تحليل البروتين الحيوي المجمعات تجميعها على والإفراج عن بيوسينسور بيولايير قياس التداخل باستخدام الطيف الكتلي والمجهر الإلكتروني

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لرصد الجمعية والتفكيك من توكسين الأنثراكس باستخدام قياس التداخل بيولايير (BLI). بعد التجميع/التفكيك على سطح بيوسينسور، تصدر مجمعات البروتين الكبيرة من على سطح الأرض للتصور وتحديد مكونات المجمعات باستخدام المجهر الإلكتروني والطيف الكتلي، على التوالي.

Abstract

البروتينات المجراة، غالباً ما تكون جزءا من المجمعات الجزيئات الكبيرة حيث خصوصية ملزم وديناميات تفرض في نهاية المطاف النواتج الفنية. في هذا العمل، هو توكسين الأنثراكس اندوسومال قبل تجميعها وانتقلت إلى اندوسومال المعقدة. أولاً، المجال الطرفي ن معامل الفتاكة متحولة سيستين (LF_N) مرفق بيوسينسور قياس التداخل (BLI) بيولايير عن طريق ثنائي كبريتيد اقتران في توجه أمثل، مما يتيح بربري مستضد واقية (السلطة الفلسطينية) لربط (ك_د 1 نانومتر). ثم يربط التوجه على النحو الأمثل LF_N-PA_{بريبوري} المعقدة القابلة للذوبان الشعرية morphogenic جين-2 (CMG2) الخلية السطحية مستقبلات (170 ك_د م)، مما أسفر عن مجمع اندوسومال قبل الجمرة الخبيثة ممثل، مستقر في درجة الحموضة 7.5. هذا المجمع تجميعها ثم يتعرض لممثل الحموضة (pH 5.0) البيئة دخلول الراحل إلى انتقال السلطة الفلسطينية_بربري إلى الدولة مسام الغشاء إدراجها. وينتج هذه الدولة_المسام السلطة الفلسطينية ضعف ربط بين مستقبلات CMG2 و LF_N-السلطة الفلسطينية في_المسام وتفكك كبير من CMG2 من المسام الانتقال. يتم عكس الايثير-إلحاق LF_ن على سطح بيوسينسور بسهولة من ديثيوثريتول. الحد على سطح biosensor BLI النشرات LF_N-PA_بربري-مجمع الثلاثي CMG2 أو الحمض انتقلت مجمعات_المسام LF_N-السلطة الفلسطينية إلى وحدات تخزين ميكروليتير. ثم تصور مجمعات المفرج عنهم والتعرف باستخدام المجهر الإلكتروني والطيف الكتلي. هذه التجارب لشرح كيفية رصد حركية التجميع/التفكيك مجمعات البروتين محددة باستخدام منهجيات BLI خالية من التسمية وتقييم الهيكل وتجميعها هوية BLI هذه المجمعات بالميكروسكوب الإلكتروني والإعلام قياس الطيف الكتلي، على التوالي، باستخدام إجراءات سهلة لتكرار متسلسلة.

Introduction

تحديد وفهم خصوصية الإدارة البروتين الجمعية المعقدة في فيفو الاهتمام الشديد للباحثين البيوكيميائية. التجميعات البروتين غير متجانسة كبيرة هي القاعدة وليس الاستثناء. هذا المفهوم معتمد بواسطة الرصد الطيفي للجمعية في فيفو ، عزل مجمعات استخدام تقنيات تعطيل الخلية الطف وتقييم المنتجات من أساليب تنقية المستندة إلى تقارب، وتصور لهم استخدام دقة عالية المجهر الإلكتروني المبردة (cryo-م). فهم التحكم في خصوصية الجمعية داخل الخلية، يجب أن الباحثين بشكل روتيني عزل وتحديد وتميز هذه الهياكل من تجميع أو تفكيك دينامية في نهاية المطاف. الأداة الجزيئية الأكثر استخداماً لتحديد العناصر المكونة لهذه الجمعيات وكثيراً ما يتطلب المستندة إلى جسم إيمونوبريسيبيتيشن، الذي يعتمد على الحفاظ على استقرار معقدة أثناء تعطيل الخلية. ووضعت مختلف التقنيات التحليلية إلى جانب مؤخرا لالتقاط المجمعات من عينات الخلايا باستخدام موائع جزيئية على أساس النهج، مثل الرنين السطحية مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة). بعد إزالة من الأسطح موارد البرنامج الخاصة، تم تحليل هذه العينات بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين وقت الرحلة (استخدام-TOF)^1،2. النهوض بهذه المنهجية باستخدام بروتوكولات أسهل سيتيح الباحثين إلى تصور والتحقق من مجمعات المتوقعة التي تحدث في الوسط الخلوي. نظراً لموارد البرنامج الخاصة نظام قائم على ميكروفلويديكس، وكثيراً ما تنشأ المشاكل عن تشكيل التجميعية. التحايل على هذه المشكلة يتطلب تخفيف العينة، التي يمكن أن تقلل بدورها سلامة مجمعات التركيز البيولوجي مسؤولاً.

النهوض حديثة نسبيا في تكنولوجيات خالية من التسمية هو تطوير نظام قياس التداخل (BLI) بيولايير³. هذه خاصة الانعكاس الضوء على محاكاة النظم نسخ متماثل، أو أفضل، وربط موارد البرنامج الخاصة ونتائج الحركية في جزء صغير من^3،تكلفة⁴ خاصة إذا استخدمت وحدات قناة واحدة. BLI يقيس التغيرات في أنماط التدخل الضوء المنعكس بين طبقة مرجع (المراقبة) والسطح بيولايير (تجريبية). يتم قياس التغير الناتج في المرحلة في الوقت الحقيقي ك قراءات الحركية والكمية⁵. السطح بيوسينسور، الذي يحتوي على التثبيت محددة كيمياء، منقولا ماديا بين الحلول، بدلاً من المخزن المؤقت تغييرات النهج موائع جزيئية في موارد البرنامج الخاصة، للقياس عن طريق الطول الموجي أو المرحلة. آثار نقل أسلحة ممنوعة بالتحريض الحل. وخلافا لموارد البرنامج الخاصة، هذه النظم مفيدة للغاية في تقييم المجمعات من العينات البيولوجية الخام. المعلمة الفعلي يقاس أثناء تجارب BLI أساسا يعتمد على إجراء تغيير في كتلة أو سمك على السطح بيوسينسور الذي ينتج من البروتين مجمع التجميع أو التفكيك.

هذه الألياف البصرية أجهزة استشعار العوامل البيولوجية سهلة الاستخدام وغير مكلفة نسبيا. أحد جوانب مفيدة الناشئة من BLI هو إزالة السطحية من مجمعات البروتين المجمعة حديثا من على سطح الأرض. تطبيق هذا الأسلوب يسمح مختبرنا الأخيرة التقيد الوقت الحقيقي حركية كبيرة مقياس الأس الهيدروجيني الناجم عن إعادة ترتيب هيكل البروتين المكون مستضد واقية (السلطة الفلسطينية) والتكسينية الجمرة الخبيثة كما بربري (السلطة الفلسطينية_بربري) انتقلت إلى ما نموذج المسامية (السلطة الفلسطينية_المسام). تم التحقق من هذا التحول على الحافة بيوسينسور باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني (م)⁶. ويتجنب إزالة المجمعات من السطوح بيوسينسور أكبر حجم تخفيف آثار كثيرا ما تصادف عند الإفراج عن مجمعات من سطوح شرائح عند استخدام النظم ميكروفلويديكس.

في العمل الحالي، الجمرة الخبيثة السمية مجمعات تجميعها وتفكيكها على سطح بيوسينسور وثم أفرج عنه في مجلدات ميكروليتير. يتم التحقق من صحة المكونات المعقدة الناتجة عن استخدام أورثوجونالي م والطيف الكتلي (مللي ثانية).

Protocol

1-جمعية مجمعات الجزيئات المحددة على السطوح بيوسينسور بيولايير قياس التداخل (BLI)

1. جمعية توكسين الأنثراكس بربري المعقدة على سطح بيوسينسور رد الفعل تعديل لوكالة مكافحة المخدرات الفلبينية أمين
   1. هيدرات أمين رد الفعل تلميح biosensor BLI جيل (AR2G) الثاني في 250 ميليلتر من الماء لمدة عشر دقائق.
   2. برنامج مرات الخطوة، المدرجة في الجدول 1، على برنامج مراقبة وحدة BLI (انظر الجدول للمواد).
   3. بدء BLI تديرها غمر طرف biosensor في 250 ميليلتر الماء لمدة 30 ثانية لقياس خط أساس أولية وسمك بيوسينسور والكثافة.
   4. تنشيط في بيوسينسور بتخبط في التلميح إلى 250 ميليلتر دائرة الصحة الوطنية (N-هيدروكسيسوكسينيميدي) 50 و 200 ملم تنمية الصادرات (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) لمدة سبع دقائق.
   5. تزج biosensor المنشط في 50 ملم وكالة مكافحة المخدرات الفلبينية (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) حله في م 0.1 بورات المخزن المؤقت (pH 8.5) لمدة 5 دقائق لتوليد سطح ثيول المتفاعلة المنشط.
   6. تزج biosensor ثيول المتفاعلة المنشط في 250 ميليلتر من محلول يحتوي على 100 نانومتر LF E126C_ن في الأس الهيدروجيني اسيتات 10 ملم الصوديوم 5.0، 100 ملم كلوريد الصوديوم، المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق.
   7. تزج نصيحة LF_N في 50 مم L-سيستين، 1 "م كلوريد الصوديوم"، خلات الصوديوم 0.1 M، pH 5.0، لمدة 4 دقائق، إخماد أي جماعات ثيول المتفاعلة الحرة رد الفعل المتبقية.
   8. تزج نصيحة LF_ن كوينتشيد في 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم لمدة دقيقتين إنشاء خط الأساس في المخزن المؤقت.
   9. تزج نصيحة LF_ن قوينتشيد إلى 0.5 ميكرومتر مستضد واقية بريبوري (_{بريبوري}من السلطة الفلسطينية)، 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم لمدة 5 دقائق لإنشاء المجلة_N-PA_{بريبوري} المعقدة.
   10. ويرتبط مرة السلطة الفلسطينية_بربري ، إزالة التلميح من الحل_بربري السلطة الفلسطينية وتزج التلميح إلى 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم لمدة 30 ثانية ليغسل أي السلطة الفلسطينية عدم التحديد منضم_بربري.
   11. تزج LF_N-PA_بربري المعقدة إلى 0.5 ميكرومتر CMG2 مستقبلات (دون المجال transmembrane)، 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم، لمدة 5 دقائق.
   12. تزج المجلة_N-PA_بربري-CMG2 المعقدة في 50 ملم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم لمدة 30 ثانية ليغسل أي CMG2 غير منضم إلى النموذج اندوسومال قبل مجمع.
   13. لتحليل م، إطلاق سراح LF_N-PA_{بريبوري}-CMG2 معقدة من طرف بيوسينسور بتخبط في التلميح إلى 5 ميليلتر من 50 مم DTT، 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم، داخل أنبوب PCR.
   14. لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد جنبا إلى جنب من الببتيدات من المجمع، إطلاق سراح LF_N-PA_بربري-أنبوب جوكل (الكيراتين خالية)، 25 مم بيكربونات الأمونيوم pH 8.0 داخل بكر CMG2 معقدة من طرف بيوسينسور بتخبط في بيوسينسور إلى 5 ميليلتر 50 مم DTT، م 6 . وهذا يتم في بيوسينسور مختلفة عن تلك المستخدمة لتحليل م.
2. جمعية توكسين الأنثراكس المسامية معقدة على سطح بيوسينسور رد الفعل تعديل لوكالة مكافحة المخدرات الفلبينية أمين
   1. لعرض المجمع بعد انتقال درجة الحموضة، نفذ الخطوات 1.1.1-1.1.12 في المقطع السابق لتوليد LF_N-PA_{بريبوري}-مجمع CMG2.
   2. تزج نصيحة بيوسينسور في الرقم الهيدروجيني اسيتات 10 ملم 5.0 لمدة 5 دقائق لبدء المرحلة الانتقالية للسلطة الفلسطينية_بربري لانتقال السلطة الفلسطينية_المسام . تتم الإشارة إلى هذا الانتقال عن طريق زيادة السعة (حوالي 0.2 nm) أعقبه انخفاض سعة أكبر الذي هو الافتراض بأن الانفصال مستقبلات كبيرة أو كاملة نظراً لتقلص تقارب ملزم.
   3. تزج نصيحة_المسام LF_N-PA 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم، pH 8.0، لمدة 30 ثانية يغسل العازلة الحمضية.
   4. للحصول على نموذج تحليل م، تزج نصيحة بيوسينسور في محلول يحتوي على المذيلات 1.25 مم (2.5 ملم MSP1D1، 25 مم نا-تشولاتي، مم 162.5 بوبك) لمدة 5 دقائق لمنع التراكم في الحل بعد إصدار ثنائي كبريتيد.
   5. لتحليل م، الإفراج المجلة_N-السلطة الفلسطينية_{المسام-}مذيل معقدة من طرف بيوسينسور بتخبط في التلميح إلى 5 ميليلتر من 50 مم DTT، 50 مم تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم داخل أنبوب PCR.
   6. لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد جنبا إلى جنب من الببتيدات من المجمع، الإفراج عن المجلة_نالسلطة الفلسطينية-_بور معقدة (لا مذيل) من بيوسينسور نصيحة من أغرق في بيوسينسور إلى 5 ميليلتر 50 مم DTT، 6 م جوكل (الكيراتين خالية)، 25 مم بيكربونات الأمونيوم pH 8.0 داخل بكر أنبوب. وهذا يتم في بيوسينسور مختلفة عن تلك المستخدمة لتحليل م.

2-تصور والتحقق من صحة إصدار التجميعات الجزيئات من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية BLI بالميكروسكوب الإلكتروني وصمة سلبية

1. توهج أداء شبكة Cu 300 المغلفة بالكربون. توهج نموذجية التفريغ الإعدادات هي 0.38 [مبر] جو مستقر الضغط والسلبية مامبس 15، 20 ثانية، ثم التنفيس مع الهواء.
2. تأمين الشبكة بين زوج من ملاقط نظيفة.
3. "الماصة؛" 4 ميليلتر من عينة معقدة المفرج عنهم في أنبوب بكر على الشبكة وتسمح الامتزاز ل 60s.
4. فتيلة بعيداً المتبقية السائل مع آسفين ورق الترشيح.
5. وصمة عار الشبكة من بيبيتينج ميليلتر 5 0.75% ميكرون 0.02 تصفيتها اليورانيل فورمات وفتل وصمة عار الزائدة بعيداً بعد 5 ثوان. تسمح الشبكة لتجف في درجة حرارة الغرفة.
6. عرض الشبكات عينة ملطخة باستخدام مجهر إلكترون انتقال.

3-تحديد كاملة قبل اندوسومال "الجمرة الخبيثة السمية المعقدة" (LF_N-Pa_بربري-CMG2) وانتقلت المعقدة (LF_N-Pa_المسام دون CMG2) "باستخدام قياس الطيف الكتلي".

1. تمييع عينات تم إصدارها إلى 20 ميليلتر واحتضان لمدة ساعة واحدة.
2. إضافة 2 ميليلتر إيودواسيتاميدي 55 مم، 25 مم بيكربونات الأمونيوم، pH 8.0، واحتضان لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة في الظلام (مغطاة برقائق الألومنيوم).
3. تمييع العينة مع 100 ميليلتر من 25 مم بيكربونات الأمونيوم، pH 8.0، لخفض تركيز هيدروكلوريد غوانيدين أدناه م 1.
4. إضافة 5 ميليلتر من تسلسل الصف تعديل التربسين في 20 نانوغرام/ميليلتر واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
5. إضافة حمض الخليك الجليدية إلى تركيز 5% للحد من درجة الحموضة إلى نهائي < 3، قم بتقليل الحجم إلى 10 ميليلتر في فراغ المكثف.
6. نقل الحل الببتيد إلى لوحة عينة على أوتوسامبلير أوهبلك 1200 مؤتمر العمال النيجيري.
7. تحميل 5 ميليلتر محلول الببتيد على عمود مرحلة عكس أوهبلك التي شنت على مرحلة التأين MS.
8. أغسل العمود مع 15 ميليلتر من حمض الفورميك 0.1% بمعدل 5 μلتر في الدقيقة كحد أقصى و/أو الضغط الأقصى من 800 رطل/بوصة مربعة.
9. الوت الببتيدات من عمود C18 المرحلة عكس معدل تدفق من 350 nL/دقيقة على مدى فترة 90 دقيقة باستخدام تدرج مباشر من 5% إلى 40% مذيب ب في ألف + باء (حمض الفورميك 0.1% ج: المذيبات؛ المذيبات باء: 95% من الاسيتو الانيتريل مع حمض الفورميك 0.1%).
10. تحليل الببتيدات التينج على الخط باستخدام MS جنبا إلى جنب.
    1. تعيين مصدر التأين إلى 2500 فولت وأيون نقل الحرارة إلى 250 درجة مئوية.
    2. تعمل مطياف كتلة تحت التحكم التلقائي بإجراء فحص مرض التصلب العصبي المتعدد باستمرار واحدة تليها العديد من الترادف MSMS قدر الإمكان في فترة ق 3، استخدام إدارة البحث الجنائي وطاقة اصطدام مسواة من 35.
11. تحديد المكونات الببتيد والبروتين باستخدام الطرق القياسية. وأجريت لهذا العمل، ومجموعتين من تحليل الببتيد والبروتين.

Results

القدرة على رصد والتحقق من الجمعية العامة للمجمعات الجزيئات الكبيرة خطوة حاسمة نحو فهم خصوصية ووظائف التجمعات الجزيئية البيولوجية الكبيرة. تدل نتائج الأساليب المقدمة في هذه الوثيقة السهولة مع مجمعات البروتين الكبيرة التي (> 150 كاتشين الشامل) يمكن تجميعها باستخدام قياس التداخل بيولايير، حين رصد حركية والسعة للجمعية جميع. طبيعة الاتفاق فريدة من نوعها على سطح biosensor يتيح تحليل الجمعية تمدد بالإفراج عن مجمعات المجتمعون في ميكروفولوميس الصغيرة. يمكن استخدام هذه ميكروفولوميس لتصور الهيكل المادي الأولى من المجمعات استخدام EM والتحقق من هوية عناصر معقدة باستخدام MS. ويرد في الشكل 1نظرة تخطيطي لهذه العملية برمتها.

عنصر أساسي لنجاح الجمعية والتحقق من الجزيئات المعقدة على سطح بيوسينسور ينطوي على التوجه السليم للبروتين البذور الأولى. وهذا يضمن أن مواقع التفاعل البروتين-بروتين موجوداً ولا ستيريكالي المحظورة والمتمركزة على النحو الأمثل بعيداً عن السطح بيوسينسور. كما هو مبين في الشكل 2، يتحقق التوجه السليم من توكسين الأنثراكس معقدة باستخدام جزء الطرفي ن على وجه التحديد هندسيا عامل المميتة (LF_N) حيث يتم دائماً وضع الموقع ملزم_بربري LF_N-السلطة الفلسطينية عكس بيوسينسور التساهمية مرفق الموقع^6،7. في نهاية المطاف يخلق تراكم اللاحقة للمجمع وملزمة للسلطة الفلسطينية إلى biosensor BLI_ن LF متبوعاً القابلة للذوبان CMG2 ملزم للسلطة الفلسطينية من توكسين الأنثراكس مختصة إزفاء المعقدة.

التتبع سينسوجرام BLI قراءة في الوقت الحقيقي من التغييرات السعة بسبب إضافة محددة من المكونات السمية الجمرة الخبيثة كما أنها تضاف إلى بيوسينسور. يظهر الشكل 3 تتبع ممثل إقران مع توقع نموذجا للمجمع إلى النموذج في هذه الخطوة في العملية. هو أول ارتفاع LF_ن التحميل على التلميح. بعد تبريد وخط الأساس، السلطة الفلسطينية_بربري ثم يربط LF_N متبوعاً بإضافة مستقبلات CMG2 القابلة للذوبان الناتجة في مجمع اندوسومال قبل تجميعها LF_N-PA_بربري-CMG2. أن التقدم نحو البيئة دخلول الراحل، تعرض المجمع بأكمله لنبض انخفاض درجة حموضة (pH 5.0) أن يضعف مستقبلات ملزم، بما يسمح بريبوري للانتقال إلى ما تكيف مسام الغشاء الموسعة إدراج. ⁶ تظهر آثار سينسوجرام لهذه الخطوة التحمض في الشكل 4. الزيادة الأولية أو 'سبايك' في السعة من المحتمل تمديد المسام⁶ التي يجب أن تحدث قبل الانخفاض في ربط مستقبلات CMG2. انخفاض السعة الأكبر الأكثر احتمالاً تفارق مستقبلات كبيرة أو كاملة بسبب تقارب ملزم تقلص. العمل السابقة في هذا المختبر أشارت إلى CMG2 ملزم للسلطة الفلسطينية تماما تمديد_المسام لا يكاد يذكر مقارنة ب تفاعل_{بريبوري} CMG2-PA⁶. وباﻹضافة إلى ذلك، لاحظ تتبع الحركية سينسوجرام، في سينسوجرامس كل من LF_N-PA_بربري-التحولات CMG2 للمجلة_N-PA_المسام مع انخفاض درجة حموضة، استنساخه على تشغيل متعددة.

قبل وبعد التحميض، تصدر مجمعات بيوسينسور تعلق بسهولة للتصور بوصمة سلبية م وتحديد الهوية بواسطة MS (الشكل 5). وترد في الشكل 6مجمعات تمثيلية من نتائج م. إظهار شبكات العينة قبل اندوسومال، كثافة متسقة مع سليمة مجمعات ثلاثية تتكون من LF_N-PA_بربري-CMG2. بعد التحميض الشبكات المعقدة، وتظهر السلطة الفلسطينية انتقلت إلى المسام وسولوبيليزيد بإدراج مذيل بكثافة CMG2 واضحة لا.

تم التحقق من هويات ما قبل والمجمعات بعد التحميض بمرض التصلب العصبي المتعدد. قاعدة بيانات حيث تسلسل السلطة الفلسطينية، P13423؛ LF_ن، P15917؛ وأدرجت في خلفية من قاعدة بيانات الماوس البروتينات المشتقة من مستودع نكبينر CMG2، P58335. تم الحصول على البروتينات فقط لمصلحة من هذا البحث قاعدة البيانات الأولى، مع تغطية الأحماض الأمينية التالية للمجمعات ثلاثي وثنائي: 54% و 22% للسلطة الفلسطينية، 36% ونسبة 6 في المائة للقوات البرية و 43 في المائة ل CMG2، على التوالي (CMG2 لم يتم الكشف عنه في المجمع ثنائي). بغية تحقيق أقصى قدر من التغطية من الأحماض الأمينية البروتين، أجرى تعريف بروتين ببتيد/ثانية باستخدام قاعدة بيانات بروتين تحتوي على البروتينات ثلاثة فقط من الفائدة. عينات قبل اندوسومال مرض التصلب العصبي المتعدد الواردة الببتيدات من كافة المكونات السمية الثلاثة مع 60.46% و 67.97% و 54.15% تغطية LF_N، والسلطة الفلسطينية، و CMG2، على التوالي (الشكل 7). نتائج اندوسومال بوست، هو مبين في الشكل 8، لا يتضمن إلا الببتيدات من LF_ن والسلطة الفلسطينية (التغطية 57.41% و 67.79%، على التوالي). عدم وجود CMG2 في عينات اندوسومال وظيفة تتماشى مع النقصان نانومتر BLI لوحظ أثناء تشكيل المسام.

رقم 1- تجميعها في نظرة عامة التخطيطي لتحليل البروتين المجمعات ومعزولة عن biosensor BLI استخدام EM والسيدة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2- تفعيل بيوسينسور: الخطوة الأولى في اتجاه الجمعية المحددة في BLI biosensor. ويرتبط المجال عامل الفتاكة E126C ن--المحطة الطرفية، (LF_N) من خلال ارتباط الايثير إنشاء السلطة الفلسطينية ملزمة_بربري واجهة الموجه بشكل صحيح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3- رصد الجمرة الخبيثة السمية الجمعية والتفكيك مع BLI: سينسوجرام يبين التغييرات السعة كدالة للوقت بسبب إضافة محدد من الجمرة الخبيثة المكونات السمية كما يتم إضافتها إلى بيوسينسور بدءاً من تحميل المجلة_N (الخطوة 4 في الجدول 1). ثم يتم تحميل السلطة الفلسطينية_بربري على السطح تليها إضافة مستقبلات CMG2 القابلة للذوبان. ويتكون المجمع اندوسومال قبل تجميعها من LF-PA_{بريبوري}-CMG2. إلى التقدم نحو البيئة دخلول الراحل، تجميع الكامل الوظيفية الجمرة الخبيثة السمية، يخضع لدرجة حموضة منخفضة نبض (pH 5.0) أن يضعف مستقبلات ملزم، مما يسمح بربري للانتقال إلى ما تكيف مسام الغشاء الموسعة إدراج. وأكد تعرض الأغشية التي تغطي المسام و solubilized بإضافة المذيلات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4- سينسوجرام BLI CMG2 الإصدار: تظهر آثار هذه الخطوة التحمض زيادة أولية أو 'سبايك' في السعة أعقبه انخفاض سعة كبيرة التي من المرجح المسام تشكيل ومستقبلات الانفصال، على التوالي. عمودي منقط الخطوط الحمراء تدل على بداية خطوة جديدة. يتم محاذاة سينسوجرامس الغامق خط أحمر منقط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5- تحليل البروتين المجمعات تجميعها على ومعزولة عن biosensor BLI استخدام EM ومرض التصلب العصبي المتعدد: Biosensor مجمعات المرفقة يتم إصدارها بسهولة إلى 5 ميليلتر من المخزن المؤقت الذي يحتوي على القيمة لتحديد الهوية بواسطة السيدة والتصور بوصمة سلبية م الرجاء النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 6- التصور من البروتين المجمعات مع م: شبكات العينة قبل اندوسومال، إظهار كثافة متسقة مع سليمة مجمعات ثلاثية تتكون من LF_N-PA_بربري-CMG2. اندوسومال وظيفة الشبكات المعقدة، وتظهر السلطة الفلسطينية انتقلت إلى المسام و solubilized من مذيل بكثافة CMG2 واضحة لا. نماذج مجمعات المتوقعة (الجانب الأيسر) على نفس النطاق كالجسيمات الفردية هو مبين. جسيمات ملونة مع توقع البروتين (استناداً إلى حجم الكثافة م) ترد أدناه كل الجسيمات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 7- التحقق من البروتين المجمعات مع مرض التصلب العصبي المتعدد: الوارد عينات قبل اندوسومال مرض التصلب العصبي المتعدد الببتيدات من كافة المكونات السمية الثلاثة مع 60.46% و 67.97% و 54.15% تغطية LF_N، والسلطة الفلسطينية، و CMG2، على التوالي. الببتيدات الكشف عن معدل اكتشاف كاذبة (FDR) مساوية أو أعلى من 5% تظهر باللون الأصفر، فرانكلين روزفلت مساوية أو أكبر من 1% تظهر باللون الأخضر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 8- التحقق من البروتين المجمعات مع مرض التصلب العصبي المتعدد: اندوسومال بوست الببتيدات العينات الواردة من LF_ن والسلطة الفلسطينية (التغطية 57.41% و 67.79%، على التوالي)، لكن لا CMG2. فرانكلين روزفلت مساوية أو أعلى من 5% تظهر باللون الأصفر، فرانكلين روزفلت مساوية أو أكبر من 1% تظهر باللون الأخضر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الخطوة	الوقت (s)	الوصف
1	30	الأساس الأولى
2	420	التنشيط
3	300	التنشيط
4	300	LFن تحميل
5	240	الطفايات سيستين
6	120	خط الأساس
7	300	رابطةبريبوري السلطة الفلسطينية
8	30	خط الأساس
9	300	رابطة CMG2
10	30	خط الأساس
11	300	انتقال حمض
12	30	خط الأساس
13	300	رابطة مذيل

الجدول 1- أوقات خطوة واحدة تشغيل BLI للجمعية توكسين الأنثراكس المعقدة. لاحظ أنه يتم استخدام خطوط الأساس يغسل البروتين غير منضم من الخطوة السابقة و/أو وضع خط أساس جديد في المخزن مؤقت.

Discussion

يوضح هذا العرض التوضيحي كيف يمكن رصد تشكيل الجزيئات المعقدة بسهولة باستخدام قياس التداخل بيولايير، تصور استخدام EM، والتحقق منها مع مرض التصلب العصبي المتعدد، مع كل من ميكروفولوميس في فترة زمنية قصيرة. هيكلية الجمعية ومجمعات لوحظ متابعة التوقعات ذات الصلة بيولوجيا، كذلك التحقق من صحة هذه المنهجية المشتركة. كما هو مذكور في المقطع النتائج، يتطلب العنصر الرئيسي لنجاح الجمعية الطفرات سيستين هندسيا عقلانية لضمان أن الواجهات المعقدة بالبروتين البروتين تتجه بشكل صحيح بعيداً عن السطح بيوسينسور.

النظم السابقة استخدمت تقنيات BLI ومرض التصلب العصبي المتعدد لتقييم البروتين ملزمة لأنظمة المكونات اثنين وثلاثة وكذلك سلامة ملزم مستقبلات البروتين المعرب عنها، ولكن، في كلتا الحالتين، لم تتطور الأساليب الاستفادة من جنبا إلى جنب م/MS نهج^8،9. وكان فقط قياس التداخل بواسطة نظام آخر يجمع بين تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد للمساعدة في وصف التفاعلات التداخلي الاستقطاب المزدوج¹⁰. ولسوء الحظ، لم يعد هذا النظام متاح للاستخدام العام. وكما ذكر في المقدمة، كانت هناك عدد من الدراسات التي أنجزت فيها تشكلت على السطوح بيوسينسور موارد البرنامج الخاصة مثل عينات وإزالتها من تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. أيا من تلك الأمثلة أدت إلى المجمعات تصور استخدام EM.

القيود المفروضة على هذا الأسلوب متتابعة يمكن أن تكون عديدة ولكن قابلة للحل. للتثبيت الأولى وذلك خطوة مؤسسة للجمعية، سيعوق الافتقار إلى المعرفة بأسطح التفاعل الهيكلية التأكيد التقدم المرتبطة برصد المراحل الأولى من الجمعية العامة. الافتقار إلى هيكل المعلومات يمكن معالجتها من خلال تصميم تصميم بناء مؤسسة حيث كيمياء مرفق (مثل سلفهيدريل moiety للروابط ثنائي كبريتيد/صاحب معلم الموضع) يمكن نقلها إلى مناطق مختلفة داخل نواة نظام الجمعية. في حالة توكسين الأنثراكس المعقدة، كان محظوظاً بأن هيكل LF_ن ملزمة للسلطة الفلسطينية_{بريبوري} هو متاح¹¹. وكان المترجمة الرشيد موضع سيستين هندسيا إلى المناطق البعيدة عن وجه السلطة الفلسطينية ملزمة_بربري . مع كيمياء سيستين الربط، فمن الأفضل أن لا سيستينيس رد الفعل أخرى موجودة على سطح البروتين.

وهناك كيمياء مرفق المختلفة التي يمكن استخدامها لمهندس موقع مرفق محدد على الأسطح للبروتين. أحد المرفقات المحددة الأكثر شعبية ينطوي على تحديد المواقع مجموعة بيوتين في مكان محدد على سطح البروتين¹². ولسوء الحظ، ملزمة البيوتين إلى ستريبتافيدين أو عبدين مغلفة الأسطح ضيق للغاية. انعكاس للتفاعل الملزمة ليست بسيطة. استخدام هندسيا له-علامة في المحطة N أو ج وسهولة اللاحقة من المرفق إلى الأسطح ني-الإدارة الوطنية للسياحة تطبيق عالمي أكثر من تجميد التقارب. وبطبيعة الحال، واحدة من المحاذير للجمعية مرفق المواقع الهندسية مع نظم صاحب معلم هو اشتراط أن ن-وج-تيرميني للبروتين الجمعية الأساسية تظل مكشوف وفصل حيث أن المرفق سهل. مع جميع عمليات الجمعية، واجهة التفاعل من البروتين الجمعية الأساسية يجب أن تظل متاحة كما تقدم الجمعية المعقدة.

ربما القلق الأكثر شيوعاً لاستخدام كيمياء السطح biosensor ملزمة غير محددة. نصائح ستريبتافيدين غالباً ما تكون مصدرا لآثار كبيرة غير محددة ملزمة. ثنائي كبريتيد المرتبطة البيوتين يمكن استخدامها للإفراج عن مجمعات محددة جداً تاركين وراءهم الربط S-البيوتين تخفيض أحكام ملزمة ل أجهزة استشعار العوامل البيولوجية streptavidin المعطل تداولها¹³. وهناك أخرى كيمياء عكسها تصبح متاحة مثل إيمينوبوروناتيس، وإلى حد أقل كيتواميدي¹⁴. هذا الحقل حاليا المتخلفة، ولكن هناك ارتفاع الفوائد في مواصلة تطوير البروتوكولات التساهمية عكسها لتجنب آثار سمية المخدرات خارج الهدف التي تصاحب عادة استخدام المخدرات تستهدف التساهمية التنمية.

حد من استخدام EM لتصور المجمعات هو التفسير، لا سيما في الحالات حيث هياكل المجمعات المجتمعين ليست معروفة في البداية. يمكن تحديد الموقع المكاني للمكونات داخل مجمع الجزيئات مجمعة غير معرف باستخدام الأجسام المضادة (ماب) كعلامات حركية وهيكلية محددة. على سبيل المثال، حالما يتم تشكيل مجموعة معقدة، الأجسام المضادة يمكن إضافة أن ربط مكونات محددة. كثيرا ما يستخدم هذا الأسلوب في م لتحديد مكونات محددة داخل التجمعات الكبيرة¹⁵. قيد آخر مرتبط بحجم المجمع، رغم أنه كانت هناك حالات حيث حل الجمعيات متماثل تعريف صغيرة كما كاتشين 70 (جروس هيبتامير) يتم بسهولة باستخدام سلبية وصمة عار م. عادة ما تكون مجمعات المجمعة التي يتم تحليلها بواسطة EM في نطاق الحجم ~ 100 Å في القطر أو أعلاه. مؤخرا ولكن البروتينات صغيرة كاتشين 20 قد تم حلها وتم الحصول على هياكل منخفضة الدقة عند استخدام متفوقة تلطيخ منهجيات¹⁶.

لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد، ويمكن زيادة حساسية الأجهزة MS الحالية وصولاً إلى مستوى فيمتومولار (أتوموليس) في بعض الحالات زيادة حساسية الكشف BLI. وتصور الغاية أن إشارات البروتين التي تظهر ارتفاع الحد الأدنى ولكن قابل للتكرار في الاتساع سيؤدي إلى تحديد البروتين في السؤال. وباﻹضافة إلى ذلك، سبر تفاعلات البروتين البروتين مع أحد الشركاء يعلق بيوسينسور والآخر في بيئة خلوية سيؤدي إلى سارية المفعول في تنقية والكشف بعد الأسهل مجمع المنشأة حديثا. حد واحد التي قد تلاحظ مع النظم الراهنة لمرض التصلب العصبي المتعدد حساسة للغاية هي أن بروتين الفائدة قد لا تكون في قاعدة البيانات، ولكن هذه الملاحظة نادرة (مثلاً، بروتيوميس من الأنواع النادرة). وإذا كانت معروفة في تسلسل البروتينات ذات الاهتمام، هو حل هذه المشكلة بسهولة بما في ذلك تسلسل الأحماض الأمينية protein(s) في قاعدة بيانات بروتين خلفية (كما هو موضح في هذا العمل في قسم البروتوكول). قيد محتمل آخر النتائج المنهجية من المقاومة للبروتين تريبسينوليسيس. التربسين الهضم هو عادة الأسلوب الافتراضي لتحديد البروتين من الأسفل. بيد أن البروتينات قد تكون مقاومة التربسين إذا أنها تفتقر إلى الأرجنتين و Lys مخلفات أو يتم تقييد الوصول إلى هذه المخلفات بهيكل مطوية. يتم حل هذه القيود، على التوالي، باستخدام مزيج من البروتياز أو بديل أو بما في ذلك كاشف تتكشف (اليوريا أو غوانيدين HCl، كما هو مبين في 1.1.14 و 1.2.6) قبل الهضم الأنزيمي.

وتشمل التوسعات الممكنة لهذه المنهجية مما يسمح للمستخدم بتتبع وتحديد المجمعات الجمعية الخلوية من النفط الخام ليساتيس الخلوية. وتبين التجارب لمكونات الجمعية تتركز مقتطفات الخلوية من السهل القيام باستخدام إجراءات قياس التداخل بيولايير. خلافا موائع جزيئية أكثر استخداماً على أساس المنهجيات التي عرضه لانسداد وحساسية للتجميع، يمكن استخدام نهج BLI تزج بيولايير استشعار نصائح مباشرة في مقتطفات النفط الخام احتمال تجميع مجمعات محددة مباشرة من هذه العينات النجسة مركزة. بمجرد تجميعها، من الممكن تماما لاستخدام المسابير جسم معين كمتابعة النظام BLI لمواصلة تحديد وحتى قوانتيتاتي يشتبه في أنهم عناصر في مقتطفات الخلوية التي تم تحديدها باستخدام أسلوب ميكروفولومي مرض التصلب العصبي المتعدد. مرة أخرى، أن المفتاح هنا استخدام البروتينات أساسية محددة وموجهة بشكل صحيح كما يسبر تقارب محددة.

القدرة على عرض بربري المسام عملية الانتقال مع BLI كينيتيكالي سوف تكون مفيدة للغاية في تحديد "المضادة السم" المحتملة جزيء صغير مثبطات البروتين التحولات التي تعمل على وجه التحديد ضمن أواخر اندوسومال، انخفاض الأس الهيدروجيني (5.0) شروط. هذا بربري درجة الحموضة التي يسببها للمسام الانتقال تحول دون حضور قابلة للطي مثبت (أوسموليتيس) مثل الجلسرين أو السكروز، ومما يضفي الدعم القوى لتطوير مثبتات قابلة للطي مستهدفة محددة تمنع السلطة الفلسطينية تشكيل_المسام . يتجنب هذا النهج المحدد ويستبدل فحوصات النفط الخام على أساس التجميع حيث تنخفض درجة الحموضة تؤدي إلى ترسيب البروتين. هذا الأسلوب الأخير، على الرغم من أن جيدة لأساليب الغربلة الأولية، غالباً ما يؤدي إلى نتائج إيجابية زائفة فيها مركبات محددة تمنع التجميع بدلاً من الانتقالات الجزيئية الفعلية.

الملاحظات النهائية لهيكل وتحديد المكونات الفردية المجمعة داخل عينات صغيرة ميكروفولومي أيضا يمكن أن تكون مفيدة في التحقق من مركبات الرصاص المحتملة. وهذا يمكن تطبيقها في الحالات التي يكون فيها استقرار الجمعية محددة أو زعزعة استقرار النتائج المستهدفة. هذا النهج الموازي الحركية/هيكل/تحديد مفيد لتأكيد صحة المستجيبة مركب الرصاص المشتبه فيها للجمعية مباشرة بمثابة خطوة معقولة الفرز الثانوي أو نهج الإنتاجية المتوسطة.

Cryo-م تقنية مفيدة لدراسة تفاصيل الذري مجمعات جزيء ضخم في الدول المختلفة للجمعية. قبل إعداد عينات م البرد، من المهم أولاً التحقق من إعداد يحتوي على مجمعات متجانسة نقية معقول مع وصمة سلبية م. الأعمال المعروضة هنا يوضح الجمعية من البروتين المجمعات على الأسطح biosensor BLI، الإفراج عن هذه المجمعات للتصور م، وتحديد هذه المكونات باستخدام MS. هذه منهجية خاصة للجمعية العامة التي تسيطر عليها، وإطلاق سراح يمكن أن يكون مفيداً في توليد البروتوكولات المحددة جداً التي تعزز إعداد عينة متسلسلة متجانسة لوصمة سلبية م، خطوة ضرورية ويجب أن تظهر قبل المضي قدما إلى م البرد. للحصول على بنية ثلاثية الأبعاد ذات الدقة المنخفضة، يلزم فقط 30-50 جزيئات معقدة لتنفيذ سلسلة إمالة مخروطية (70 صورة 2D مختلف وجهات النظر كل الجسيمات) شريطة أن يكون هناك اتجاه التنوع (وجهات نظر مختلفة متعددة).

فيما يتعلق بتعزيز أساليب مرض التصلب العصبي المتعدد، تواصل التقدم في الحساسية، وتخفيض حجم العينة تحسين. تدفقات نانو والضغط الفائقة اللوني السائل جنبا إلى جنب مع تنمية مطيافات الشامل مع واجب سريع دورة، وزيادة الحساسية وحل السلطة. الأخيرة مقدمة من مطياف كتلة أوربيتراب، لا سيما الإصدار الأحدث (أوربيتراب "لموس الانصهار"، وخلفه المتوقع "لموس الانصهار أوربيتراب" م 1) فضلا عن خوارزميات البحث إلى حد كبير تسهيل هذه العملية.

وترصد الجمعية الحركية والتفكيك من المكونات السمية الجمرة الخبيثة باستخدام منهجيات BLI خالية من التسمية المنهجية الحالية وتقييم الهيكل والهوية لهذه المكونات باستخدام EM ومرض التصلب العصبي المتعدد، على التوالي. استخدام قناة واحدة بسيطة نظام BLI مقترنة بالروتين السلبي تلطيخ تحليل م والابتدائية مرض التصلب العصبي المتعدد التقنيات أكثر من كافية لوصف عملية الجمعية العامة.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1-إيثيل -3- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كاربوديميد)) (EDC) Thermo	Scientific	22980
(2- (2-pyridinyldithio) إيثانامين) (PDEA) GE	Lifesciences	BR100058
0.5 مل أنابيب دقيقة سوداء	Sigma-Aldrich	Z688304-500EA
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti		850457C-25mg
إشادة PepMap 50 & mu م × 150 مم ، C18 ، 2 & مو ؛ م ، 100 & أرينج;	ThermoFisher Scientific	164561
حمض الخليك الجليدي	فيشر	A38SL-212
أسيتونيتريل	فيشر	A955-4
نصائح أمين الجيل الثاني التفاعلي (AR2G)	Forte Bio	18-5092
بيكربونات الأمونيوم	فيشر	A643-500
مرشح حقنة Anotop 10 ، 0.02um	Lifesciences	6809-1002
BLItz System	Pall Forte Bio	45-5000
حمض البوريك	فيشر Scientific	10043-35-3
الشعري Morphogenic Gene-2			المنتج والنقي في المنزل
المغلفة بالكربون Cu 300 شبكة	علوم المجهر الإلكتروني	CF300-CU-50
Dithiothreitol (DTT)	GoldBio	DTT25
أحماض الفورميك	JT Baker	0129-01
Guanidine hydrochloride (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505-100G
Iodoacetamide	MP-BioMedicals، LLC	100-351
JEM-1400 مجهر إلكتروني ناقل	الحركة JEOL
L-cystiene هيدروكلوريد هيدرات	سيجما ألدريتش	C121800-5G
		القاتل للعامل N	البروتين الذي تم إنتاجه وتنقيته في برنامج
MS الداخلي الإصدار 2.2	ThermoFisher Scientific
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	090M14531V
Orbitrap Fusion Lumos	ThermoFisher
أنابيب PCR	ThermoFisher Scientific	AB-0620
Pelco easiنظام تنظيف تفريغ التوهج	Ted Pella، Inc	91000
Protective Antigen prepore			البروتين المنتج والتنقية في المنزل
دوائر ورق الترشيح النوعية	فيشر Scientific	09-795C 5
التسلسل المعدل التربسين	Promega	V5111
Sequest HT محرك البحث	ThermoFisher Scientific
أسيتات الصوديوم ثلاثي هيدرات	فيشر Scientific	BP334-500
كلوريد الصوديوم	فيشر Scientific	S271-10
كولات الصوديوم	سيجما ألدريتش	C1254-100G
قاعدة تريس	فيشر Scientific	BP152-10
فورمات اليورانيل (UF)	علوم المجهر الإلكتروني	22450
Xcalibur	ThermoFisher Scientific	OPTON-30487