مقالة منهجية

الارتداد الكيميائية للخلايا الجذعية Pluripotent البشرية التقليدية إلى حالة شبيهة بالسذاجة مع التمايز مولتيلينيجي تحسين فاعلية

9.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57921

⸱

يونيو 10, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكول للكفاءة والسائبة والسريع الارتداد الكيميائية الخلايا الجذعية pluripotent البشرية التقليدية أعدادا النسب (هبسك) إلى دولة برييمبلانتيشن مثل epiblast pluripotent السذاجة ابيجينوميكالي مستقرة. نتائج هذا الأسلوب في التعبير الجيني انخفاض النسب أعدادا وتحسن ملحوظ في تمايز مولتيلينيجي الموجهة عبر مرجع واسع النطاق من خطوط هبسك التقليدية.

الملخص

السذاجة البشرية pluripotent الخلايا الجذعية (N-هبسك) مع تحسين الأداء الوظيفي قد أثر على نطاق واسع في الطب التجديدي. والهدف من هذا البروتوكول أن تعود كفاءة الخلايا الجذعية pluripotent البشرية أعدادا النسب، التقليدية (هبسك) المحافظة على ظروف خالية من علبة التغذية بالورق أو علبة التغذية بالورق-تعتمد على أن السذاجة مثل بلوريبوتينسي مع تحسين الأداء الوظيفي. يستخدم هذا الأسلوب الارتداد السذاجة الكيميائية اللوكيميا الكلاسيكية المثبطة عامل (LIF)، GSK3β، ومنظمة مجاهدي خلق/إيرك تثبيط كوكتيل (ليف-2i)، وتستكمل مع فقط مثبط تانكيراسي XAV939 (ليف-3i). ليف-3i يعود هبسك التقليدية إلى دولة مستقرة pluripotent اعتماد النسخي، والكيمياء الحيوية، وميزات جينية من epiblast غرس ما قبل البشرية. يتطلب الحد الأدنى خلية ثقافة التلاعب هذا الأسلوب ليف-3i وهو الغاية استنساخه في مرجع واسع النطاق من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسك) وخطوط خالية من التحوير البشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسك). لا يتطلب الأسلوب ليف-3i خطوة إعادة فتيلة قبل التمايز؛ ن-هبسك يمكن أن تكون متباينة مباشرة مع كفاءات عالية للغاية والحفاظ على كاريوتيبيك وزيادة ابيجينوميك (بما في ذلك في مواضع مطبوع). ولزيادة الطابع العالمي للأسلوب، تستزرع هبسك التقليدية أولاً في كوكتيل ليف-3i تكملة مع اثنين من جزيئات صغيرة إضافية أن تحفيز البروتين كيناز (فورسكولين) وسونيك القنفذ (sHH) (بورمورفاميني) مما يشير إلى (ليف-5i). هذه الخطوة التكيف 5i ليف قصيرة إلى حد كبير يعزز توسيع الاستنساخ الأولية هبسك التقليدية ويسمح لها أن تكون بعد ذلك عادت ساذجة مع ليف-3i وحدها بكميات كبيرة، مما ينفي الحاجة إلى الانتقاء/سوبكلونينغ نادرة N-هبسك المستعمرات في وقت لاحق. يتم الاحتفاظ هبسكس ليف-5i-استقرت فيما بعد في ليف-3i وحدها دون الحاجة للجزيئات المضادة أبوبتوتيك. الأهم من ذلك، العودة ليف-3i يحسن ملحوظا بلوريبوتينسي الوظيفية مرجع واسع النطاق هبسك التقليدية بالتناقص على التعبير الجيني أعدادا النسب ومحو تقلب الناقلات من التمايز الموجهة عادة ولاحظ بين خطوط هبسك المستقلة. هي الأوصاف تمثيلاً لليف-3i-عادت N-هبسك الاستراتيجيات المقدمة، والتجريبية للمقارنات الفنية من هبسك اسوي في النسب معبي مقابل. وترد الدول الشبيهة بالسذاجة.

المقدمة

نظام الثقافة 2 طاء (مثبط لمنظمة مجاهدي خلق/إيرك و GSK3β) وضعت أصلاً صقل الماوس غير متجانسة على أساس المصل الخلايا الجذعية الجنينية (مسك) الثقافات إلى دولة أرض موحدة من بلوريبوتينسي أقرب إلى preimplantation epiblast الماوس1. ومع ذلك، لا يدعم 2 طاء مستقرة صيانة خطوط الخلايا الجذعية (هبسك) pluripotent البشرية2. جزيء صغير معقدة، عامل النمو-تستكمل، ومحوره وراثيا النهج المختلفة ذكرت في الآونة الأخيرة لالتقاط مزعومة مماثلة pluripotent الشبيهة بالسذاجة البشرية الجزيئية الدول2. ومع ذلك، العديد من الدول "ساذجة مثل" التي تم إنشاؤها بواسطة هذه الأساليب أيضا أظهرت عدم الاستقرار كاريوتيبيك، ابيجينوميك العيوب (مثلاً، الخسارة العالمية للطباعة الجينوم الأبوية)، أو ضعف التمايز المحتملة.

في التباين، مزيج تثبيط الكيميائية ثلاثية GSK3β، إيرك وإشارات تانكيراسي والعوامل المثبطة اللوكيميا (ليف-3i) كان كافياً لعودة الشبيهة بالسذاجة مستقرة مرجع واسعة ل خطوط هبسك التقليدية3. هبسك ليف-3i-عادت السذاجة (N-هبسك) المحافظة على كاريوتيبيس العادي وزيادة تعبيرهم عن الجينات البشرية epiblast preimplantation الخاصة بالسذاجة (e.g.,NANOG، KLF2، NR5A2، DNMT3L، هيرفه، ستيلا (DPPA3)، KLF17 ، TFCP2L1). ليف-3i الارتداد أيضا تمنح هبسك مع مجموعة خصائص الجزيئية والبيوكيماويه فريدة من نوعها بلوريبوتينسي ساذجة مثل مسك شملت زيادة إشارات STAT3 فوسفوريلاتيد، وانخفض إيرك الفسفرة، البد العالمية 5-ميثيلسيتوسيني هيبوميثيليشن، ديميثيليشن البد على نطاق الجينوم في الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)-المروجين جين معين، ومهيمنة استخدام محسن OCT4 القاصي. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع غيرها من السذاجة مطبوع أساليب العودة التي أدت إلى أبيرانتلي هيبوميثيلاتيد المكاني الجينوم، هبسك ن ليف-3i-عادت كانت تخلو من فقدان مطبوع البد أنماط منتظمة أو فقدان التعبير methyltransferase الحمض النووي (مثلاً، DNMT3B DNMT1، DNMT3A،)3.

ثقافة 3i ليف مباشرة من مجموعة واسعة من التقليدية البشرية الخلايا الجذعية الجنينية (هيس)، والخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسك) نمت على مغذيات أو ظروف خالية من تغذية E8 تحقيق العودة السريعة والسائبة لدولة مثل epiblast ساذجة. بيد 3i ليف مباشرة ساذجة العودة قد تكون غير فعالة في بعض خطوط هبسك التقليدية غير مستقرة بسبب التقلبات الجينوم وتستعد النسب المتأصلة الناجمة عن الخلفيات المتنوعة وراثيا المانحين.

وهكذا، لتوسيع الأداة المساعدة لأسلوب ليف-3i، تحسين تدريجي ووضعت وهو المقدمة في هذه الوثيقة، التي يسمح العودة السذاجة العالمي مع ما يقرب من أي هيس التقليدية أو خط هيبسك خالية من التحوير مثقف على مغذيات. يستخدم هذا الأسلوب الارتداد السذاجة إضفاء الطابع العالمي خطوة عابرة ثقافة أولية في هبسك التقليدية التي تكمل كوكتيل ليف-3i مع اثنين إضافية الجزيئات الصغيرة (ليف-5i) أن تحفيز البروتين كيناز (فورسكولين) و (سونيك القنفذ (sHH) مما يشير إلى بورمورفاميني). مرور أولية واحدة هبسك التقليدية في ليف 5i لهم تتكيف مع الارتداد ليف-3i مستقرة اللاحقة بكميات كبيرة. الأولية 5i ليف التكيف تقوي إلى حد كبير وحيد الخلية الأولى انتشار الاستنساخ هبسك التقليدية التي نمت في E8 أو مغذيات (قبل اللاحقة مستقرة ومستمرة مرورهم في ليف-3i وحدها). خطوط هبسك التقليدية تكييفها أولاً إلى مرور واحد في ليف 5i تحمل الجملة اللاحقة الاستنساخ باساجينج من السذاجة عادت الخلايا في ظروف ليف-3i، مما يغني عن الحاجة إلى الانتقاء وسوبكلونينغ المستعمرات مستقرة نادرة، أو الاستخدام الروتيني الجزيئات المضادة أبوبتوتيك أو مثبطات البروتين المرتبطة رو كيناز (روك).

الأسلوب ليف-3i قد استخدمت بنجاح لتوسيع ستابلي والحفاظ على مرجع واسع النطاق > 30 خطوط هبسك التقليدية مستقلة ومتنوعة جينياً > الممرات 10 – 30 باستخدام أما أساليب الانفصال غير الانزيمية أو الانزيمية، و دون دليل على تحريض كروموسومية أو شذوذ ابيجينوميك، بما في ذلك التشوهات في الجينات مطبوع المكاني. بالإضافة إلى ذلك، متسلسلة ليف-5i/ليف-3i الثقافة هو السذاجة فقط عودة الأسلوب تم الإبلاغ عنها حتى الآن أن يحسن بلوريبوتينسي الوظيفية مرجع واسعة لخطوط هبسك التقليدية بالتناقص على التعبير الجيني أعدادا النسب و شكل كبير تحسين قوتها التمايز مولتيبوتينت. ليف-3i السذاجة العودة أسلوب يمحو الأصيل داخلية تقلب للتفريق بين خطوط هبسك معبي النسب، والتقليدية، وسيكون لها فائدة كبيرة للتطبيق في الطب التجديدي، والعلاجات الخلوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأجريت جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان والبروتوكولات التي وافقت عليها جون هوبكنز مدرسة للطب معهد رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إياكوك).

1-التحضير للماوس الجنينية الليفية (MEF) لتعتمد على التغذية التقليدية (هيسك المتوسطة/MEF) أو السذاجة عادت هبسك (ليف-3i المتوسطة/MEF) الثقافة

  1. شراء أو إعداد داخلية منخفضة-مرور الإمدادات من مغذيات MEF من CF1 أو CF1 x DR4 الهجين E13.5 الماوس الأجنة بعد البروتوكولات المنشورة4.
    1. كريوبريسيرفي مرور منخفضة (p1-p2) MEF ثقافات ما قبل (للتخزين على المدى الطويل) أو التشعيع بعد (لمدة 6 أشهر) ومخزن في النتروجين السائل كما تم وصفه سابقا4.
    2. تشعيع (5,000 راد) السائبة MEF موسعة تحت p5 استخدام γ-أو X-أشعة-إيرادياتور وتحضير مختبرين في 1.5 × 106 خلايا كل قنينة لتخزين قصيرة الأجل (أقل من 6 أشهر) في-80 درجة مئوية في الثلاجة درجة حرارة منخفضة للغاية.
    3. لوحة بين 1.2 x 106 (طازجة المشع غير cryopreserved) و 1.5 × 106 (المشع cryopreserved) MEF كل لوح مهيلم 6-بئر واحدة لإعداد الثقافات الفرعية، كما هو موضح أدناه.
  2. إعداد المغلفة بالجيلاتين ألواح المعالجة بزراعة الأنسجة المعقمة 6-جيدا بإضافة 1.5 مل من 0.1% العقيمة الجيلاتين الحل لكل بئر في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء.
  3. احتضان لوحات المغلفة بالجيلاتين في 37 درجة مئوية على الأقل 1 ح أو بين ليلة وضحاها في حاضنة مختبر CO2 .
  4. في اليوم التالي، ذوبان الجليد مرور منخفضة (مثل P2 إلى P4) cryopreserved [دمس] والمشع (راد 5,000) MEF وفقا للخطوات المبينة أدناه.
    ملاحظة: غير المشعع MEF ينبغي أيضا مذاب، توسعت والمشع فورا قبل الاستخدام.
  5. ضع قاسمة MEF cryopreserved في حمام مائي 37 درجة مئوية. عند ذوبان الجليد، تعقيم الأنبوب مع الإيثانول وتمييع فورا كريوبروتيكتانت [دمس] إذ على الأقل مع MEF المتوسطة (الجدول 1) داخل مجلس الوزراء السلامة (مثل نقل 1 مل [دمس]-MEF قاسمة إلى 9 مل MEF المتوسطة في 15 مل العقيمة بوقي).
  6. الطرد المركزي الخلايا MEF المخفف في 200 x غ لمدة 5 دقائق في أنابيب معقمة 15 مل المخروطية.
  7. في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، نضح وتجاهل المادة طافية خالية من الخلايا وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 – 2 مل الطازجة MEF المتوسطة.
  8. بلطف تجاهل الحل الجيلاتين وإضافة 2 مل MEF إعادة تعليق في المتوسط MEF لكل بئر من لوحة 6-بئر جيلاتينيزيد، كما هو مبين أعلاه. MEF عد الخلايا ولوحة 1.2 x 106 (طازجة المشع غير cryopreserved) أو 1.5 × 106 (المشع cryopreserved) MEF كل لوح مهيلم 6-بئر واحدة.
    ملاحظة: جميع لوحات ثقافة الخلية التي يتم نقلها من حاضنة2 CO للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء يمكن أن تمحى بلطف مع ورقة رش الإيثانول ولكن ينبغي أن لا تكون مباشرة رش مع الحل الإيثانول 70% لتجنب نشر الإيثانول في الآبار.
  9. احتضان لوحات MEF عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاضنة مختبر CO2 (5% CO2، الأجواء الرطبة) للسماح للمرفق، قبل استخدامها.

2-الجملة استقرار الثقافات التقليدية هبسك "الارتداد السذاجة اللاحقة" مع "خطوة التكيف" 5i ليف موجزة

  1. التحقق من صحة كافة بنود هبسك التقليدية لحيازته تناذر عادية بالنطاقات ز، قبل بداية ليف-5i/ليف-3i الارتداد.
    ملاحظة: ليف-3i العودة لخطوط عالية-مرور هبسك التقليدية (مثلاً.، ف > 40-50) ينبغي تجنبها، نظراً لهذه الثقافات قد سبق المرفأ الجينوم الانحرافات التي قد تؤثر سلبا على الارتداد ليف-3i مستقرة وفعالة، والجزء الأكبر من جاهزة، خطوط هبسك التقليدية.
  2. الحفاظ على وتوسيع الثقافات التقليدية هبسك مع كاريوتيبيس العادية المصادق عليها في نظام ثقافة على أساس MEF (كما ورد في القسم 1)، أو نظام ثقافة خالية من علبة التغذية بالورق (وفقا لتفضيل المحقق).
    ملاحظة: كلا تعتمد على تغذية هبسك/MEF كوكولتوريس (مثلاً، هيس المتوسطة (الجدول 1) وتستكمل مع 4 – 10 نانوغرام/مل بفجف) أو خالية من علبة التغذية بالورق (على سبيل المثال.، وسائط 6 5 أو متسير E8 (وفقا لإرشادات الشركة المصنعة في لوحات المغلفة فيترونيكتين) أساليب متوافقة مع الجزء الأكبر من السذاجة الارتداد استخدام نظام ليف-5i/ليف-3i/MEF (الشكل 1). أساليب عدم الانزيمية المفضلة باساجينج هبسك التقليدية قبل أعدادهم للعودة. ولا تتضمن تركيبات وسائط 5i ليف وليف-3i المضادات الحيوية أو العوامل المضادة للفطور. ويتوقع القواعد العملية القياسية للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء العقم وصيانة احتراما صارما لتجنب أي تلوث البكتيرية أو الفطرية.
  3. MEF-على أساس نظام الثقافة، تحضير مغذيات MEF في لوحة 6-بئر جيلاتينيزيد كما هو موضح في القسم 1 يوم واحد على الأقل قبل باساجينج من الثقافات ليف-5i-تكييف هبسك التقليدية.
  4. بعد أن وصلت إلى الثقافات التقليدية هبسك كونفلوينسي ~ 50 ٪ (أي، 3-5 أيام بعد الطلاء الأولى)، يستعاض عن مستنبت القياسي هيس بليف 5i المتوسطة (2 مل في البئر؛ الجدول 1).
    ملاحظة: هذه الخطوات في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  5. الثقافة والمحافظة على التقليدية هبسك/MEF مدة تصل إلى 2 يوما في 5i ليف في الحاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة). تغيير المتوسطة 5i ليف يوميا لتكييفها لمرور اللاحقة والعودة مستقرة في ليف-3i.
  6. وبدلاً من ذلك، لثقافات خالية من التغذية التقليدية (مثلاً، في E8)، هبسك الثقافة في ليف 5i فقط بين عشية وضحاها قبل باساجينج في صباح اليوم التالي.
    ملاحظة: الثقافات 5i ليف وليف-3i يمكن كلاهما الحفاظ على مع الغلاف الجوي (21% O2) أو الأكسجين الفسيولوجية (5% O2) مستويات في الحاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة).
  7. قبل باساجينج، وضع لوحات الثقافة في خزانة السلامة البيولوجية وتغسل ليف-5i-تكييف هبسك التقليدية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 1 مل كاشف تفكك خلية لكل بئر. احتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO، وتريتوراتي برفق مع ماصة في تعليق خلية واحدة إلى الوراء في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك يمكن استخدام المخازن المؤقتة للانفصال غير الانزيمية لإعداد الخلايا المفردة باساجينج.
  8. جمع تعليق خلية في المتوسط هيس (إضعاف إضعاف على الأقل) في أنابيب مخروطية عقيمة 15 مل، ولطف تريتوراتي الخلايا التي بيبيتينج للحصول على تعليق خلية مفردة.
  9. الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق، أسبيراتي/تجاهل المادة طافية، وريسوسبيند بيليه الخلية في 1-2 مل المتوسطة 5i ليف في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد تلقائي خلية.
  10. أغسل لوحة MEF مطلي مسبقاً مرتين مع برنامج تلفزيوني (2 مل كل بئر في لوحات 6-جيدا) وتوزيع 1 – 2 × 106 خلايا (في المتوسط 2 مل LIF 5i) على 1 جيدا لصفيحة MEF غسلها في برنامج تلفزيوني.
  11. تعديل وتحسين كثافة الطلاء الأولى لكل خط هبسك الفردية أن تكون ساذجة-عادت، ريبلاتينج الكفاءة يمكن أن تكون شديدة متغيرة. ضع اللوحة في حاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة).
    ملاحظة: الاستخدام الروتيني لمكافحة apoptotic الكواشف لا ينصح لمعظم خطوط هبسك مع هذا الأسلوب. نظام 5i ليف يعزز إلى حد كبير الفعل الكفاءة إعادة الطلاء الاستنساخ الجملة الأولى من خطوط هبسك التقليدية. ومع ذلك، استخدام مرة واحدة للمانع روك (5 – 10 ميكرومترات Y-27632) يمكن زيادة تحسين الأولية 5i ليف كفاءة إعادة الطلاء الاستنساخ الثقافات التقليدية هبسك في المقطع الأول لبعض خطوط هبسك معبي النسب غير مستقرة مع الميل لعفوية التفريق.
  12. إذا بدءاً من الثقافات خالية من علبة التغذية بالورق (مثلاً، E8)، مباشرة نقل بئر واحدة من هبسك التقليدية منفصلان في 5i ليف في تكييف أحد المشع MEF مطلي جيدا (أي، مرور 1:1).
  13. في اليوم التالي، بلطف دوامة لوحة لرفع كافة الخلايا غير مرفقة، نضح المتوسطة (المياه والصرف الصحي برنامج تلفزيوني اختياري) واستبدال مع 2 مل من ليف 5i المتوسطة. تنفيذ هذه الخطوة في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء يوميا لمدة 3 – 5 أيام أو حتى يتم الخلايا روافد 60-70% (الشكل 1). ضع اللوحة في حاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة).

3-الصيانة الطويلة الأجل والتوسع في هبسك ن في المتوسط ليف-3i

  1. عقب أولية 5i ليف التكيف، ممر اللاحقة مستقر الثقافات ليف-3i كل 3 – 4 أيام في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، أو عندما تصبح الثقافات روافد 60-70% (الشكل 1).
    ملاحظة: تتطلب الثقافات ليف-3i صيانة صارمة والسماح للثقافات هبسك ن للوصول إلى كثافة عالية كونفلوينسي/خلية من ثقافة طويلة (مثلاً.، > 4 أيام) يقلل من كفاءة إعادة الطلاء الاستنساخ اللاحقة، ويعزز العفوية التفريق.
  2. في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، تجاهل المتوسطة الثقافة وتغسل كل جيدا للثقافات ليف-5i/ليف-3i بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني بلطف. تجاهل برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من محلول مفرزة الخلية. احتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة).
  3. جمع تعليق خلية، إضافة المتوسطة هيس (دون موانع أو عوامل النمو (الجدول 1)؛ إضعاف إضعاف على الأقل) استرداد جميع هبسك ولطف تريتوراتي الخلايا التي بيبيتينج للحصول على تعليق خلية مفردة. نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل.
  4. الطرد المركزي في 300 غرام لمدة 5 دقائق و aspirate/تجاهل المادة طافية. إعادة تعليق بيليه خلية في المتوسط ليف-3i. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد تلقائي خلية.
  5. لوحة ~ 2 × 105 خلايا كل بئر على MEF المشع في لوحة 6-جيدا جيلاتينيزيد باساجينج الروتيني للثقافات ليف-3i. لثقافات ليف-5i-تكييف الأولية، لوحة بكثافة أعلى في البداية (4 × 105 خلايا/جيد) قبل مرور الأولى إلى ليف-3i/MEF.
  6. إعادة لوحة وتوزيع هبسك ليف-5i-تكييفها على طازجة غسلها PBS المشع MEF تغذية لوحات (أعد في اليوم السابق كما ذكر أعلاه) في الأجلين المتوسط وليف-3i. استبدال المتوسطة ليف-3i يوميا.
  7. مرور N-هبسك أقل السائبة المستمر 4 – 7 مقاطع في مسبقة ليف-3i المتوسطة استخدام هبسك ن في الدراسات الفنية أو تجميد. تسجيل عدد الممرات هبسك ن أما التقليدية أو ليف-3i وسائل الإعلام.
    ملاحظة: ليف-3i العودة المرور عالية (مثل > p40) لا ينصح بخطوط هبسك معبي النسب، والتقليدية. وينبغي بذل مجهود لتعود خطوط هبسك التقليدية في أدنى مرور ممكن أن تكون متوفرة. بالإضافة إلى ذلك، استخدام هبسك ليف-3i-عادت التي شهدت أكبر من 10 ليف-3i الممرات لا ينصح للدراسات الفنية، ومنذ هذه الثقافات هبسك ن قد إيواء الحيوانات المستنسخة كاريوتيبيكالي غير طبيعي بسبب تحديد ثقافة الخلية الاستنساخ المطول. ريفيرسيونس ليف-5i/ليف-3i جديدة من خطوط هبسك التقليدية المنخفضة-المرور ينبغي أن تجري الدراسات الفنية، إذا مخزونات هبسك ن مع < 10 مقاطع من ليف-3i غير متوفرة.

4-تجميد وذوبان الجليد من ليف-3i-عادت N-هبسك

  1. قم بتوسيع هبسك ن عادت للممرات على الأقل 5-7 في ليف-3i، كما هو مبين أعلاه، قبل استخدامها في الدراسات الفنية أو تجميد طويلة الأجل. سجل عدد الممرات في الشروط التقليدية وفي ظروف ليف-3i على كل قنينة كريوبريسيرفيد.
    ملاحظة: يمكن أن فائض ليف-3i-عادت N-هبسك لا تستخدم في الاختبارات الوظيفية cryopreserved في كل مرور، لكن تجميد أقل العودة بعد انتهاء فقرات (على سبيل المثال.، < p3) قد يؤدي إلى الفقراء، أو الكفاءة الانتعاش بعد ذوبان الجليد اختلافاً كبيرا.
  2. في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، نضح المتوسطة الثقافة وتغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني (2 مل كل بئر)، نضح برنامج تلفزيوني وتنأى هبسك المستعمرات إلى الخلايا المفردة باستخدام الخلية المفرزة الحل (1 مل كل بئر). وضع لوحة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة). تمييع الحل مفرزة الخلية مع المتوسطة ليف-3i (2-fold)، وجمع هبسك في عقيمة 15 مل مخروطية والطرد المركزي خلايا في 200 x ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند بيليه الخلية في ليف-3i المتوسطة (1 – 2 مل كل ما يعادل جيدا). حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد تلقائي خلية.
  3. الطرد المركزي هبسك ن في الأجلين المتوسط وليف-3i (200 x ز لمدة 5 دقائق) وريسوسبيند الخلايا في خزانة السلامة الأحيائية في حل تجميد (الجدول 2)، كثافة على الأقل 1 × 106 خلايا/مل.
  4. نقل الخلايا في أنابيب التبريد التخزين الطويل الأجل، ووضع في حاوية تجميد بطيء. تسمح العينات لتجميد بين عشية وضحاها في ثلاجة-80 درجة مئوية.
  5. في اليوم التالي، نقل كريوفيالس في ثلاجة النتروجين سائل للتخزين على المدى الطويل.
  6. لذوبان الجليد، ضع قنينة مجمدة في حمام مائي 37 درجة مئوية ل ~ 2 دقيقة تعقيم القنينة (أي رذاذ الإيثانول) ونقل هبسك في عقيمة 15 مل مخروطية وتمييع الخلايا هيس في الوقت المتوسط (الجدول 1) وتستكمل مع 5 ميكرومترات من بطء البروتينات المرتبطة رو كيناز (روك) مثبط Y-27632 داخل غطاء سلامة بيولوجية عقيمة مجلس الوزراء.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق. في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، تجاهل المادة طافية خالية من الخلايا وريسوسبيند بيليه الخلية في ليف-3i المتوسطة (1-2 مل) وتستكمل مع 5 ميكرومترات روك مثبط Y-27632.
    ملاحظة: سيؤدي إلى استبعاد Y-27632 الكفاءة الانتعاش بعد ذوبان الفقراء (الشكل 2).
  8. نقل الخلايا المذابة حراكه في المانع ليف-3i/روك على الآبار اﻻستطﻻعية مطلي غسلها في برنامج تلفزيوني. كريوبريسيرفي ليف-3i الثقافات في كثافة 1 × 106 خلايا للقنينة الواحدة. ذوبان الجليد كل من هذه القنينات إلى مغذيات في بئر واحدة للوحة 6-جيدا جيلاتينيزيد.
  9. في اليوم التالي، تبدأ العادية ليف-3i التوسع المتوسط دون رو كيناز المانع.

5-تغذية لإزالة لجمع العينات هبسك ن

  1. إعداد عينات من ليف-3i/MEF (أو هيسك/MEF التقليدية) الثقافات (أي، للتعبير الجيني (مثلاً الكمية الرايت-بكر، [ميكروارس]) أو تحليل البروتين (مثلاً، وصمة عار الغربية)، تستنزف الثقافات 3i ليف من مغذيات MEF استخدام مغناطيسية تنشيط الخلية الفرز (ماك) مع الأجسام المضادة-هيئة تنظيم الاتصالات-1-81 المغلفة ميكروبيدس وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
  2. وبدلاً من ذلك، استخدام الأسلوب التالي بسيطة الطلاء قبل أن تستنفد ثقافات مغذيات، كما هو موضح أدناه.
  3. في غطاء سلامة بيولوجية عقيمة مجلس الوزراء، تجاهل المادة طافية خالية من الخلية، وتغسل بيليه مع PBS العقيمة 2 مل كل بئر. فصل الثقافات ليف-3i/MEF ملتصقة باستخدام الخلية المفرزة الحل (1 مل/جيد). احتضان لمدة 5 دقائق في حاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة). جمع هبسك في عقيمة 15 مل مخروطية الشكل. أغسل هيس في إضعاف متوسطة، نقل الخلايا إلى العقيمة 15 مل المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 200 x غ لمدة 5 دقائق.
  4. في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء، إعادة تعليق كل بئر ليف-3i/MEF فصل الخلايا إلى 2 مل الوسط ليف-3i، ونقل مباشرة إلى بئر جديدة للوحة 6-جيدا أنه قد تم حديثا المغلفة مع الجيلاتين 0.1%.
  5. احتضان خلايا هبسك ليف-3i/MEF ح 1 في 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO (5% CO2، الأجواء الرطبة). جمع الخلايا غير ملتصقة مع ماصة في أنبوب مخروطي الشكل جديد. بلطف إضافة 2 مل هيس متوسطة لكل بئر ودوامه لجمع الخلايا غير ملتصقة المتبقية.
    ملاحظة: سيتم إرفاق أغلبية MEF المشع إلى لوحة جيلاتينيزيد في ح 1، تاركة أغلبية هبسك في تعليق.
  6. الجمع والطرد المركزي خلايا في 300 x غ 5 كحد أدنى من المياه والصرف الصحي في برنامج تلفزيوني. الأداة الإضافية-تجميد بيليه الخلية في النتروجين السائل بعد الطرد المركزي، أو بدلاً من ذلك إعادة تعليق الكريات في المخزن مؤقت ليسينج متوافق مع تحليل البروتين أو الأحماض النووية المصب (الشكل 2ب).
  7. إجراء الأوصاف لخطوط هبسك ليف-3i مع عنصر تحكم هبسك اسوي معبي تقليدية مطابقة.
    ملاحظة: بسبب التغيرات الجوهرية بين الثقافات وداخلها معبي، يتم إعداد عناصر التحكم ذات الصلة في تيميبوينت مطابقة في الثقافة أو قبل عودة ساذجة. بروتوكولات مفصلة ومواد للمتلقين للمعلومات بيويماجينج إيمونوفلوريسسينت، التدفق الخلوي، النشاف الغربية، التعبير الجيني (RT-PCR فحوصات و [ميكروارس])، ودراسات مثلايشن (دوت وصمة عار، البد مثلايشن ميكرواري)، ومحسن OCT4 الدانية والبعيدة يتم توفير فحوصات مراسل غلبة وإشارات المانع فحوصات في أماكن أخرى3.

6-مرحلة ما بعد العودة من السذاجة: التحقق من سلامة الجينوم والاحتفاظ ببصمات الوالدين من هبسك ن ليف-3i-عادت قبل استخدامها في "الاختبارات الوظيفية"

  1. الشاشة الثقافات هبسك معبي التقليدية، والانطلاق لحيازته تناذر طبيعية (مثلاً، مع تحليل الموجات جيمسا المصبوغة باستخدام أساليب نشر 7) قبل الشروع في العودة ليف-5i/ليف-3i.
    ملاحظة: هذا هو للقضاء على السكان هبسك التقليدية التي قد تأوي التعديلات الجينوم الشاذة التي قد تدفع ميزة أرتيفاكتوال بقاء انتقائية في الاستنساخ ليف-3i الظروف.
  2. لتحقيق أفضل النتائج، طازجة تعود هبسك التقليدية الثقافات إلى حالة شبيهة بالسذاجة مع ليف-3i أسابيع عدة قبل استخدامها في الدراسات الفنية أو توجيه التمايز.
    ملاحظة: روتين الثقافة 'صيانة' في ظروف ليف-3i لأكثر من 10 مقاطع لا ينصح بالتالي من السذاجة العودة لفترات طويلة. توسيع الروتينية وصيانة خطوط هيس وهيبسك ينبغي أن يؤديها باستخدام نظم الثقافة التقليدية (مثلاً في E8 أو MEF/هيس متوسطة مع بفجف).
  3. تقييم خطوط هبسك ن بعد إعادتها للإبقاء على وضعها الطبيعي كاريوتيبيس الفقرات 5-7 بعد انتكاس ليف-3i (على سبيل المثال-، مع تحليل المصبوغة جيمسا-الفرقة7، أو أي طريقة أخرى لاختيار).
  4. تقييم كافة الأسطر N-هبسك reverted للاحتفاظ ببصمات الجينوم الأبوية العادية بتحليل الحمض النووي مثلايشن الاختيار (بروتوكولاتمثل"الحمض النووي البد" ميكرواري تحليل بصمات الأبوية في هبسك ن ليف-3i-عادت ترد في مكان آخر3 ) بعد 5 – 10 مقاطع من الارتداد ليف-3i.

7-وظيفة ساذجة الأيلولة: التصميم التجريبي المبادئ التوجيهية لفحوصات الكمية الموجهة تمايز استخدام ليف-3i-عادت N-هبسك

  1. مباشرة استخدام ليف-3i ن-هبسك بروتوكولات التمايز توجه المنشأة دون التلاعب الثقافة خلية إضافية.
    ملاحظة: إعادة فتيلة (أي تحويل هبسك ن العودة إلى ظروف معبي التقليدية قبل استخدامها في فحوصات التمايز الموجهة) ليس من الضروري مع أسلوب ليف-3i ولا ينصح.
  2. للتحكم في الآثار للمقايسة وداخلية تقلب في اختبار وظيفية لخطوط هبسك الفردية، عبر-التحقق من صحة مقايسات التمايز النسب المحددة باستخدام بروتوكولات التمايز مستقلة مع هبسك مالا يقل عن ثلاثة خطوط المستمدة من الخلفيات الوراثية مستقلة (أي، هيبسك المستمدة من المانحين وهيس متعددة).
  3. للمقارنات الفنية، إعداد الثقافات المشابهة، في مرور أي ما يعادل عدد، ومن نفس الخط هبسك (اسوي) بالتوازي مع معبي النسب التقليدية والثقافات هبسك ليف-3i-عادت. الحفاظ على الثقافات هبسك اسوي معبي السذاجة الأخوة في وسائل الإعلام الخاصة بها (على سبيل المثال-، E8 مقابل. LIF-3i)، وفي نفس الوقت التفريق بين استخدام بروتوكولات التمايز متطابقة والمواد، وإلى القضاء على أي تحيز التجريبية (الشكل 4).
  4. اسوي معبي مقابل مقارنات هبسك ساذجة، تعديل وتحسين كثافة الطلاء الأولى لكل تحليل التمايز الفردي.
    ملاحظة: تتوفر بروتوكولات مفصلة للسلف العصبية والأنسجة نهائي والتفريق بين توجيه حمتو غشائي هبسك ن ليف-3i-عادت في أماكن أخرى 3. ن-هبسك ليف-3i-عادت لديها القدرة التكاثري والتمايز أكثر قوة في فحوصات التمايز الموجهة من هبسك التقليدية. ن-هبسك عادة ما يتطلب تركيز طلاء أولى أقل من هبسك التقليدية، وخلافا لما هبسك معبي التقليدية النظراء، لا تتطلب استخدام الكواشف مكافحة apoptotic لتعزيز بقائها الاستنساخ عقب الانزيمية الهضم في فحوصات التمايز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هذا البروتوكول يحسن كفاءة ساذجة مثل العودة مع ليف-3i في كلتا الثقافتين هبسك التقليدية أعدادا النسب تعتمد على التغذية وتغذية مستقلة (الشكل 1). البروتوكول مفصلاً، والموضحة هنا، التكيف متسلسلة الخطوط العريضة لليف-3i بدءاً من أما الشروط هبسك تعتمد على تغذية أو خالية من التغذية التقليدية (مثل E8 المتوسطة).

الممثل يؤدي لعودة 3i ليف هيس التقليدية عدة وتعرض خطوط هيبسك خالية من التحوير في ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يطبق النظام ليف-3i نسخة معدلة من السذاجة 2 طاء موريني الكلاسيكية كوكتيل الارتداد1 للخلايا الجذعية pluripotent البشرية. المتمتعة بالحكم الذاتي-تجديد هبسك (التي لا يمكن أن يتوسع في 2 طاء وحدها) استقرت في ليف-2 طاء بتكميل هذا الكوكتيل مع مثبط تانكيراسي XAV939. يسمح ليف-3i الثقافة السائبة وكفاءة عودة هبسك التقليدية إلى دولة pluripotent تشبه epiblast preimplantation البشرية3. على الرغم من أن آليات العمل من XAV939 في هبسك مجمع المحتمل والتآزر مع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

بموجب اتفاق ترخيص بين "التكنولوجيات الحياة" وجامعة هوبكينز جونز (الرهبان)، يحق للدكتور زامبيديس أن نصيباً الإتاوات التي تلقتها الجامعة لمنح التراخيص للخلايا الجذعية. شروط هذا الترتيب يديرها الرهبان وفقا لسياساته تضارب في المصالح. وهذا لا يغير من صاحبي التقيد بالسياسات اليومية على تقاسم البيانات والمواد.

شكر وتقدير

وأيد المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة/نيي (R01EY023962)، والمعاهد الوطنية للصحة/NICHD (R01HD082098)، جائزة الابتكار ستاين تجمع الشعب البوروندي، ميريلاند صندوق أبحاث الخلايا الجذعية (2018-مسكرفف-4048، 2014-مسكرفي-0742)، نوفو نورديسك العلم المنتدى جائزة، ومؤسسة موزلي لهذا العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugatedBD Biosciences561716use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibodySigma AldrichHPA029708use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibodyAbcamab6276use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated BD Biosciences550315use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugatedeBioscience17-0319-42use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kitMiltenyi Biotec130-091-935
anti-NANOG antibodyAbcamab109250use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibodySigma AldrichHPA005455use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibodyCell Signaling4695use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibodyCell Signaling4370use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibodyCell Signaling9145use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylatedAgilentE0432use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated R&D SystemFAB1435Ause 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugatedR&D SystemNLLC1435Guse at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibodyCell Signaling9139use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibodyMilliporeMAB4388use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated R&D SystemNLLC4770Ruse at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0068use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0069use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560193use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560161use 10µL per assay (FACS)
APEL2-LiStemCell Technologies5271
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3311
CellAdhere dilution bufferStemCell Technologies7183dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouseCharles river023
CHIR99021R&D SystemL5283reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope systemZeissLSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC lineThermo Fisher ScientificA18945also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well platesCorning3506
Countess  cell counting chamber slideThermo Fisher ScientificC10228
Countess automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995-065
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650
DR4 mouseThe Jackson Laboratory3208
Essential 8 (E8) mediumStemCell Technologies5940
Fetal bovin serum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ForskolinStemgent04-0025reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG1890-100Gresuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
mTeSR1 mediumStemCell Technologies85850
Nalgene cryogenic vialsThermo Fisher Scientific5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide SystemFisher Scientific154534
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBSUSB Corporation 19943
PD0325901Sigma AldrichPZ0162reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
PurmorphamineStemgent04-0009reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin APeprotechAF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4Peprotech120-05ETresupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF)Peprotech1

المراجع

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203(2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293(2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838(2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LIF 3i

مقالات ذات صلة