ميكانيكا خلية السبر مع ملاقط خالية من حبة الضوئية في الجنين المورفولوجية

Claire Chardès; Raphael Clement; Olivier Blanc; Pierre-François Lenne

doi:10.3791/57900

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ميكانيكا خلية السبر مع ملاقط خالية من حبة الضوئية في الجنين المورفولوجية

7.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57900

⸱

نوفمبر 2, 2018

Claire Chardès^*¹ , Raphael Clement^*¹ , Olivier Blanc¹ , Pierre-François Lenne¹

¹CNRS, Institut de Biologie du Développement de Marseille, Aix-Marseille Université

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم داد ملاقط بصرية بالإضافة إلى مجهر ورقة خفيفة، وتنفيذه للتحقيق ميكانيكا الخلية دون الخرز في الجنين المورفولوجية .

الملخص

Morphogenesis يتطلب التنسيق بين القوات الميكانيكية لتشكيل قوة الخلايا والأنسجة والزخرفة الوراثية. ومن ثم تحديا لفهم العمليات morphogenetic مباشرة قياس قوات الخلوية والخصائص الميكانيكية في فيفو أثناء امبريوجينيسيس. نقدم هنا، داد ملاقط بصرية بالإضافة إلى مجهر ورقة ضوء، مما يسمح لمباشرة تطبيق القوات على الاتصالات خلية الجنين المورفولوجية المبكر، بينما التصوير بسرعة عدة إطارات في الثانية الواحدة. ويمتاز هذا الأسلوب فإنه يحتاج إلى حقن الخرز إلى الجنين، عادة ما تستخدم كالوسيطة المسابير التي تبذل قوات الضوئية. ونحن بالتفصيل خطوة بخطوة في تنفيذ برنامج الإعداد، واقتراح أدوات لاستخراج المعلومات الميكانيكية من التجارب. برصد عمليات النزوح من خلية خلية الاتصالات في الوقت الحقيقي، يمكن للمرء إجراء قياسات التوتر والتحقيق ريولوجيا خلية الاتصالات.

المقدمة

التطور الجنيني هو عملية استنساخه بشدة خلالها الخلايا والأنسجة التي تشوه شكل الحيوان مستقبلا. أظهرت هذه التشوهات تتطلب توليد النشطة من القوات في مستوى¹^،الخلية². فهم العمليات morphogenetic خلالها الخلايا والأنسجة تغيير شكلها، هو ذلك المفتاح لتقييم الخواص الميكانيكية للخلايا المعنية، وقياس القوى داخل الأنسجة خلال³^،العملية⁴ . وقد درست طبقات طلائي، لا سيما في المورفولوجية، على نطاق واسع سبب هذه الهندسة شبه 2D والتلاعب سهولة.

وهكذا وضعت عددا من التقنيات وغيرهم لتقييم ميكانيكا الظهارية في فيفو أثناء التطوير. وسوف نعطي لمحة سريعة عن التقنيات الرئيسية الثلاثة المستخدمة في الأنسجة الظهارية. ليزر تذرية، أسلوب مستخدمة على نطاق واسع، يسمح للكشف عن الضغط الميكانيكي المحلية في الخلية تقاطعات⁵^،⁶^،^،من⁷⁸ أو في أكبر حجم⁹^،¹⁰^،¹¹عن طريق إجراء تخفيضات المحلية التي تخل بسلامة الميكانيكية للهدف. القوى المحركة لفتح عقب القطع يوفر معلومات على الاجتثاث مسبقة الإجهاد، وعلى ريولوجيا ل النسيج¹²^،¹³. عيب تذرية الليزر أنها الغازية، كما أنه يتطلب تعطيل القشرة الخلية المحلية. ومن ثم، واحدة فقط تنفيذ عدد محدود من أبلاتيونس إذا كان أحد يرغب في المحافظة على سلامة الأنسجة. عيب آخر هو أن أبلاتيونس لا تقدم سوى التقديرات النسبية للتوتر في خلية الاتصالات، نظراً لسرعة فتح تعتمد على الاحتكاك اللزج، الذي هو عموما غير معروف. وقد تم التلاعب المغناطيسي أيضا وضعها واستخدامها في المورفولوجية، التي تنطوي على استخدام فيروفلويدس¹⁴ أو¹⁵من أولتراماجنيتيك الدهنية. أنها يمكن أن توفر قياسات مطلقة¹⁶^،¹⁷، ولكن هي أيضا الغازية بمعنى أنها تحتاج إلى حقن تحقيقات في الموقع المطلوب. وهذا يمكن أن تكون صعبة للغاية اعتماداً على النظام، هي ليست دائماً قابلة للحقن دقيقة. تقنية ثالث، غير الغازية على تماما، هو قوة الاستدلال¹⁸^،^،من¹⁹²⁰. قوة الاستدلال يعتمد على افتراض التوازن الميكانيكي في نقاط ثلاثية (الوصلات تريسيلولار أو القمم)، ويسمح باستنتاج التوتر في كل خلية-خلية الاتصالات (وربما الضغوط في كافة الخلايا) بحل مشكلة معكوس. للتوترات، ويوفر كل ذروة معادلتين (X و Y). وهذا ينتج نظام كبير من المعادلات الخطية التي يمكن مقلوب تحت بعض الظروف لتقييم التوتر في كل خلية الاتصالات. في حين أن هذا الأسلوب جذابة للغاية، إلا أنها تتطلب صورة مجزأة ولا من تجربة إضافية أو الإعداد، لم يتحدد دقة لتحديد، ومرة أخرى فإنه يوفر فقط القيم النسبية، ما لم يتم تنفيذ قياس معايرة مطلقة.

للتغلب على بعض هذه القيود، نقدم في هذه المقالة داد ملاقط بصرية بالإضافة إلى مجهر ورقة خفيفة لتطبيق القوات الخاضعة للمراقبة على مستوى الخلية في ظهارة الجنينية من melanogaster المورفولوجية. وقد استخدمت ملاقط بصرية للعديد من التطبيقات البيولوجية بما في ذلك القياسات على البروتينات وحيدة والتلاعب من العضيات والخلايا²¹. هنا، نحن تقرير قوات التطبيقية في نطاق pN عشرات قليلة، وصغيرة كافية بعد للحث على التشوهات المحلية للاتصالات المحمولة وإجراء القياسات الميكانيكية في الجسم الحي. عادة ما نستخدم انحراف عمودي لاتصالات الخليوي، ترصد من خلال تحليل كيموجرافس، تتعلق بالقوة إلى تشوه. الأهم من ذلك، لدينا الإعداد لا تتطلب حقن الخرز في الموقع المطلوب في الأنسجة، وملاقط بصرية قادرون على بذل القوات في خلية خلية اتصالات مباشرة. اقتران ملاقط بصرية مجهر ورقة ضوء يسمح أحد للقيام بالتصوير السريع (عدة إطارات في الثانية الواحدة)، وملحوظ جداً لإجراء تحليل ميكانيكية في فترات زمنية قصيرة، ومع انخفاض الضيائية، منذ الإضاءة نموذج يقتصر على الطائرة من التصوير²².

ملاقط الضوئية عموما، وطريقة غير الغازية لتطبيق القوات الخاضعة للرقابة في خلية الاتصالات في المجراة في الجنين المورفولوجية ، واستخراج المعلومات الميكانيكية مثل تصلب والتوتر في خلية الاتصالات²³، خصائص انسيابية²⁴، ومن التدرج أو تباين من التوتر²³.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-وضع المجهر ورقة خفيفة

الرجوع إلى وصف الإعداد في المنشور السابق²⁵.
ملاحظة: الإعداد تتكون من مرحلة مجهر تستقيم ونمطية ورقة خفيفة المنتجة ورقة خفيفة في الطائرة الأفقي. 10 X عدسة الهدف الإثارة يوجه الورقة الخفيفة إلى زجاج ومبومو (الشكل 4). وقد العدسة الهدف الكشف عن نا عالية (1-1)، الذي ضروري لكفاءة كاياالاقل (انظر أدناه).

2. إنشاء المسار ملاقط بصرية

ملاحظة: الرقم 1 يعطي مخطط عام لإعداد البصرية.

ضع وحدة ليزر 1070 نانومتر وإصلاح الألياف على الجدول البصرية مع جبل الخامس-المشبك. التأكد من أن صيد تلسكوب الألياف موازية للجدول الضوئية (ومن ثم، الأفقي) الانحياز وأن الارتفاع المحدد هنا الطول بالنسبة لجميع المكونات البصرية على الطاولة الضوئية.
ملاحظة: 100 ملم يمكن أن يكون خياراً جيدا لهذا الارتفاع.
تشغيل المفتاح لوحدة ليزر الأشعة تحت الحمراء واضغط على الزر "تحديد" تشغيل مؤشر المحاذاة. على ضوء قد تكون أفقية الصادرة من الألياف.
وضع المصراع في مسار بصري، وإصلاحه للجدول الضوئية، حيث أن شعاع ليزر الأشعة تحت الحمراء يمر من خلال فتحه المصراع. التأكد من أن المسافة بين الجدول البصرية ومركز الفتحة مصراع هو الارتفاع اختياره في الخطوة 2، 1.
تشغيل مفتاح تحكم مصراع وحدد الوضع اليدوي بالأسهم واضغط على زر "تمكين" لفتح المصراع.
مكان، ومحاذاة وإصلاح مرآة جلفانومتر الأولى.
ملاحظة: اثنين من المرايا جلفانومتر يجب أن يكون مترافق للفتحة الخلفية للكشف عن الهدف، وذلك عندما هو واحد من المرايا بالتناوب، شعاع الليزر لا تخرج من الفتحة الخلفية للهدف. علما أن المسافة بين جلفانومتر الأولى والفتحة الخلفية للهدف يجب أن تحسب لتقييم موقف هذا جلفانومتر فيما يتعلق بالهدف (f1 f1 + f2 + f2 + f3 + f3 + f4 + f4 = 30 + 30 + 30 + 30 + 30 + 200 + 200 + 500 + 500 = 1550 مم؛ وأي فأي = البعد البؤري للعدسة جوان أنا).
قم بتشغيل جلفانومتر وحدة الإمداد بالطاقة. ضمان أن تعمل بالطاقة جالفانوميتيرس لبقية البروتوكول المحاذاة.
تعيين جالفانوميتيرس إلى انحراف صفر (مع نعيم أو البرمجيات الملاقط الضوئية-راجع الخطوة 3 للاتصالات جلفانومتر).
مكان، ومحاذاة وإصلاح التلسكوب ترحيل تتألف من اثنين من العدسات مع طول بؤري من عيار 30 ملم.
مكان، ومحاذاة وإصلاح مرآة جلفانومتر الثانية. لاحظ أن المسافة بين جالفانوميتيرس هما 4f = 4 × 30 = 120 مم (f = البعد البؤري).
وإصلاح التلسكوب.
ملاحظة: التلسكوب وتتألف من اثنين من العدسات التي توسع الشعاع إلى عرض مساوية على الأقل لقطر فتحه العدسة الهدف مرة أخرى. العدسة بطول بؤري أصغر يجب أن يأتي أولاً.
مكان، ومحاذاة وإصلاح الناظور جلب صعودا من المسار البصري أقرب إلى مدخل للسكك الحديدية مرآة مزدوج اللون.
إصلاح مرآة ساخنة في السكك الحديدية والسكك الحديدية في المجهر. ضمان أن يتم أعادوا السكك الحديدية على الجانب الأيسر للسماح بدخول ليزر الأشعة تحت الحمراء (الشكل 2).
تحقق من أن ضوء الليزر هو الخروج من المجهر، أولاً دون الهدف، ثم مع الهدف. تصحيح موقف الليزر قبل الهدف مع مرآة السفلي المنظار. تصحيح موقف الليزر بعد الهدف مع مرآة المنظار العلوي.
1 ميليلتر من 500 نانومتر الفلورسنت الخرز في ومبومو الزجاج وإضافة 10 مل ماء المقطر. وضع ومبومو في إطار الهدف في حامل ومبومو وضبط تركيز الهدف (موقف Z) حيث الهدف تلامس سطح الماء.
بدء تشغيل برامج محلية الصنع اكتساب السيطرة أوتف والكاميرا ومرحلة كهرضغطية. يمكن أيضا استخدام برمجيات حرة مثل micromanager. تشغيل وضع اكتساب العيش عن طريق الضغط على زر "لايف".
ضبط سلطة 1 دبليو ليزر الأشعة تحت الحمراء
وضع نظارات واقية (ولا إزالته قبل نهاية التجربة) والتبديل على الليزر. ينبغي أن تكون حبة محاصرين في تركيز الليزر.
1. إذا كان لا يوجد حبة المحاصرين في تركيز الليزر، تحقق إذا كان مؤشر الليزر الأحمر (التي تربطها علاقة خطية متداخلة مع ليزر الأشعة تحت الحمراء) هو الخروج من الهدف. إذا لم يكن كذلك، بدء مرة أخرى الخطوات المحاذاة، وبخاصة خطوة 2.13. أو زيادة قوة ليزر الأشعة تحت الحمراء.
2. إذا حبة المحاصرين من التركيز (من الطائرة تصوير)، نقل بلطف موضع العدسة الماضي آخر التلسكوب (L4 في الشكل 1) على المحور البصري جلب حبة في التركيز على متن الطائرة التصوير. إذا لم يكن كافياً، تحرك العدسة الأولى من آخر التلسكوب (L3 في الشكل 1) على المحور البصري.
3. إذا لم يتم توسيط حبة المحاصرين في الصورة، استخدم المرايا الناظور 2 لضبط موضع الفخ. إذا تم تغيير موضع حبة عن طريق تغيير زاوية المرأة الأولى، أيضا تعويض اتجاه الشعاع عن طريق تغيير زاوية المقابلة للمرأة الثانية. تصحيح الموقف X فقط (مسمار 1 لكل مرآة)، ثم تصحيح موقف Y (مسمار 1 لكل مرآة).
إذا لزم الأمر، تعديل موضع العدسة 2^nd التلسكوب لمراقبة حبة في التركيز.
إذا لزم الأمر، ضبط زاوية المرايا الناظور أن يكون حبة تركزت في الصورة.

3-التواصل في الصك

ملاحظة: يعطي الشكل 3 مخطط عام للصكوك الوطنية (ني) بطاقة الاتصالات.

إدراج بطاقة الإخراج (ني-9263) في الفتحة الأولى من الهيكل (كداق-9178). لاحظ أنه يمكن استخدام نماذج أخرى من بطاقات ني مع النواتج التمثيلية على الأقل 2 و 3 مدخلات التناظرية.
إدراج بطاقة الإدخال (ني-9215) في الفتحة الثانية من الهيكل.
الاتصال جلفانومتر الأولى التناظرية الإنتاج AO0 و AI0 المدخلات التناظرية مع BNC الكابلات. لاحظ أنه يمكن استخدام محول تي للاتصال 2 BNC الكابلات بأحد. أرجع إلى دليل جلفانومتر لتعريب السنون الموجودة على متنها سائق جلفانومتر.
بنفس الطريقة، قم بتوصيل جلفانومتر الثانية إلى AO1 و AI1.
قم بتوصيل PFI1 في المشغل من المصراع (الخلفي لوحدة التحكم).
الاتصال PFI0 على النار للكاميرا و AI2.
قم بتوصيل AI3 بالمشغل من المصراع (الخلفي لوحدة التحكم).
ضبط إعدادات وحدة تحكم مصراع. استخدم الأسهم لتغيير قيم المعلمات وتضغط على الزر "تحديد" التحقق من صحة الاختيار وتمرير المعلمة التالية. وضع المعلمة "الوقت ثانية مفتوحة" إلى 000.000، "الوقت مغلقة ثانية" إلى 000.000، "الوضع" لواحد، و "المشغل" للسماح تحويله سيطرة المصراع بالضغط على زر 'تمكين'.
فتح قتكريتور (تحميلها من https://www.qt.io/، النسخة المجانية).
ملاحظة: قتكريتور هو "بيئة تطوير متكاملة" تستخدم لتطوير البرمجيات "ملاقط بصرية" في c + +. مكتبة كيو تي يستخدم هنا لإنشاء الحاجيات.
قم بفتح الملف OT.pro (المتوفر في ملفات التعليمات البرمجية كيو تي). هذا الإجراء سيتم فتح المشروع. تغيير اسم الإدخال والإخراج في ملف AOGenerator.cpp وفقا لبطاقة (ق ني) المستخدمة.
ترجمة وتشغيل البرنامج بعد التمديد.

4-معايرة موقف فخ بصري مع الخرز

تسجيل فيلم المعايرة
1. وضع 1 ميليلتر من 500 نانومتر الأحمر نيون الخرز ومبومو الزجاج، ثم شغل في ومبومو مع 10 مل ماء المقطر. ويعطي الشكل 4 طريقة عرض ومبومو في سياق المراقبة.
2. إصلاح في ومبومو في مرحلة كهرضغطية.
3. ضبط موضع Z ومبومو حيث أن الهدف الكشف عن الانخفاضات في الماء.
4. قم بتشغيل ليزر الأشعة تحت الحمراء وتعيين السلطة إلى 1 دبليو
5. قم بتشغيل البرنامج الحصول على الصورة.
6. للحصول على صور انقضاء الوقت، حدد وقت التعرض، الكسب الوقت بين اثنين من الصور وعدد الصور الحصول على قوة الليزر. نلاحظ أن الإضاءة لمعايرة الملاقط بصري مع الخرز، الليزر (561 nm) غير مطلوب. 2-فوتون التأثير الناجم عن ليزر الأشعة تحت الحمراء ما يكفي لإثارة الأسفار من حبة المحاصرين.
7. بدء تشغيل البرنامج ملاقط بصرية محلية الصنع.
8. تعيين معلمات ملاقط بصرية لتتبع دائرة. مجموعة SamplingRate 250 عصيدة/s، بوفيرسيزي ك 1000، معلمات Waveform1 (جالفو 1) كما سينوسويدال، نببيريود 1، سعة 0.5 V، المرحلة راد 0.0، إزاحة 0.0 الخامس، 2 الموجي معلمات (جالفو 2) Sinusoidal، نببيريود 1، سعة 0.5 V، المرحلة 1.57 راد، إزاحة 0.0 V.
9. تحقق من مربع "معلمات منظمة العفو الدولية"، و "الانتظار لأنها".. مربع.
10. ابدأ الحصول على الصور (الصور 500 أو 1000 مع معدل إطار عالية، مثل 10 إطارا في الثانية).
11. التبديل على ملاقط بصرية عن طريق الضغط على زر "المدرة!".
12. تسمح حبة المحاصرين لإنجاز دائرتين كاملة على الأقل ووقف ملاقط بصرية بالأمم المتحدة الملحة "توليد!" زر.
13. إيقاف الحصول على الصورة. لاحظ أن فيلم المشاجرة وملف نصي مع جلفانومتر الفولتية يتم إنشاؤها في الافتراضي "c:/TEMP/" المجلد (إلا إذا تم تحديد موقع مخصص). لاحظ أنه لا يمكن إنشاء عدة أفلام المعايرة مع ملفات البيانات المرتبطة بها إذا لزم الأمر.
  1. إذا لم تكتمل الدائرة، يضيع حبة خلال مسار الدائرة. ربما السرعة عالية جداً. تقليلها بتقليل معدل أخذ العينات في البرنامج بعد التمديد. أو، باستخدام مؤشر الليزر الأحمر ليزر الأشعة تحت الحمراء، تحقق إذا كان الليزر يخرج من الهدف أثناء مسار دائرة كاملة. أن لم يكن الأمر كذلك، قد لا يكون مترافق المرايا جلفانومتر مع العودة البؤري للعدسة الهدف. تصحيح مواقف جالفانوميتيرس فيما يتعلق بالمستوى البؤري العودة للهدف، وبدء خطوات المحاذاة مرة أخرى من الخطوة 2، 5.
14. تعيين في الاتساع إلى الصفر والتحول عن الليزر فخ حبة في وضع إصلاح. ضع علامة بارزة في الموقع فخ.
موقف الاستيفاء مع تحليل الصورة
1. فتح Matlab، انتقل إلى المجلد المعايرة، وتشغيل البرنامج النصي "position2tension" (المتوفرة في ملفات التعليمات البرمجية Matlab). يحسب هذا البرنامج النصي وظيفة الاستيفاء ترجمة الفولتية جلفانومتر لموقف فخ بصري.
2. اختر ستستخدم عدد الأفلام المعايرة. يمكن تحديد عدة أفلام مع المسارات المختلفة، مثل علامات الحذف عمودي اثنين. وبصفة عامة، كفى فيلم معايرة واحدة مع مسار دائري.
3. تقديم الصورة الأولى والأخيرة أرقام في مربع الحوار (مربع حوار واحد للفيلم الواحد)، تسلسل مع مسار واضح وجيد إشارة إلى نسبة الضوضاء.
4. توفير مسار الملف النصي الذي يحتوي على الفولتية من خلال اقتناء لكل فيلم. علما بأن البرنامج النصي يقرأ الملف ويقوم بحساب الفولتية يعني من جالفانوميتيرس اثنين لكل صورة.
5. توفير مسار الفيلم المعايرة المقابلة.
  ملاحظة: البرنامج النصي بالكشف عن حبة لكل إطار مع قرار subpixel باحتواء غاوسي 2D إلى حبة، باستخدام الدالات المخصصة ووظائفها المستخرجة من MTT²⁶. ويعرض الرسم بياني عرض مسار حبة.
6. القضاء على أي نقطة ضعف الكشف عن (المتطرفة) بواسطة النقر فوقها.
7. الاختيار إذا كان الاستيفاء خريطة ل x و y الليزر المواقف المحسوبة وعرضها بواسطة البرنامج النصي, يتم إكمال. إذا كان هناك الكثير من القيم المفقودة (المناطق البيضاء في الخريطة)، كرر العملية مع فيلم معايرة جديدة، مع أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء، أو/و بسرعة أبطأ من جالفانوميتيرس.
  ملاحظة: هذه الصور والقيم الاستيفاء يتم حفظها تلقائياً في نفس المجلد مثل الصورة، مع convertFct.mat الاسم.

5-تصاعد المورفولوجية الأجنة²⁷

جمع الأجنة المورفولوجية من قفص، المحتضنة عند 25 درجة مئوية.
إزالة الخميرة، مرورا بمحتويات لوحة غربال (يجب أن يكون حجم المسام حوالي 100 ميكرومتر).
تغسل الأجنة مع التبييض 100% (2.6% هيبوكلوريت الصوديوم) ل 45 ثانية لإزالة المشيمة في.
تغسل الأجنة بالماء لمدة 2 دقيقة.
وضع الأجنة في جهاز pad أجار بفرشاة.
اختيار أجنة حوالي 10 وفقا لمرحلة المطلوب ومحاذاة الأجنة مع إيك أو فرشاة رطبة.
ملاحظة: المحاذاة، وينبغي أن يتم وفقا لمنطقة الفائدة (منطقة فائدة في أقرب وقت ممكن بهدف الكشف).
باستخدام قلم تمييز الماس، قطع قطعة من شريحة زجاجية من 10 × 20 × 1 مم³.
إضافة الغراء على جانب واحد من قطعة قطعة، وأتركها تجف ل 20 ثانية.
اقلب قطعة قطعة ووضعه على سطر الأجنة، التمسك بها عند الحافة من الشريحة.
تثبيت هذه الإعداد في صاحب العينة ووضعه في ومبومو. ويعطي الشكل 4 طريقة عرض ومبومو في سياق المراقبة.
وضع في ومبومو في مرحلة كهرضغطية.

6-محاصرة التجربة في فيفو

تعويض اللون لجهات الاتصال الخلية – ذبذبات (الشكل 5)
1. العثور على موقع للاهتمام في الأنسجة.
  ملاحظة: الذباب التي تسمى كادهيرينس باستخدام يمكن أن تكون مفيدة إذا كان على المرء أن يعمل في طائرة تقاطعات أدهيرينس.
2. نقل نقطة الوسط في مفترق الطرق المستهدفة على موقف فخ (معلما في خطوة 4.1.14) باستخدام مرحلة بيزو.
3. تعيين معلمات مصيدة لتحقيق الذبذبات عمودي على خط الاتصال. تعيين المراحل كصفر. تعيين الاتساع في العاشر واتجاهات Y لحركة عمودي على خط الاتصال. يجب أن تكون السعة عموما 0.1 V.
4. بدء اقتناء (مع معدل إطار سريعة، مثل 10 إطارا في الثانية).
5. قم بالتبديل في ملاقط بصرية الضغط على زر "المدرة!".
6. عند القيام بذلك، إيقاف تشغيل ملاقط والتوقف عن الحصول على الصور. الآن يجب أن يظهر فيلم وملف نصي يحتوي على الفولتية جلفانومتر من خلال اقتناء في المجلد المحدد.
7. تعويض اللون لجهات الاتصال الخلية – سحب-الإفراج (الشكل 6)
8. العثور على موقع للاهتمام في الأنسجة.
9. نقل تقاطع المستهدفة باستخدام مرحلة بيزو حتى منتصفه هو عادة 1 ميكرومتر بعيداً عن موقف فخ (معلما في خطوة 4.1.14).
10. تعيين في الاتساع إلى 0 إلى فخ مطرد.
11. ابدأ الحصول على الصور (مع معدل إطار سريعة، مثل 10 إطارا في الثانية).
12. قم بالتبديل في ملاقط بصرية الضغط على زر "المدرة!".
13. بعد الوقت المطلوب، أوقف في الفخ والانتظار للاسترخاء بحيث تحدث.
14. إيقاف الحصول على الصورة. الآن يجب أن يظهر فيلم وملف نصي يحتوي على الفولتية جلفانومتر من خلال اقتناء في المجلد المحدد.
كيموجراف شبه التلقائي توليد والكشف عن الموقف الذي واجهة.
1. في نافذة الأوامر Matlab، تحميل الخريطة الاستيفاء المتولدة أثناء إجراء المعايرة (4b): load('convertFct.mat'). وهذا يوفر بمتغيرات fx والسنة المالية.
2. في نافذة الأوامر Matlab، قم بتشغيل autokymo(fx,fy)، المقدمة في ملفات التعليمات البرمجية Matlab. والغرض من هذه الوظيفة هو لتوليد كيموجراف على طول مسار الليزر، والكشف عن موضع خط الاتصال مع القرار subpixel لكل إطار.
3. حدد مسار الملف نص المطالبة التي تحتوي على قيم الجهد الكهربي.
4. حدد الأرقام الإطار الأول والأخير من الفيلم ليتم تحليلها.
5. حدد ملف الفيلم tiff. سيتم عرض أرقام جديدة اثنين: الأول صورة كيموجراف. والثانية رسم بياني للكشف عن مواقف الليزر وخط الاتصال، مقابل عدد الصور.
  ملاحظة: الوظيفة حفظ الرسم البياني الذي يمثل موقف العينة، وموقف الليزر مقابل عدد الصور (الشكل matlab، jpg)، كيموجراف (صورة tiff) وكيموجراف مع موقف الليزر (صورة tiff). لتجارب فخ مطرد، قد كيموجراف القيام بذلك يدوياً، على سبيل المثال باستخدام إيماجيج. ثم يمكن أن يتم الكشف عن الواجهة من كيموجراف استخدام نفس الخوارزمية.

7. القياسات الميكانيكية

القياسات وصلابة والتوتر
1. القيام بتجربة التذبذب (الخطوة 6.1) وتحليل المقابلة (الخطوة 6.3) الفيلم انقضاء الوقت.
2. ارسم موقف واجهة كدالة للموقف فخ استخدام Matlab ارسم الدالة أو أية بيانات التخطيط للبرامج.
  ملاحظة: وهذا ينبغي أن تكون خطية تقريبا.
3. القيام خطي تناسب، باستخدام Matlab أدوات الحرة "ازفيت" أو أي برنامج يسمح ليناسب. يوفر معكوس المنحدر لتناسب متوسط نسبة .
4. إجراء تقديرات لتصلّب الانحناء الظاهر من الواجهة، والتي، على افتراض التشوهات الصغيرة ومن الدرجة الثانية المحتملة للملائمة، وترد عليه . هو تصلب فخ (راجع الخطوة 8 لفخ صلابة المعايرة).
5. إجراء تقديرات للتوتر، والتي يمكن تعريفها بأنها²³:
  .
قياسات انسيابية
1. إجراء تجارب إطلاق سحب (الخطوة 6، 2) وتحليل المقابلة (الخطوة 6.3)
2. تناسب المنحنى الناتج مع نموذج مخصص انسيابية.

8-معايرة صلابة فخ

ملاحظة: تحديد القوى المطلق يتطلب المعرفة بصلابة فخ على الواجهات. وهذا يمكن الوصول إليها باستخدام الخرز عن طريق إجراء خطوتين.

تحديد اللزوجة سيتوسول
1. وضع الأجنة في الهالوكربون النفط وحقن لهم باستخدام إعداد microinjection مع الخرز البوليسترين الفلورسنت (1:1، 000 إضعاف الأسهم، قطرها ميكرومتر 0.46)²³^،²⁷.
2. وضع الأجنة حقن تحت المجهر.
3. تتبع حركة الخرز واحدة وجدت في سيتوسول. استخراج متوسط مربع تشريد الخرز (استخدام عدد كبير من المسارات > 100 الخرز). تحديد ثابت نشر حبة من منحدر تشريد متوسط مربع. المتعلقة بنشر ثابت اللزوجة بمعادلة اينشتاين ستوكس، نستنتج لزوجة سيتوسول فعالية. في الجنين المبكر، هو لزوجة لما يقرب من 3.5 Pa.s عنها²³.
تحديد صلابة فخ على الخرز
1. فخ الخرز واحد في سيتوسول مع ملاقط بصرية.
2. نقل حبة بطريقة متدرجة بين هذين الموقفين فخ مفصولة 0.5 ميكرومتر
3. تحديد صلابة فخ على الخرز، كالنسبة بين معامل السحب ووقت الاسترخاء حبة من موقف مصيدة واحدة إلى أخرى.
  ملاحظة: معامل السحب ، حيث هو اللزوجة العزم في (8.1) و دائرة نصف قطرها حبة. يتم الحصول على وقت الاسترخاء من أسي يلائم الموقف حبة، استخدام Matlab أو أي برنامج يسمح ليناسب. هي القيم النموذجية لتصلّب فخ 120 ±50 pN.µm^-1في 200 ميغاواط الليزر الإثارة.
تحديد صلابة فخ على واجهة الخلية
1. تركيز الليزر على خط اتصال، ويصرف عليه (على النحو المفصل في الخطوة 6). قياس السعة التشوه. يجب تكرار هذا على عدة خطوط الاتصال للحصول متوسط ممثل.
2. قارن تشوه المنتجة مع التي تحدثها الخرز دفعت ضد خطوط الاتصال. ولما تناسبا عكسيا مع صلابة فخ التشوه، نستنتج صلابة فخ الاتصالات المحمولة.
  ملاحظة: صلابة فخ الاتصالات خلية عادة عثر على 2 إلى 3 إضعاف أصغر من أن على الخرز (0.46 ميكرومتر القطر).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يبين الشكل 5 البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها بفرض حركة جيبية إلى الفخ. وتنتج الفخ انحراف الواجهة، كما يتضح من اللقطات 3 عرض واجهة المتعاقبة 3 مواقع (الشكل 5A)²³. الأفلام المسجلة تستخدم لتوليد كيموجراف (الشكل 5 (ب))، وكذلك يتم تحليلها لتحديد الموقف الذي واجهة مع القرار subpixel، استخدام ضبابي تناسب على طول اتجاه x لكل إطار. تتناسب في نظام التشوهات الصغيرة والمواقف الملا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ملاقط بصرية تسمح لإجراء القياسات الميكانيكية المطلقة في ظهارة الجنينية النامية مباشرة بطريقة غير الغازية. وبهذا المعني، فإنه يقدم مزايا أكثر أساليب أخرى مثل التذرية الليزر، التي هي الغازية وتوفير القياسات النسبية، والقوى المغناطيسية، التي تتطلب الحقن، أو قوة الاستدلال، الذي يعتمد على افتراضات قوية وأيضا تقدم نسبي القياسات.

ويتضمن البروتوكول بضع خطوات حاسمة. أولاً، كما قد تظهر العدسة الهدف الانحرافات اللونية، وأن يدفع فخ الليزر الكائن في "المصب"، من المهم للتأكد من أن يعوض ليزر الأشعة تحت الحمر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل العلاجات ايكيب منحة العلاجات DEQ20130326509، الوكالة الوطنية de la بحوث بلانك ANR "منحة"، ANR مورفور-11-BSV5-0008 (إلى ص-ف). نحن نعترف بفرنسا-بيويماجينج البنية التحتية تدعمها وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية (ANR-10-إينبس-04-01، «الاستثمارات في المستقبل»). ونحن نشكر ديتايليور برايس وموريتي كلود من البنية التحتية بيكسل--مكتب التحقيقات الفدرالي للمساعدة التقنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ليزر ألياف اليتربيوم LP ، 10 واط ، CW	IPG ليزر	YLM-10-LP-SC	بما في ذلك الموازاة LP: شعاع D = 1.6 مم وليزر التوجيه الأحمر
& Oslash ؛ 1/2 "مصراع الشعاع البصري	Thorlabs	SH05
أنظمة الجلفانومتر بقطر الشعاع الصغير	Thorlabs	GVS001	1 للإزاحة X ، 1 للإزاحة
Y 1D أو 2D Galvo نظام امدادات الطاقة الخطية	Thorlabs	GPS011	مقياسات الجلفانومتر
مزود الطاقة 2 عدسات f = 30 مم	تلسكوب مرحل Thorlabs	LB1757-B	بين 2 جالفا
عدسة f = 200 مم	Thorlabs	LB1945-B	2.5X عدسة تلسكوب
f = 500 مم	Thorlabs	LB1869-B	2.5X تلسكوب
مرآة بيضاوي الشكل حركية ذات الزاوية اليمنى مع فتحات قضيب قفص	Thorlabs	KCB1E
نظارات السلامة بالليزر Periscope Thorlabs ، عدسات خضراء فاتحة ، 59٪ نقل الضوء المرئي ، نمط عالمي	Thorlabs	LG1
45 درجة ؛ الهيئة العامة للتصنيع ، قطر 50.0 مم ، مرآة ساخنة	بصريات إدموند	# 64-470
باعث متعدد الفوتون HC 750 / S	AHF	HC 750 / SP
CompactDAQ هيكل	الوطنية	cDAQ-9178
C سلسلة وحدة إخراج الجهد الأدوات	الوطنية	NI-9263	وحدة الإخراج التناظرية
وحدة إدخال الجهد من سلسلة C	الأدوات الوطنية	NI-9215	وحدة الإدخال التناظرية
FluoSpheres المجهرية المعدلة بالكربوكسيل ، 0.5 وميكرو ؛ م ، فلورسنت أحمر (580/605) ، 2٪ مواد صلبة	ThermoFisher Scientific	F8812	معايرة حبات
C ++ (Qt) ملاقط			تم تطويرها بواسطة Olivier Blanc و Claire Chardès. الحل البديل: labview

حامل الأدوات بصرية محلية الصنع

المراجع

Lecuit, T., Lenne, P. -F., Munro, E. Force generation, transmission, and integration during cell and tissue morphogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27 (1), 157-184 (2011).
Heisenberg, C. -P., Bellaïche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
Sugimura, K., Lenne, P. -F., Graner, F. Measuring forces and stresses in situ in living tissues. Development. 143 (2), Cambridge, England. 186-196 (2016).
Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in cell & developmental biology. 55, 119-130 (2016).
Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. Journal of Cell Biology. 149 (2), 471-490 (2000).
Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
Ma, X., Lynch, H. E., Scully, P. C., Hutson, M. S. Probing embryonic tissue mechanics with laser hole drilling. Physical Biology. 6 (3), 036004(2009).
Hutson, M. S., Tokutake, Y., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
Bonnet, I., Marcq, P., Bosveld, F., Fetler, L., Bellaïche, Y., Graner, F. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9 (75), 2614-2623 (2012).
Etournay, R., Popović, M., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090(2015).
Rauzi, M., Lenne, P. -F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current topics in developmental biology. 95, 93-144 (2011).
Saha, A., Nishikawa, M., Behrndt, M., Heisenberg, C. -P., Jülicher, F., Grill, S. W. Determining Physical Properties of the Cell Cortex. Biophysical journal. 110 (6), 1421-1429 (2016).
Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental cell. 15 (3), 470-477 (2008).
Mitrossilis, D., Röper, J. -C., et al. Mechanotransductive cascade of Myo-II-dependent mesoderm and endoderm invaginations in embryo gastrulation. Nature Communications. 8, 13883(2017).
Campàs, O., Mammoto, T., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2013).
Serwane, F., Mongera, A., et al. In vivo quantification of spatially varying mechanical properties in developing tissues. Nature Methods. 14 (2), 181-186 (2017).
Chiou, K. K., Hufnagel, L., Shraiman, B. I. Mechanical stress inference for two dimensional cell arrays. PLoS computational biology. 8 (5), e1002512(2012).
Ishihara, S., Sugimura, K. Bayesian inference of force dynamics during morphogenesis. Journal of theoretical biology. 313, 201-211 (2012).
Brodland, G. W., Veldhuis, J. H., Kim, S., Perrone, M., Mashburn, D., Hutson, M. S. CellFIT: a cellular force-inference toolkit using curvilinear cell boundaries. PLoS ONE. 9 (6), e99116(2014).
Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 247-285 (1994).
Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. -F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
Clément, R., Dehapiot, B., Collinet, C., Lecuit, T., Lenne, P. -F. Viscoelastic Dissipation Stabilizes Cell Shape Changes during Tissue Morphogenesis. Current biology: CB. 27 (20), (2017).
Chardès, C., Ménélec, P., Bertrand, V., Lenne, P. -F. Setting-up a simple light sheet microscope for in toto imaging of C. elegans development. Journal of visualized experiments. 87, e51342(2014).
Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).
Cavey, M., Lecuit, T. Imaging Cellular and Molecular Dynamics in Live Embryos Using Fluorescent Proteins. Drosophila. 420, 219-238 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

مجهر الصفيحة الضوئية تشكل الأنسجة الاتصالات الخلوية-الخلوية قياس التوتر المناولة الخالية من الحبيبات الخواص الميكانيكية النسيج الجنيني

ميكانيكا خلية السبر مع ملاقط خالية من حبة الضوئية في الجنين المورفولوجية