نقدم هنا، بروتوكولا لتصميم واختلاق جنينا الزرد أرايينج القالب، يليه إجراء مفصل عن استخدام هذا القالب للإنتاجية العالية الزرد الجنين أرايينج في لوحة 96-جيدا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
3-الأبعاد (3D)--طباعة قالب للجنين الزرد الإنتاجية العالية أرايينج
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الزرد كائن معترف به عالمياً من مياه العذبة استخداماً في علم الأحياء التنموي، وعلم السموم البيئية والأمراض البشرية المجالات البحثية ذات الصلة. بفضل ميزات فريدة من نوعها، بما في ذلك خصوبة كبيرة، الشفافية الجنين، والتنمية السريعة والفورية، إلخ، الزرد الأجنة غالباً ما تستخدم لتقييم السمية واسعة النطاق للمواد الكيميائية والمخدرات/مجمع الفرز. إجراء فحص نموذجي ينطوي على التفريخ الزرد الكبار، واختيار الأجنة، وأرايينج الأجنة في لوحات متعددة جيدا. من هناك، تتعرض الأجنة للتعرض ومدى سمية المادة الكيميائية، أو يمكن تقييم فعالية العقاقير/المركبات بسرعة نسبيا استناداً إلى الملاحظات المظهرية. ومن بين هذه العمليات، الأجنة أرايينج هو إحدى الخطوات الأكثر استهلاكاً للوقت وكثيفة العمالة التي تحد من مستوى الإنتاجية. في هذا البروتوكول، نقدم نهجاً مبتكراً أن يجعل استخدام قالب أرايينج طباعة 3D مقترنة بفراغ التلاعب الإسراع بهذه الخطوة شاقة. ويصف البروتوكول هنا التصميم العام للقالب أرايينج، الإعداد التجريبية التفصيلية والإجراءات خطوة بخطوة، تليها النتائج الممثل. عند تنفيذها، ينبغي أن يثبت هذا النهج مفيداً في مجموعة متنوعة من التطبيقات البحثية باستخدام أجنة الزرد كاختبار المواضيع.
المقدمة
ككائن نموذج الشعبي، الزرد يستخدم على نطاق واسع في مجالات الطب وعلم السموم1،2،،من34. مقارنة بمنصات في المختبر ، الزرد توفر الكثير من التعقيدات البيولوجي أكبر أن أحد أو لا يمكن أن تقدم نوعين من الخلايا. إضافة إلى كونه كائناً كامل النموذجي وخصوبتها كبيرة الزرد والسريع والمتزامن من التنمية الجنينية والجهاز عالية أعطت الشفافية هذا النموذج مزايا فريدة من نوعها لاستخدامها لسمية واسعة النطاق أو المخدرات/مجمع الفرز5. مئات الأجنة التي تنتجها زوج واحد من الزرد الكبار كل أسبوع تفوق أي نماذج حيوانية أسرة أخرى وجعلت مناسبة لفحص إنتاجية عالية.
إجراء فحص نموذجي باستخدام الزرد ينطوي على قدر كبير من العمل اليدوي، مثل الكبار الزرد التفريخ، اختيار الأجنة، وأرايينج الأجنة في حاويات مناسبة حيث أنهم يتعرضون للتعرض عن طريق غمر المياه. ويرصد وضع الأجنة ونهايات يمكن ملاحظتها مثل معدلات الوفيات، وإمكانية فقس البيض، والشذوذ غالباً ما قيمت يدوياً ويستخدم كتعريفات أولية لسمية المواد الكيميائية أو مؤشرات لمدى فعالية العقاقير أو المركبات. لتسريع إجراءات الفرز، تم استكشاف النهج مثل التصوير الآلي وتحليل الصور الحاسوب مسبقاً. على سبيل المثال، مجاهر مع المحتوى العالي من قدرات التصوير وقد تم تكييف أداء الآلي مشرق الحقل أو تصوير الأسفار على الأجنة الزرد في مختلف مراحل النمو من لوحات جيدا 96/3846. أجهزة موائع جزيئية مقترنة بالمجاهر استخدمت لوضع اليرقات الزرد من خلال التلاعب الحالي لتصوير الدماغ الخلايا العصبية7. هذه النهج يمكن تحسين كبير في كفاءة عمليات اقتناء الصورة مقارنة بالتشغيل اليدوي التقليدي. وعلاوة على ذلك، مع عدد كبير من الصور التي يتم إنشاؤها، أدوات تحليل الصورة كما وضعت لتسريع عملية معالجة البيانات، كما يتبين من ليو وآخرون وتو et al. 8 , 9.
كما يزيد مستوى الإنتاجية لتحليل التصوير والصورة، أصبح من الواضح أن هذه الخطوة الحد من معدل للفحص يكمن في عملية إعداد أجنة الزرد للتعرض، والذي يعني عادة أرايينج منهم إلى 96-384 جيدا أو لوحات. لحل هذه الخطوة عنق الزجاجة، وضعت موجهة برؤية الروبوتات ماندريل et al. 10 ولنا11 سابقا ليحل محل المناولة اليدوية ولكن الأدوات متطورة بل وهناك منحنى التعلم عميق لتنفيذ مثل هذه التقنيات. ولذلك، لتوفير نهج سهلة الاستخدام يصبح أحد العوامل الهامة لزيادة تحسين مستوى الإنتاجية لفحص الزرد، وهو الهدف الرئيسي لهذا العمل.
في هذا العمل، ونحن تصميم وملفقة جنين أرايينج قالب عليها 3D الطباعة. صمم قالب أرايينج لإيقاع الجنين الزرد إلى الآبار التي تناسب مع صفيحة 96-جيدا قياسية. بدلاً من اختيار الأجنة وأرايينج لهم في بئر فرادى واحداً تلو الآخر، أحد يمكن تنفيذ فخ الجنين ومجموعة جميع أجنة 96 في صفيحة الجدر مرة واحدة. باستخدام هذا القالب والبروتوكول التالي، واحد يمكن زيادة كبيرة في الكفاءة من أرايينج الأجنة في لوحات الجدر، والتي ستكون في الأجل زيادة قدرة الفرز على الأقل عشرة إضعاف، مقارنة بالتشغيل اليدوي. ويشمل البروتوكول هو موضح أدناه تصميم العام أرايينج القالب، تفريخ الزرد، جمع الجنين، وأرايينج. ويبين الشكل 1 التصميم العام للقالب أرايينج. ويبين الشكل 2 لمحة عامة عن البروتوكول خطوة بخطوة حول استخدام قالب الموصوفة في الأجزاء 3 و 4.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-التصميم والتصنيع الأجنة الزرد أرايينج قالب
-
تصميم قالب أرايينج مع 12 من 8، 96-جيدا التخطيط الذي يناسب لوحة 96-جيدا قياسية. استخدام الأبعاد المذكورة في الشكل 1A للدائرة الفخ الجنين العلوي (انظر أيضا الملف التكميلي).
- استخدام الأبعاد المبينة في الشكل 1 باء و دال 1 للفخ جيدا.
- استخدام الأبعاد في الشكل 1 للدائرة فراغ أسفل.
- استخدام الأبعاد في الشكل 1B للهواء في/منفذ.
- استخدام طابعة 3D (بدقة 0.1 ملم) لطباعة القالب؛ انظر الجدول للمواد الراتنج الموصى بها لاستخدامها للطباعة.
ملاحظة: يوصي بالطابعات ثلاثية الأبعاد بدقة 0.1 مم لتصنيع قالب أرايينج (انظر الجدول للمواد). اللون المقترح لسطح القالب هو رمادي داكن أو أسود.
2-الزرد الجنين التفريخ
- مكان اثنين من أزواج من سمك الذكور والإناث للتزاوج مربع قبل التبويض بيوم واحد. منفصلة من الذكور والإناث بمقسم بلاستيك الشفاف.
- الإقلاع الفواصل في الصباح لخلط الأسماك الذكور والإناث.
- إزالة الأسماك الذكور والإناث وجمع الزرد الأجنة باستخدام مصفاة مش غرامة. أغسل الماء الأجنة مع البيض 250 مل (انظر الجدول للمواد).
- نقل الأجنة التي تم جمعها إلى أطباق بتري (90 ملم في القطر) مع الحل في هولتفريتير (انظر الجدول للمواد) وإزالة أجنة ميتة والمخصبة باستخدام ستيريوميكروسكوبي.
- وضع الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية. في ح 4 وظيفة التسميد (hpf) ومراقبة الأجنة وإزالة أي أجنة ميتة وغير صحية. الأجنة الآن جاهزة للخطوة التالية.
3-إعداد أرايينج القالب
- أغسل القالب 2 – 3 مرات بواسطة 500 مل من الماء ووضعه في فرن التجفيف (45 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
- الشريط الدائرة السفلي مع قطعة من ختم الفيلم (الشكل 2، الخطوة 1).
- قم بتوصيل مضخة الفراغ من خلال منفذ الهواء في الجزء السفلي من القالب.
ملاحظة: الفراغ الحد الأقصى الموصى به لمضخة فراغ هو 0.1 الآلام والكروب الذهنية. كن على علم من قوة الفراغ المستخدمة. إذا كان الضغط السلبي قوية جداً، قطع حفرة على شكل الصليب على الفيلم الختم إلى انخفاض الضغط.
4-أرايينج "الأجنة الزرد" إلى لوحة 96-جيدا
- استخدام ماصة نقل بلاستيك، مكان حوالي 150 الأجنة في القالب، كما هو موضح في الشكل 2، الخطوة 2.
- قم بتوصيل مضخة فراغ مخرج الهواء لتوليد ضغط سالب في قاعة مختومة بختم الفيلم في الخطوة 3، 3.
- هز القالب كامل أفقياً حتى كل جيدا على الجنين واحد أكمنة (الشكل 2، الخطوة 3).
ملاحظة: إذا كان حل هولتفريتير يجف قبل الأجنة محاصرون في كل بئر، إضافة الحل إضافية هولتفريتير في غرفة الفخ وكرر هذه الخطوة. - تجاهل حل إضافي هولتفريتير والأجنة التي هي شرك لا في الآبار (الشكل 2، الخطوة 4).
- قم بإيقاف تشغيل وقطع مضخة فراغ.
- ضع لوحة 96-جيدا قياسية رأسا على عقب ضد القالب (الشكل 2، الخطوة 5) وتدوير كليهما في نفس الوقت (الشكل 2، الخطوة 6).
- اضغط على الجزء السفلي من القالب أو توصيل الهواء منفذ للغبار غاز مضغوط يمكن نقل الأجنة جميع المحاصرين من القالب إلى لوحة 96-جيدا (الشكل 2، الخطوة 6).
- كرر الخطوة 4.1 إلى 4.8 لإعداد إضافية من لوحات متعددة جيدا.
- إزالة الفيلم الختم وغسل القالب 3 مرات من أعلى إلى أسفل مع منزوع 500 مل من الماء للاستخدام في المستقبل.
ملاحظة: لا تستخدم أي من المذيبات العضوية، مثل الإيثانول، لتنظيف القالب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 3 قالب أرايينج نموذجية طباعة 3D. هذا القالب يستخدم الراتنج حساس كمواد خام وأدلى طابعة ثلاثية الأبعاد؛ تم تطبيق طبقة من الطلاء الأسود لتوفير أفضل على النقيض من لون الأجنة. موقف الآبار 96 (12 من 8) صممت لتناسب مع صفيحة 96-جيدا قياسية. وبالمثل، يمكن أيضا تصميم قالب جيدا (24 من 16) 384 وملفقة باستخدام نفس الأسلوب. رأسا على عقب الدائرة كانت أكبر قليلاً من صفيحة 96-جيدا قياسية لتوفير المناسب أفضل. وصممت الأخاديد أيضا عقد أجنة إضافية أثناء أرايينج.
<...الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك اثنين من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي تتطلب اهتماما وثيقا لتنفيذ ناجح لقالب طباعة 3D أرايينج الأجنة الزرد.
هو العامل الأكثر أهمية في تصميم القالب أرايينج الفخ أيضا. يجعل بالتأكيد هناك جنين واحد فقط محاصرين في كل بئر، واحدة ينبغي إيلاء اهتمام وثيق للقطر وعمق البئر الفخ، والقطر من خلال ثقب. القطر الموصى بها ضمن 1.5 إلى 2 مرات قطر جنينا النموذجية (بما في ذلك المشيمة). ينبغي أن يكون عمق الفخ جيدا داخل 2 مرات قطر جنينا النموذجية (بما في ذلك المشيمة) لتجنب التراص الأجنة في البئر نفسها...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد شغل المؤلفين براءة في وصف قالب طباعة 3D.
شكر وتقدير
هذا العمل كان يدعمها البرنامج "1000plan الشباب" و "أموال بدء التشغيل" من جامعة تونغجى، وتشرف منحة # 21607115 21777116 (لين).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مرفق الزرد | شنغهاي Haisheng Biotech Co.، Ltd. | Z-A-S5 | |
| مربع التزاوج | شنغهاي Haisheng Biotech Co.، Ltd. | ||
| زجاجة غسيل ، 500 مل | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| كلوريد الصوديوم | Vetec | V900058-500G | |
| كلوريد البوتاسيوم | Sinopharm الكاشف الكيميائي المحدودة | 10016318 | |
| كلوريد الكالسيوم | Sinopharm الكاشف الكيميائي المحدودة | بيكربونات الصوديوم 20011160 | |
| nbsp ؛ | Vetec | v900182-500G | |
| الميثيلين الأزرق هيدرات | TCI | M0501 | |
| حمض الهيدروكلوريك | Sinopharm الكاشف الكيميائي المحدودة | 10011008 أملاح البحر الفورية | |
| المحيط | SS15-10 | ||
| ماصة | فيشربراند | 13-675M | |
| إسقاط باسترال بيبيت | فيشربراند | 13-678-30 | |
| مجهر | OLYMPUS | SZ61 | |
| حاضنة الكيمياء الحيوية | شنغهاي Yiheng Scientific Instrument Co.، Ltd. | طابعة LRH-250 | |
| ثلاثية الأبعاد | UnionTech | Lite600 | |
| راتنج حساس للضوء | مضخة فراغ UnionTech | UTR9000 | |
| Shanghai Yukang Scientific Instrument Co.، Ltd. | SHB-IIIA | ||
| لاصقة PCR لوحة الأختام | Solarbio | YA0245 | |
| 96 لوحة البئر | Costar | 3599 | |
| ماصة متعددة 8 قنوات 30 - 300 مو ؛ ل | Eppendorf | 3122000.051 | |
| منفضة الغاز المضغوط | شنغهاي Zhantu الكيميائية المحدودة | ST1005 | |
| DI المياه | الحرارية | GenPure برو الأشعة فوق البنفسجية / UF | |
| فرن التجفيف | شنغهاي Yiheng Scientific Instrument Co.، Ltd. | BPG-9106A | |
| نظام المياه | خارج المنشأة نظام المياه | ||
| ماء البيض | المخفف 60 ملغ " المحيط الفوري" أملاح البحر و 0.25 مجم / لتر الميثيلين الأزرق في 1 لتر DI ماء | ||
| هولتفريتر محلول | s قم بإذابة 7.0 جم كلوريد الصوديوم (NaCl) ، 0.4 جم بيكربونات الصوديوم (NaHCO3< / sub>) ، 0.1 جم كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 0.235 جم كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub>.2H2< / sub>O) في 1.9 لتر ماء DI. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7 باستخدام حمض الهيدروكلوريك واضبط مستوى الصوت على 2 لتر باستخدام ماء Di |
المراجع
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533(2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
