مقالة منهجية

الإنتاج والتصور جدارها البكتيرية وبروتوبلاستس لتميز التعريب الببتيد مضادات الميكروبات

DOI:

10.3791/57904

⸱

أغسطس 11, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Biochemistry Program, Wellesley College, 2Department of Chemistry, Wellesley College, 3Department of Biological Sciences, Wellesley College

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا لإنتاج الغرام الإشريكيّة القولونية (كولاي) جدارها وإيجابية Bacillus megaterium (باء-ميجاتيريوم) بروتوبلاستس تصور واضح وتميز سرعة التفاعلات البكتيريا الببتيد. يوفر هذا أسلوب منهجي لتعريف غشاء إضفاء الطابع المحلي وترانسلوكاتينج الببتيدات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحول دون استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] كطريقة لتقييم أنماط التعريب الببتيد داخل البكتيريا عادة بحدود القرار مجاهر الخفيفة التقليدية. كما لا يمكن تعزيز القرار مجهر معين بسهولة، نقدم البروتوكولات لتحويل صغيرة على شكل قضيب الغرام الإشريكيّة القولونية (كولاي) وإيجابية Bacillus megaterium (ميجاتيريوم) ودعا إلى أشكال كروية المصورة بسهولة أكبر، وجدارها أو بروتوبلاستس. ويسمح هذا التحول المراقبين لتحديد سرعة ووضوح سواء الببتيدات تقديم أنفسهم إلى الغشاء الجرثومي (أي، ترجمة غشاء) أو عبر الغشاء بدخول الخلية (أي، ترانسلوكاتينج). مع هذا النهج، نقدم أيضا أسلوب منهجي لتوصيف الببتيدات كغشاء إضفاء الطابع المحلي أو ترانسلوكاتينج. بينما يمكن استخدام هذا الأسلوب لمجموعة متنوعة من الببتيدات غشاء نشطة والسلالات البكتيرية، نظهر فائدة هذا البروتوكول عن طريق مراقبة التفاعل بين بوفورين الثاني P11A (BF2 P11A)، ببتيد مضادات الميكروبات (أمبير)، مع كولاي جدارها وبروتوبلاستس ميجاتيريوم (ب) .

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد اكتسبت الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير) الاهتمام بسبب إمكانية استخدامها كبدائل للمضادات الحيوية التقليدية1،2،3،،من45. الامبير تقتل البكتيريا أما ترانسلوكاتينج عبر غشاء الخلية، والتفاعل مع المكونات داخل الخلايا مثل الأحماض النووية أو بيرميبيليزينج الغشاء مما تسبب في تسرب محتويات الخلية6. بالإضافة إلى استخدامها كالمضادات الحيوية، ترانسلوكاتينج الامبير قد تكون مكيفة لطلبات تسليم المخدرات نظراً لأنها غير ديسروبتيفيلي يمكن عبر7،غشاء الخلية كتيمة8. ولذلك، نحن، تسعى إلى فهم آليات أمبير الأساسية العمل على إرساء الأسس لاستخدامها في تصميم الأدوية.

[كنفوكل] الفحص المجهري يوفر وسيلة لتقييم أنماط الترجمة من الامبير المسمى فلوريسسينتلي في الخلايا البكتيرية تقديم رؤى في إليه العمل9،10،،من1112، 13 , 14-بوصفها غشاء البكتيريا، واحد يمكن تحديد إذا يموضع ببتيد مسمى فلوريسسينتلي للغشاء أو الفضاء داخل الخلية للخلية البكتيرية. ومع ذلك، يقتصر هذا الأسلوب الشكل صغيرة الحجم وقضيب من البكتيريا، والتي يمكن أن تجعل التصوير صعبة بسبب حدود القرار مجاهر الخفيفة التقليدية والاتجاه المتغير من البكتيريا على شريحة15.

وهدف طريقة عرض تمكين التصور تعزيز أنماط التعريب الببتيد المسمى فلوريسسينتلي باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. هو تعزيز التصور بتحويل صغيرة، رقيقة، على شكل قضيب الغرام الإشريكيّة القولونية (كولاي) وإيجابية Bacillus megaterium (ميجاتيريوم) البكتيريا إلى أشكال كروية الموسع، ويشار إليه بوصفه جدارها (لسلالات الغرام) وبروتوبلاستس (لسلالات إيجابية)16،17،،من1819،،من2021. جدارها وبروتوبلاستس أسهل للصورة بسبب زيادة حجمها وشكلها متماثل، مما يجعل التوجه للبكتيريا على شريحة غير ذي صلة التصوير. وباﻹضافة إلى ذلك، فإننا نقدم مقاربة منهجية لتحليل البيانات مجهرية [كنفوكل] كمياً لوصف الامبير الغشاء أما محلياً أو ترانسلوكاتينج. تطبيق هذه الأساليب يجعل من السهل التمييز بين المسمى فلوريسسينتلي أنماط التعريب الببتيد. يمكن استخدام البروتوكولات المقدمة هنا لتقييم إضفاء الطابع المحلي على مجموعة متنوعة من العوامل النشطة غشاء خلاف المكاتب الإقليمية للمرأة، بما في ذلك اختراق الخلية الببتيدات.

واحد ميزة واضحة لهذا الأسلوب هو أن فإنه يوفر نظرة ثاقبة إليه العمل للمكاتب الإقليمية للمرأة على مستوى خلية واحدة، التي قد تكشف التغايرية خلية إلى15، بدلاً من فحوصات الفلورية الأخرى استخداماً لتحديد آليات العمل للمكاتب الإقليمية للمرأة، التي توفر معظم التقديرات9،،من2223،24،25فقط. استخدام جدارها وبروتوبلاستس من أجل تقييم إدخال خلية أمبير هي مفيدة خاصة26 لأنها ذات الصلة أكثر فسيولوجيا15 من النماذج الأخرى المستخدمة لتقييم إدخال خلية، مثل الدهن حويصلات24.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-حل إعداد

ملاحظة: إعداد الحلول هو موضح في الخطوات 1.1-1.9 و 1.8-1.11 بغية إنتاج جدارها كولاي وبروتوبلاستس ميجاتيريوم (ب) ، على التوالي.

  1. تحضير 1 م تريس-Cl، الأس الهيدروجيني 7.8 بتذويب 10.34 ز HCl تريس وز 4.17 أوه تريس في 50 مل من dH2س في قارورة 125 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد الحل (20 مم مجكل2، 0.7 متر السكروز، 10 مم تريس-Cl، الأس الهيدروجيني 7.8) بتذويب ز 0.10 مجكل2 (95.2 g/mol) وز 11.98 السكروز (342.3 g/mol) في 25 مل dH2س في قارورة 125 مل. إضافة ميليلتر 500 1 متر تريس-Cl (pH 7.8) وضبط مستوى الصوت إلى 50 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحضير حل ب (10 مم مجكل2, السكروز 0.8 م, 10 ملم تريس-Cl، الأس الهيدروجيني 7.8) بتذويب ز 0.05 مجكل2 (95.2 g/mol) وز 13.69 السكروز (342.3 g/mol) في 25 مل dH2س في قارورة 125 مل. إضافة ميليلتر 500 1 متر تريس-Cl (pH 7.8) وضبط مستوى الصوت إلى 50 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
  4. إعداد السكروز 0.8 م بحل السكروز ز 13.69 (342.3 g/mol) في 50 مل dH2س في قارورة 125 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
  5. إعداد ديوكسيريبونوكليسي 5 ملغ/مل أنا (الدناز أنا) بتذويب ز 0.015 الدناز أنا في 3 مل من dH2س في قارورة 50 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون. حل الكوة في [ميكروفوج] أنابيب ومخزن في-20 درجة مئوية.
  6. إعداد 0.125 M حمض الإيثيلين (يدتا)، ويذوي pH 8.0 بحل ثنائي يدتا ز 0.698 (372.2 g/mol) إلى 15 مل dH2س في قارورة 125 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
  7. إعداد 600 ميكروغرام/مل سيفاليكسين بتذويب 0.03 غرام هيدرات سيفاليكسين (365.404 g/mol) في 50 مل من dH2س في قارورة 125 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي عند 4 درجة مئوية.
  8. إعداد lysozyme 5 ملغ/مل بتذويب lysozyme ز 0.015 في 3 مل من dH2س في قارورة 50 مل. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون. حل الكوة في [ميكروفوج] أنابيب ومخزن في-20 درجة مئوية.
  9. تحضير 3% w/v مرق فول الصويا تريبتيكاسي (TSB) بإذابة 30 غ TSB في 1 لتر من dH2س في قارورة 2 ل. قاسمة الحل في قوارير تحتوي على 25 مل أو 100 مل TSB لاستخدامها في إعداد جدارها كولاي أو (ب) ميجاتيريوم بروتوبلاستس، على التوالي. اﻷوتوكﻻف قوارير لتعقيم الوسط السائل. ويمكن تخزين TSB العقيمة في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية.
  10. إعداد الحل ج (1 م السكروز، ماليات 0.04 متر، مجكل 0.04 متر2، الرقم الهيدروجيني 6.5) بتذويب ز 34.23 السكروز (342.3 g/mol) وحامض الماليك ز 0.46 (116.07 g/mol) 0.38 غ مجكل2 (95.21 g/mol) في 100 مل من dH2س في قارورة 250 مل. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.5. تعقيم بعملية التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 25 مم مع غشاء 0.2 ميكرون وتخزينها في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
  11. تعد المتوسطة جبلة مجردة 200 مل بخلط 100 مل 3% w/v TSB و 100 مل الحل ج في زجاجة زجاج 1 لتر. اﻷوتوكﻻف لتعقيم الحل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.

2-إعداد الثقافة بين عشية وضحاها

ملاحظة: تنفيذ الأقسام 2-4 باستخدام تقنيات تعقيم مناسبة. إذا رغبت في ذلك، يمكن أن يحتوي على سلالة البكتيريا بلازميد لمقاومة المضادات الحيوية للحد من التلوث المحتملة. إذا كان استخدام سلالة مع المقاومة للمضادات الحيوية، إضافة المضادات الحيوية اللازمة في خطوات 2.1، 3.1 – 3.2 و 4.1 – 4.4.

  1. إعداد ثقافة بين عشية وضحاها بانتقاء مستعمرة واحدة من البكتيريا باستخدام تلميح ماصة معقمة ووضعه في أنبوب ثقافة 14 مل يحتوي على 2-3 مل من 3% w/v TSB. احتضان في 37 درجة مئوية، في حين تهتز ح 16-21.

3-إعداد جدارها الغرام كولاي

  1. في قارورة 250 مل، تمييع 1: 100 الثقافة بين عشية وضحاها في حجم 25 مل من 3% w/v TSB واحتضان الحل الجرثومي في 37 درجة مئوية، في حين تهتز لما يقرب من 2.5 ح حتى وصلت إلى الحل بكثافة بصرية من 0.5 – 0.8 في 600 نانومتر. قياس الكثافة البصرية باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
  2. في قارورة 250 مل، تضعف هذه الثقافة 01:10 في 30 مل من 3% w/v TSB واحتضان في 37 درجة مئوية، في حين تهتز ح 2.5 حضور 60 ميكروغرام/مل سيفاليكسين (347.4 g/mol) لإنتاج خيوط خلية واحدة من حوالي 50-150 ميكرومتر في الطول ، هي التي يمكن ملاحظتها تحت 1,000 X التكبير باستخدام مجهر ضوء (الشكل 1B).
  3. الحصاد خيوط من سينتريفوجينج الحل الجرثومي في س 1,500 ز، 4 درجة مئوية للحد الأدنى 4 صب وتجاهل المادة طافية، حجز بيليه.
  4. أغسل خيوط بإضافة 1 مل سكروز 0.8 متر، مع الحرص على عدم تعكير بيليه بلطف. احتضان لمدة 1 دقيقة، ومن ثم تجاهل المادة طافية دون إزعاج بيليه.
  5. إضافة 150 ميليلتر من 1 م تريس-Cl (pH 7.8)، 120 ميليلتر من ليسوزيمي 5 ملغ/مل، 30 ميليلتر من 5 ملغ/مل الدناز الأول، و 120 ميليلتر يدتا 0.125 M في كل منها سعيا لبيليه واحتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  6. أضف 1 مل من محلول A تدريجيا أكثر من 1 دقيقة للحل الذي أعد في 3.5 باستخدام ميكروبيبيتي بينما يحوم بلطف الحل باليد. احتضان الحل لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. وضعت اثنين من أنابيب مخروطية الشكل 15 مل 7 مل من محلول 4 درجة مئوية ب. إضافة كميات متساوية من الحل الذي أعد في 3.6 لكل واحدة من هذه الأنابيب اثنين. الطرد المركزي الحل في 1,500 س ز، 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
  8. بعناية باستخدام ماصة مصلية، إزالة كافة ولكن المادة طافية–2 مل من 1 دون إزعاج بيليه. ريسوسبيند بيليه بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً ميكروبيبيتي P1000 باستخدام. بصريا تحقق لمعرفة تشكيل جدارها بمراقبة العينة في 1,000 X التكبير باستخدام مجهر ضوء (الشكل 1).
  9. تخزين جدارها في-20 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع، أو حتى أنهم ذهبوا من خلال دورات تجميد أذاب 3.

4-إعداد إيجابية باء-ميجاتيريوم بروتوبلاستس

  1. في قارورة 250 مل، تضعف 1:1,000 الثقافة بين عشية وضحاها في 100 مل من 3% w/v TSB واحتضان الحل الجرثومي في 37 درجة مئوية، في حين تهتز لما يقرب من 4.5 ساعة حتى وصلت إلى الحل بكثافة بصرية من 0.9–1.0 في 600 نانومتر. قياس الكثافة البصرية باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
  2. من أجل ثقافة السائل إلى اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 2,000 س ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. استخدام ماصة مصلية، تجاهل المادة طافية من أنابيب مخروطية الشكل على حد سواء. ريسوسبيند كل بيليه في المتوسط 2.5 مل جبلة مجردة، والجمع بين الحلول ريسوسبينديد في أنبوب مخروطي واحد. "الماصة؛" الحل ريسوسبينديد مجتمعة في قارورة 125 مل.
  4. أضف 1 مل ليسوزيمي 5 ملغ/مل واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية، في حين تهتز.
  5. رصد نمو بروتوبلاستس تحت 1,000 x التكبير باستخدام مجهر ضوء، مشيراً إلى وجود أي مخالفات، مثل البكتيريا التي تظهر كقضبان منتفخة بدلاً من المجالات (الشكل 2). استخدام ماصة مصلية، نقل الحل إلى 15 مل الأنبوبة المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 2,000 س ز، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. صب المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 5 مل جبلة مجردة وسائط الإعلام. تخزين بروتوبلاستس في-20 درجة مئوية لتصل إلى أسبوع، أو حتى أنهم ذهبوا من خلال دورات تجميد أذاب 3.

5-إعداد حل الببتيد وصبغ الغشاء للتصوير

  1. الحل الببتيد
    1. في [ميكروفوج] أنابيب ملفوفة في رقائق الألومنيوم، حل 2 مغ فيتك المسمى BF2 P11A في 800 ميليلتر dH2استخدام سين ببتيد تحتوي على بقايا التربتوفان واحد على الأقل من أجل إجراء قياسات تركيز البروتين.
    2. سبيكتروفوتوميتريكالي، قياس امتصاص الحل الببتيد في 280 نانومتر في ثلاث نسخ. حساب تركيز الببتيد باستخدام معامل الانقراض المولى التربتوفان (5,700/مليون متر مكعب).
    3. تخفيف تركيز الببتيد في dH2س إلى تركيز نهائي من 100-200 ميكرومتر. مخزن في [ميكروفوج] أنابيب في-20 درجة مئوية مغلفة برقائق الألومنيوم لحماية من الضوء.
  2. صبغ الغشاء
    1. في أنبوب [ميكروفوج]، إعداد مخزون 10 ملم من دي-8-أنيبس (592.9 g/mol) بإذابة 5 ملغ أنيبس-دي-8 في 843.3 ميليلتر من [دمس]. تخزين في 4 درجات مئوية مغلفة برقائق الألومنيوم لحماية من الضوء.
    2. في أنبوب [ميكروفوج]، إعداد 1 مل من 0.03 مم دي-8-أنيبس بإضافة 3 ميليلتر من 10 ملم دي-8-أنيبس إلى 997 ميليلتر [دمس]. تخزين في [ميكروفوج] أنابيب عند 4 درجة مئوية مغلفة برقائق الألومنيوم لحماية من الضوء.

6-التصور جدارها كولاي و ميجاتيريوم بروتوبلاستس باستخدام مجهر [كنفوكل]

  1. "الماصة؛" 5 ميليلتر من جدارها أو بروتوبلاستس إلى شريحة بولي-L-يسين المغلفة زجاج. إضافة 2 ميليلتر من فيتك المسمى أمبير (100-200 ميكرومتر) إلى الشريحة واحتضان لمدة 3 دقائق محمية من الضوء.
  2. أضف 1 ميليلتر من الغشاء صبغ دي-8-أنيبس (0.03 مم) إلى الشريحة واحتضان لمدة 3 دقائق محمية من الضوء. تغطية مع ساترة زجاجية وختم مع طلاء الأظافر.
  3. قم بتشغيل ليزر الأرجون ومجهر [كنفوكل]. ضبط ليزر الأرجون لإنتاج الكهرباء 20% وانتقال 20%.
  4. تعيين نطاقات الطول الموجي الانبعاثات من 499 – 532 نانومتر و 670 – 745 شمال البحر الأبيض المتوسط للقناة الانبعاثات الببتيد المسمى فيتك والغشاء دي-8-أنيبس-المسمى صبغ الانبعاثات القناة، على التوالي.
  5. بروتوبلاستس الصورة أو جدارها (الشكل 1 و الشكل 2) مع هدف X 63. استخدم برامج التصوير للحصول على 8-بت، 512 × 512 المركب z-رص الصور تتألف من 0.5 ميكرومتر شرائح برمتها سفيروبلاست أو جبلة مجردة.
    ملاحظة: يستغرق النظر الدقيق الحد من الانبعاث التسييل خلال أثناء التصوير جدارها وبروتوبلاستس. انظر المناقشة للحصول على التفاصيل.

7-وصف للتعريب أمبير

  1. فتح الصورة المركبة z-المكدس في برامج التصوير. تحديد موقع الشريحة الأكثر مركز سفيروبلاست أو جبلة مجردة ومكان واحد دائري المنطقة من الفائدة (ROI) (0.3 ميكرومتر في القطر) في الغشاء (ROI 1)، أحدهما في مركز سفيروبلاست أو جبلة مجردة (ROI 2)، والآخر بعيداً عن سفيروبلاست أو جبلة مجردة لقياس الأسفار الخلفية (ROI 3) (الشكل 5). تجنب إدراج مشبعة بكسل. ويمكن حساب كثافة الأسفار في كل دوروا ببرامج التصوير.
    ملاحظة: في الحالات عند عدم ترجمة الببتيد للغشاء بأكملها، رسم 1 العائد على الاستثمار في منطقة الغشاء حيث يتم ترجمة الببتيد.
  2. استخدم المعادلة التالية لتحديد نسبة كثافة fluorescence الببتيد داخل الخلايا لغشاء الببتيد fluorescence كثافة:
    figure-protocol-1
    ملاحظة: يتم طرح كثافة fluorescence في 3 العائد على الاستثمار من شدة الأسفار في 2 العائد على الاستثمار والعائد على الاستثمار 1 بغية مراعاة للخلفية الفلورية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريق توسيع البكتيريا وجعلها كروية، يمكننا أن نميز بسهولة سواء الببتيدات تعريب للغشاء الجرثومي أو سهولة ترانسلوكاتي عبر الغشاء الجرثومي. حدود القرار مجاهر الخفيفة التقليدية تجعل من صعوبة التمييز بين ما إذا كانت الإشارات الببتيد تنشأ من الغشاء أو مساحة داخل الخلية في البكتيريا العادية لأنه سوف تظهر إشارات مترجمة للغشاء تتداخل مع الفضاء داخل الخلايا (الشكل 3A). على العكس من ذلك، ينتج الموسع حجم جدارها (2 – 5 ميكرون) وبروتوبلاستس (2 – 3 ميكرومتر) مقارنة بالبكتيري...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكولات المقدمة هنا جعله قابلاً للباحثين للحصول على أحجام العينة أكبر من الصور البكتيرية أكثر سرعة لأن البكتريا الموسع، كروية أسهل بكثير تحديد وتوجيه، وصورة. هذه القدرة المحسنة لجمع البيانات قيمة من نواح عدة. أولاً، أنه يمكن تحليل كمي أكثر منهجية لأنماط التعريب الببتيد. بينما يمكن أن تبين الاتجاهات النوعية من مجموعات أصغر من الصور، فقط مجموعة عينة كبيرة من الصور عالية الجودة تكشف أكثر دقة اتجاهات في أنماط الترجمة، مثل النسبة المئوية للخلايا حيث translocates ببتيد مقابل يموضع غشاء. أيضا، القدرة على تصميم أفضل الأسفار...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تعريف لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان دعم البحوث "المعهد الوطني للحساسية" و "الأمراض المعدية" (المعاهد الوطنية للصحة-نييد) جائزة R15AI079685.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تريزما هيدروكلوريد (تريس هيدروكلوريد)سيجماT3253
قاعدة تريزما (تريس أوهايو)سيجماT1503
كلوريد المغنيسيومسيجماM8266
السكروزسيجماS7903
ليزوزيمسيجماL6876
ديوكسيربونوكلياز ISigmaD4527
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكسيجما106361يستخدم 106361 سيجما في تطوير البروتوكول الأصلي ؛ 106361 توقف مع ED2SS كبديل
هيدرات سيفاليكسينسيجماC4895
أمبيسلينفيشر ScientificBP1760
BBL مرق الصويا التربتكيزفيشر ScientificB11768
BF2 P11A FITCNeoScientificطلب مخصص
di-8-ANEPPSBiotium61012
DMSOSigma34869مستخدم Sigma D8779 في تطوير البروتوكول الأصلي ؛ توقف D8779 مع 34869 كبديل
حمض الماليكSigmaM0375
Acrodisc 25 مم مرشح حقنة ث / 0.2 & m HT Tuffryn MembranePall Corporation4192
مجهر متحد البؤر للمسح بالليزرLeica MicrosystemsTCS SP5 IIللحصول على الصور
مجموعة تطبيقات Leica ، أنظمة Leica الدقيقةالمتقدمة لمعالجة الصور
الفلورية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
  2. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
  3. Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
  4. Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
  5. Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
  6. Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
  7. Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
  8. Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
  9. Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
  10. Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
  11. Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
  12. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
  13. Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
  14. Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
  15. Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
  16. Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
  17. Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
  18. Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
  19. Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
  20. Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , CRC Press. (2016).
  21. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
  22. Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
  23. Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).
  24. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571(2012).
  25. van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
  26. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
  27. Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
  28. Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
  29. Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
  30. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
  31. Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
  32. Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

E coli B megaterium

مقالات ذات صلة