليلتر من رناسي خالية المياه.
    2. إعداد البرنامج النسخ عكس رد فعل على cycler الحرارية مع الشروط التالية: 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة و 95 درجة مئوية لأدنى 5 مكان بكر أنابيب في cycler الحرارية وبدء البرنامج.
  3. في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل
    1. إعداد مزيج PCR الرئيسية في الوقت الحقيقي لجميع ردود الفعل. خليط رد فعل لكل عينة على النحو التالي: 25 ميليلتر من 2 x ميكس ماجستير PCR الوقت الحقيقي، ميليلتر 1 كل من الإشعال إلى الأمام وعكس لايل-6 أو 8 إيل، و 21 ميليلتر من الماء المقطر النقي جداً (الدناز ورناسي خالية). انظر الجدول 1.
      ملاحظة: إعداد الخليط تفاعل PCR الوقت الحقيقي لكل عينة تحتوي على كبسولة تفجير الجيش الملكي النيبالي أكتين كرقابة داخلية. يمكن أيضا استخدام جابده كرقابة داخلية للتطبيع.
    2. إضافة ميليلتر 48 من مزيج الرئيسي و 2 ميليلتر من المنتج 3-fold كدنا المخفف بالماء لكل بئر في صفيحة قبكر ضوئية 96-جيدا. أداء كل رد فعل في ثلاث نسخ. إعداد عنصر تحكم جيدا تحتوي على القالب كدنا كعنصر تحكم PCR.
    3. إعداد البرنامج تفاعل PCR في الوقت الحقيقي على cycler الحرارية بالشروط التالية: 10 دقيقة على 95 درجة مئوية، ودورات 40 of15 s عند 95 درجة مئوية (تمسخ)، و 1 دقيقة عند 60 درجة مئوية (الصلب وملحق).
    4. إجراء PCR الوقت الحقيقي وتسجيل قيمة عتبة دورة (CT) بعد انتهاء دورات PCR. حساب مستويات مرناً لايل-6 أو إيل-8 استخدام أسلوب-ΔΔCΤ 220.
      ملاحظة: يتم تحديد التغيير إضعاف النسبي في التعبير بعد تطبيع مستويات أكتين باستخدام الصيغة التالية:
      أمثال التغيير = 2-Δ (ΔCر)
      هنا،
      ΔCT = جر، إيل-6 أو 8 إيل-جر، أكتين؛ و
      Δ (ΔCT) = ΔCT، وحفز-ΔCر، التحكم.
    5. حساب قيمة المتوسط لكل عينة مكررة.
      ملاحظة: قبكر ينبغي أن تتكرر بشكل مستقل x 3 على الأقل، وقيم المتوسط الحسابي أن تحسب بناء على هذه النتائج. وتظهر نتائج الشيخوخة التي يسببها رأس ح الممثل في الشكل 3. قد يحرض المجاعة المصل التعبير عن مرناس إيل-6، وايل-8 في بعض الخلايا الحساسة. وهكذا، إيل-6 والتعبير مرناً إيل-8 في الخلايا المستزرعة مع أو بدون المجاعة المصل ينبغي مقارنة في البداية. إذا كان يدفع الجوع المصل تغييرات كبيرة في التعبير عن إيل-6 أو 8 إيل مرناً، ينبغي أن تعد مجموع الجيش الملكي النيبالي قبكر والمتوسطة مكيفة لإليزا بشكل منفصل.

5-قياس مستويات البروتينات يفرزها إيل-6، وايل-8 تحليل النمط الظاهري افرازية المرتبطة بالشيخوخة باستخدام ELISA

  1. حصاد ذوبان الجليد 3 مل المتوسطة مكيفة من مسن 38 أي الخلايا كما هو موضح في الخطوة 4. إزالة الحطام خلية بالطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق.
  2. التركيز المتوسط مكيفة 10 إضعاف بالطرد المركزي في 3,000 س ز ل 20 دقيقة باستخدام وحدة الطرد مركزي تصفية.
    ملاحظة: لا قد تتوقف تركيز المتوسطة مشروطة بالضرورة على نوع العينة.
  3. أداء أليسا استخدام 50 ميليلتر من كل عينة مركزة من المتوسطة مكيفة مع مجموعات 6 إيل وايل-8 أليسا المناسبة.
    ملاحظة: اختبار كل عينة في بئرين أليسا. نظراً لأن كل نقطة مرة تتكرر في الخطوة 4، هذا التحليل يسمح لنا برصد الاختلافات في مقايسة أليسا وتقنية إعداد عينة.
    1. لطلاء لوحة أليسا، تمييع إيل-6 أو جسم إيل-8 مع برنامج تلفزيوني x 1 إلى تركيز 0.5 ميكروغرام/مل لايل-6 أو 0.125 ميكروغرام/مل لايل-8. إضافة 100 ميليلتر من الأجسام المضادة المخفف لكل بئر من لوحة أليسا. ختم اللوحة مع صفيحة أليسا ختم الفيلم واحتضان دون المصافحة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    2. إزالة الحل جسم بالطموح. تغسل كل x 4 جيدا مع 300 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (0.05% 20 توين في برنامج تلفزيوني). إضافة 300 ميليلتر من المخزن المؤقت حظر (1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني) لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
    3. إزالة الحل حظر بالطموح. تغسل كل x 4 جيدا مع 300 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. إعداد معايير في إضعاف المخزن مؤقت (0.05% BSA توين-20 و 0.1% في برنامج تلفزيوني) أليسا متسلسل المخفف لإنشاء منحنى قياسي.
      ملاحظة: يتم التخفيف التسلسلي لايل-6 31.25 62.5، 125، 250، 500، 1,000 و 2,000 بيكوغرام/مل. هو إضعاف المسلسل لايل-8 2.34، 4.69، 9.38، 18.75، 37.5، 75 و 150 بيكوغرام/مل.
    4. إضافة 100 ميليلتر من الحل القياسية أو 100 ميليلتر من الحل العينة (50 ميليلتر من المتوسطة تتركز مع 50 ميليلتر من المخزن المؤقت لتمييع) لكل بئر. احتضان الآبار في درجة حرارة الغرفة ح 2.
    5. إزالة الحل القياسية أو العينة بالطموح. تغسل كل x 4 جيدا مع 300 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. تضعف جسم الكشف مع المخزن المؤقت تمييع لتركيز 0.1 ميكروغرام/مل لايل-6 أو 0.25 ميكروغرام/مل لايل-8. إضافة 100 ميليلتر من جسم المخفف كل بئر. احتضان الآبار في درجة حرارة الغرفة ح 2.
    6. إزالة الحل جسم بالطموح. تغسل كل x 4 جيدا مع 300 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. تمييع streptavidin-الفجل البيروكسيديز (HRP) في المخزن المؤقت لتمييع لتركيز 0.05 ميكروغرام/مل. إضافة 100 ميليلتر streptavidin-برنامج الصحة الإنجابية إلى حل كل بئر. احتضان الآبار في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    7. إزالة الحل جسم بالطموح. تغسل كل x 4 جيدا مع 300 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. إضافة 100 ميليلتر من 3، 3، 5، 5 '--تيتراميثيلبينزيديني (TMB) الركيزة الحل لكل بئر. احتضان الآبار في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح لوضع اللون. وقف رد الفعل بإضافة 100 ميليلتر لحل إيقاف HCl 1 م.
    8. قراءة امتصاص لكل بئر مع قارئ أليسا في 450 نانومتر.
    9. ارسم المنحنى القياسي للمعايير التي تم إنشاؤها. حساب تركيزات إيل-6، وايل-8 في المتوسط مكيفة وفقا للمنحنيات القياسية. ارسم النتائج بعد تطبيع لعدد الخلايا. حساب القيم الوسطية لعينات مكررة.
      ملاحظة: الساس ينبغي أن تتكرر بشكل مستقل x 3 على الأقل، وقيم المتوسط الحسابي أن تحسب بناء على هذه النتائج (الشكل 4).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويرد مثال للشيخوخة التي يسببها رأس ح في الشكل 1. التهاب الليفية البشرية العادية أي 38 بلفي ح-RasV12 الناجمة عن التغيرات المورفولوجية المثيرة (الشكل 1B). وباﻹضافة إلى ذلك، كما هو مبين في الشكل 1، زيد سا β-غال المصبوغة نشاط ملحوظ عند التعبير ح-RasV12. وأظهر أكثر من 70% الخلايا سا β-غال تلطيخ النشاط د 6 بعد الإصابة لفي ح-RasV12، مما يشير إلى أن تعبير عن RasV12 ح بنجاح يدفع الشيخوخة الخلوية في الخلايا أي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، وقد قدمنا أساليب لرصد مستويات روس داخل الخلايا أثناء الشيخوخة التي يسببها رأس ح في أي-38 الليفية البشرية العادية. يمكن أن تقاس كمياً باستخدام الكاشف نفاذية الخلية المخصوم دا مستويات روس داخل الخلايا في الخلايا الحية والتدفق الخلوي. عند الإقبال على الهاتف الخلوي، منتدى التعاون الإنمائي-دا ديسيتيلاتيد من استيراسيس داخل الخلايا، وتتأكسد في وقت لاحق، بروس لتشكيل الفلورية العالية 2 ', 7'--ديتشلوروفلوريسسين (DCF). ويمكن الكشف عن الأسفار المخصوم بالتدفق الخلوي باستخدام كاشف FL1 (الفلورية الخضراء). استخدام الأسلوب المصبوغة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل بمنحه من "مؤسسة البحوث الوطنية كوريا" (2015R1D1A1A01060839) (إلى كيم يون يونغ) ومنحة وطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله حكومة كوريا (مست) (لا 2016R1A2B2008887، رقم 2016R1A5A2007009) (أن يحرر جينو).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > الكواشف < / قوي >
بولي إل ليسينسيجما ألدريتشP2636
BOSC 23ATCCCRL-11269
FBSGIBCO16000-044
البنسلين / الستربتومايسينويلجينLS202-02
PBSHycloneSH30013.02
DMEMGIBCO12800-082
OPTI-MEM جيبكو31985-070
pBabe puro-H-RasV12 Addgene1768
pGAG / polAddgene14887
pVSVGAddgene1733
TurbofectThermo Fisher ScientificR0531
polybreneSigma-AldrichH92688 mg / mL
puromycinSigma-AldrichP88332 mg / mL & nbsp ؛
الفورمالديهايدسيجما ألدريتشF8775
5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل & بيتا; D-galactopyranoside (X-gal)Sigma-AldrichB4252
فيروسيانيد البوتاسيومSigma-AldrichB4252
فيريسيانيد البوتاسيومSigma-AldrichP9387
تريبسين-EDTAwellgeneLS015-01
DCF-DAسيجما-ألدريتش  D688310 mM 
TrizolThermo Fisher Scientific15596026
MMLV Reverse transcriptasePromegaM1701
SYBR Green PCR master 2x mixTakaraPR820A
Random PrimerPromegaC118A
Tween-20Sigma-AldrichP9416
ماء مقطر فائق النقاءInvitrogen10977015
اختبار IL-6 ELISA البشريPeproTech# 900-TM16
Human IL-8 ELISA assayPeproTech# 900_TM18
EQUIPMENTS< / strong>
0.45 & م حقنة مرشحsartorius16555
ParafilmBEMIS  PM-996
مجهرنيكونTS100
مقياس التدفق الخلويBD BioscienceLSR Fortessa
Amicon Ultra-4mlMerk MilliporeUFC800324
NanoDrop مقياس الطيف الضوئيBioDrop80-3006-61
نظام PCR في الوقت الحقيقيالأنظمة الحيويةالتطبيقية ABI Prism 7500
ELISA قارئالأجهزة الجزيئيةEMax قارئ
الألواح الدقيقة

المراجع

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  3. Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
  4. Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
  5. Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642(2005).
  6. Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
  7. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  8. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).
  9. Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
  10. Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
  11. Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
  12. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
  13. Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
  14. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  15. Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
  16. Rodier, F., Campisi, J. Four faces of cellular senescence. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).
  17. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
  18. Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
  19. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
  22. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  23. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
  24. Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
  25. Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
  26. Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
  27. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  28. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  29. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  30. Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
  31. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  32. Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
  33. Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
  34. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  35. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190(2016).
  36. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

H Ras DCF DA
قياس كمي للأنواع الأكسجين التفاعلية والنمط الظاهري الافرازية المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا الليفية البشرية العادية أثناء الشيخوخة التي يسببها السرطاني
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.