مقالة منهجية

الآنف الفرق المحتملة التحديد الكمي للنقل عبر الظهارية أيون في الفئران

DOI:

10.3791/57934

⸱

يوليو 4, 2018

 , 
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), Université Catholique de Louvain

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا لقياس الآنف الفرق المحتملة في الفئران. الاختبار الكمي دالة الناقلين أيون transmembrane مثل الجهة المنظمة التليف الكيسي transmembrane الموصلية وقناة الصوديوم الظهارية. قيمة لتقييم مدى فعالية العلاجات رواية التليف الكيسي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختبار الفرق المحتملة الآنف قد استخدمت منذ ثلاثة عقود تقريبا للمساعدة في تشخيص التليف الكيسي (CF). وقد ثبت أن تكون مفيدة في حالات تخفيف، أشكال أعراض اليغو أو مونو CF تشخيصه عادة في وقت لاحق في الحياة، والاضطرابات المتصلة بقوات التحالف مثل غياب الثنائي الخلقية الاسهر، البنكرياس المزمن مجهول السبب, حساسية أسبيرجيلوسيس القصبية الرئوية والقصبات. في إعدادات السريرية والسريرية على حد سواء، قد استخدمت الاختبار كالعلامات البيولوجية تحديد الاستجابات للاستراتيجيات العلاجية المستهدفة لتكييف راجع الاختبار لماوس هو التحدي ويمكن أن يترتب وفيات المرتبطة بها. وتصف هذه الورقة عمق كاف من التخدير المطلوبة للاحتفاظ قسطرة الأنفية في الموقع التروية المستمرة. وهو يسرد تدابير لتجنب التطلع منذ حلول perfused في الآنف. فهو يصف أيضا العناية بالحيوان في نهاية الاختبار، بما في ذلك إدارة مزيج من مضادات السموم المخدرات مخدر، مما يؤدي إلى سرعة عكس التخدير مع الانتعاش الكامل من الحيوانات. إظهار الممثل البيانات المتحصل عليها من قوات التحالف وماوس البرية من نوع أن الاختبار يميز بين قوات التحالف وقوات التحالف--. بالإجمال، يسمح البروتوكول الخاص الموصوفة هنا قياسات موثوقة للحالة الوظيفية الناقلين الكلوريد والصوديوم الظهارية العابرة في الفئران التنفس تلقائياً، فضلا عن اختبارات متعددة في الحيوان نفسه مع تقليل المتعلقة بالاختبار وفيات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لما يقرب من ثلاثة عقود، استخدمت القياسات الكهربائية الفرق (PD) المحتملة لتقييم الحالة الوظيفية للناقلين أيون transmembrane المعرب عنها في الغشاء المخاطي للأنف، كممثل ل شركة طيران القاصي1. كما اختبار دينامية متعددة الخطوات2،3، الآنف PD يسمح تشريح وظيفي منظم الموصلية التليف الكيسي Transmembrane (CFTR) والصوديوم الظهارية قناة (ايناك) النشاط، سواء المترجمة في أغشية قمي الخلايا الظهارية وممارسة أدوار حاسمة في مجرى الهواء سطح الماء. تطبيق الاختبار PD الآنف السريرية الرئيسية للمساعدة في تشخيص التليف الكيسي، اضطراب الوراثية القاتلة الأكثر شيوعاً في القوقاز السكان معدل متوسط الولادات الحية 1 من أصل 2,500 في البلدان الأوروبية. الاختبار الطويل أثبت مفيدة في تشخيص أشكال أعراض اليغو أو مونو الموهنة، CF تشخيصه عادة في وقت لاحق في الحياة، والاضطرابات المتصلة بقوات التحالف مثل غياب الثنائي الخلقية الاسهر، البنكرياس المزمن مجهول السبب, حساسية أسبيرجيلوسيس القصبية الرئوية والقصبات4. في الآونة الأخيرة، تقييم كلينوميتريك لتحوير CFTR الأساسية العلاجية عيب5،،من67،،من89،10،11 ،،من1213،14،،من1516 قدم استعمال PD الآنف في التجارب السريرية للعلاجات الجديدة من قوات التحالف. في الإعداد السريري، فقد تم تكييف الاختبار ماوس17 للسماح بالتحقيق في بيواكتيفيتي الجديدة CF الهدف العلاجات18،19،،من2021. في الفئران، التقنية دقيقة، استناداً إلى الاختلافات التشريحية المتعلقة بالأنواع في الحجم لمنطقة الآنف بين القوارض والبشر، وأساساً على الدور الأساسي للمدخلات الحسية من منطقة ناسوفاسيال في القوارض. أنه يتطلب المشغلين المدربين والمهرة والمتفانية من المعدات واللوازم.

التليف الكيسي اضطراب النظم المتعددة من إفرازات الغدد، في الأمراض التنفسية المزمنة التي تسيطر على الصورة السريرية. يحدث المرض بسبب الطفرات في الجينات ترميز الأدينوزين الادينوسين دوري (مخيم)-ينظم CFTR كلوريد القناة22. وحتى الآن، كانت أكثر من 2,000 CFTR الطفرات حددت23. الأكثر شيوعاً الطفرة24،25، وجدت في ما يقرب من 90 في المائة الآليلات CF، يتوافق مع حذف من فينيلألانين في موقف 508 سلسلة ببتيد من البروتين (F508del-CFTR). بروتين CFTR قناة كلوريد المقاومها بحتة الموصلية صغيرة. وهناك أيضا أدلة كثيرة على أن CFTR وينظم آليات أخرى للنقل، على وجه الخصوص، ايناك26،27. النقل اﻻلكتروﻻيت معيبة، بما في ذلك CFTR-تعتمد على انخفاض الكلوريد الموصلية وايناك تعتمد على زيادة الصوديوم الموصلية، السمة مميزة لقوات التحالف ابيثيليا. ويتجلى العيب السابق تخفيض أو إلغاء repolarization ردا على كلا من افلوكس كلوريد مجاملة التدرج الكهروكيميائية وإضافة الايزوبرينالين (مؤثر ادريناليه بيتا أن يزيد من مخيم داخل الخلايا) أو فورسكولين (أدينيلاتي سيكلاسي مؤثر، لم تتم الموافقة للاستخدام السريري). العيب الأخير ينعكس من فرط الاستقطاب القاعدية في الغشاء المخاطي الأنفي (PD أكثر سلبية) وزيادة استجابة ل amiloride، دواء مدر للبول يمنع ايناك28.

نماذج الماوس CF استخداماً في البحوث CF ولا تقدر بثمن في تشريح أمراض التليف الكيسي. في الوقت الحاضر، ونماذج على الأقل خمسة عشر قد وصف29، ثلاثة منها متماثل لذات الصلة سريرياً الأكثر F508del الطفرة30،31،32. وقد استخدمت إحدى هذه ثلاث سلالات من30، وضع في جامعة إيراسموس في روتردام، لما يقرب من 20 عاماً في الجامعة الكاثوليكية دي لوفان (UCL) المختبر. طرازtm1Eur Cftr30 قد أثبت أنه مفيد جداً لدراسة اندحاس الفسيولوجيا المرضية لمرض التليف الكيسي واختبار فعالية جديدة الاستراتيجيات العلاجية18،،من1920، 21. قد تحدث مشاكل عديدة أثناء أو المبكر بعد (< ح 24) اختبار PD الآنف في الفئران. ويرد في هذه الورقة، وعمق كاف للتخدير اللازمة للاحتفاظ قسطرة الأنفية في الموقع التروية المستمرة، واتخاذ تدابير لتجنب التطلع منذ حلول perfused في الآنف. رعاية الحيوان في نهاية الاختبار أيضا وصف، بما في ذلك إدارة مزيج من مضادات المخدرات مخدر، مما يؤدي إلى سرعة عكس التخدير مع الانتعاش الكامل من الحيوانات. بالإجمال، تسمح هذه الإجراءات قياسات موثوقة في الفئران التنفس تلقائياً، وانخفاض الوفيات المتعلقة بالاختبار وتكرار الاختبار في الحيوان نفسه. تظهر ممثلة من البيانات التي تم الحصول عليها من الاختبار PD الآنف في قوات التحالف وماوس البرية من نوع ومناقشتها.

بروتوكول اختبار PD مورين الآنف يقال في ثلاث دورات: التقييم والإدارة قبل وأثناء وبعد الاختبار. في اختبار ما قبل التقييم والإدارة، هو وصف بروتوكول إعداد القسطرة مزدوجة التجويف الأنفي والحلول المستخدمة لنضح الآنف المستمر بالتفصيل. وخلال التقييم وإدارة أجزاء من الاختبار، هو دقة تشريح الإعداد التجريبية والتعامل مع الماوس. وأخيراً، يرد وصف إدارة الحيوان في نهاية الاختبار تحسين استرداد كامل الحيوان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أن الدراسات والإجراءات بموافقة لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية UCL (2017/UCL/MD/015) وبالاتفاق مع النظام الأساسي "الجماعة الأوروبية" لاستخدام الحيوانات في البحوث (أوروبا الوسطى والشرقية رقم 86/609). المحققون مؤهلين للتجارب الحيوانية عقب توجيه 2010/63/الاتحاد الأوروبي الصادر عن "البرلمان الأوروبي" والمجلس في 22 سبتمبر 2010 المتعلق بحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض البحث العلمي.

1-اختبار ما قبل التقييم والإدارة

  1. إعداد القسطرة مزدوجة التجويف الأنفي.
    ملاحظة: قسطرة الآنف كأنبوب شعري تجويف مزدوجة، التجويف واحدة تستخدم لنضح المستمر للحلول، والآخر واحد كقياس القناة.
    1. تسخين الجزء المركزي من قطعة، طويلة، حوالي 20 سم من الأنبوب البولي إثيلين (2.0 مم القطر الداخلي؛ 3.0 مم القطر الخارجي؛ الشكل 1 ) في شعلة الموقد الغاز حتى تصبح لينة بما يكفي لسحب (10-15 ثانية).
    2. سحب طرفي إلى جانب الحصول على أنبوب شعرية رقيقة جداً للطول المناسب (~ 15 سم) وقطرها الخارجي (~0.1 ملم) للتحقيق الآنف (الشكل 1ب).
    3. تنظيف وديجريسي اثنين من هذه الشعيرات الدموية مع الإيثانول النقي والانضمام إليها مع الشريط (الشكل 1ج) ويوحدهم معا باستخدام الغراء cyanoacrylate.
    4. قص بعيداً طول الزائدة من التحقيقات مع شفرة حلاقة أو مشرط الحصول طول أمثل للقسطرة التجويف مزدوجة من حوالي 8 سم (الشكل 1د).
    5. ضخ المياه من خلال كلا لومن للتحقق من أن تكون نفاذية.
    6. تطبيق علامة على مسافة 5 مم من الحافة.
      ملاحظة: يتم إدراج التحقيق حتى العلامة في الآنف، حيث أنه يتم إجراء كافة القياسات في نفس الموقع داخل تجويف الآنف.
    7. تخزين القسطرة التجويف مزدوجة في مربع جافة.
      ملاحظة: يمكن استخدام 6-10 مرات إذا تنظيف مناسب فورا بعد انتهاء الاختبار.
  2. إعداد مزيج كريم.
    1. بلطف مزيج م 3 المشبعة بوكل حل بنسبة 1:1 (حجم/حجم)، تجنب تكوين فقاعات هوائية صغيرة وكريم المنحل بالكهرباء.
      ملاحظة: يتم استخدام مزيج كريم لبناء الجسور الكهربائي لقياس والإشارة أقطاب Ag/AgCl، كما هو مبين في الشكل 1.

figure-protocol-1
الشكل 1 : تحقيقات مع الأقطاب الكهربائية والجسور- يوضح الشكل الأنبوب البولي إثيلين قبل (أ) وبعد تدفئة وسحب (ب)، الشريط الانضمام إلى جزأين الشعرية (ج) من قسطرة مزدوجة التجويف (د) والموصلات أنبوب سيليكون (ه) واقطاب (f). لوضوح الصورة، قد لا شغلت الروابط مع مزيج كريم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تسمية الحلوصف الحل
Aالحل الملح مخزنة القاعدية
بخالية من كلوريد مخزنة الحل الملح
ج10-2 م amiloride الأسهم الحل
د10-3 م فورسكولين الأسهم الحل

الجدول 1: حل الأسهم لاختبار PD الآنف في الفئران.

الملحممالوزن الجزيئيغرام/لتر
كلوريد الصوديوم (NaCl)13558.447,889
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات (كاكل2.2H2س)2.251470.331
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم (MgCl2.6H2س)1.2203.30.244
فوسفات ديبوتاسيوم (ك2هبو4)2.4174.20.418
مونوبوتاسيوم فوسفات (خ2ص4)0.4136.10.054

الجدول 2: تكوين القاعدية مخزنة الملح الحل (السهم A).

  1. إعداد الحلول.
    1. إعداد الحلول الأسهم الأربعة المطلوبة للبروتوكول التجريبي (الجدول 1).
      1. إعداد الحل مخزنة القاعدية (حل الأسهم ألف؛ الجدول 2) والحل مخزنة بشكل مؤقت خال من الكلوريد (حل الأسهم ب؛ الجدول 3) عن طريق خلط الأملاح في الماء النقي في درجة حرارة الغرفة. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 (نطاق 7.0-7.6) استخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم لرفع درجة الحموضة، 1 N HCl لانخفاض درجة الحموضة. الاسموليه التحقق من الحل (275 موسم/لتر).
      2. تخزين في زجاجات المسمى عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر أو المجمدة في زجاجات بلاستيكية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      3. إعداد الحل amiloride 10-2 م (حل الأسهم ج) عن طريق إضافة 26.6 ملغ هيدروكلوريد أميلوريدي إلى 10 مل الماء النقي. تسخين المزيج لمدة 5 إلى 10 دقائق عند 70 درجة مئوية. كما amiloride حساس للضوء، يبقى الحل ج في حاوية الظلام. قم بتسمية الحاوية وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
      4. إعداد فورسكولين الحل (حل الأسهم د) م 10-3 بإضافة 10 مغ فورسكولين إلى 24.36 مل من الماء النقي. تسمية مختبرين 0.1 مل من الحل الأسهم فورسكولين وتخزينها في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. إعداد حلول جديدة A1، B1 و B2 (الجدول 4).
    1. إعداد حل جديدة A1 (amiloride القاعدية الحل الملح مخزنة بشكل مؤقت بالإضافة إلى 10-4 م) بالحصول على 10 من مل من محلول الملح القاعدي (حل الأسهم A) وإضافة 0.1 مل من 10-2 م أميلوريدي الحل (الأسهم ج). تسمية الحاوية واستخدامه خلال 24 ساعة التحضير.
    2. إعداد حل الطازجة B1 (كلوريد مخزنة الحل بالإضافة إلى 10-4 م amiloride) بالحصول على 10 مل من خالية من كلوريد مخزنة الملح الحل (الأسهم ب) وإضافة 0.1 مل من 10-2 م أميلوريدي الحل (الأسهم ج). تسمية الحاوية واستخدامه خلال 24 ساعة التحضير.
    3. إعداد حل الطازجة B2 (خالية من كلوريد مخزنة بشكل مؤقت حل الملح بالإضافة إلى 10-4 م أميلوريدي و 10-5 م فورسكولين) بالحصول على 10 مل من خالية من كلوريد مخزنة الملح الحل (الأسهم ب) وإضافة 0.1 مل من 10-2 م أميلوريدي الحل (الأسهم ج) و 0.1 مل من 10-3 م فورسكولين الحل (الأسهم د). تسمية الحاوية واستخدم خلال ساعتين التحضير.
الملحممالوزن الجزيئيغرام/لتر
غلوكونات الصوديوم (الملح أحادية الصوديوم)135218.129,444
غلوكونات الكالسيوم (مسحوق اللامائى)2.2430.40.947
هيبتاهيدراتي سلفات المغنيزيوم (MgCl2.6H2س)1.2246.50.296
فوسفات ديبوتاسيوم (ك2هبو4)2.4174.20.418
مونوبوتاسيوم فوسفات (خ2ص4)0.4136.10.054

الجدول 3: تكوين خالية من كلوريد مخزنة الحل (حل الأسهم ب).

figure-protocol-2
الشكل 2 : موضع الماوس أثناء التروية في الغشاء المخاطي الأنفي. يوضح الشكل لوحة تدفئة (أ)، الفولتميتر (ب)، مسرى مرجع إدراجها في الفضاء تحت الجلد في أطرافهم هند (ج)، الدانية (د) والقاصي (ه) منافذ مضخة تمعجية، وسادة (و)، وورقة السرير (ز). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2-تقييم وإدارة أثناء الاختبار

  1. إعداد الإعداد التجريبية.
    1. للحيلولة دون انخفاض درجة حرارة الجسم أثناء وبعد الاختبار، استخدام اثنين من منصات التدفئة الحفاظ على درجات حرارة الفسيولوجية، واحدة لإعداد قياس (18.8 × 37.5 سم؛ الشكل 2 )، والآخر (15.5 × 15.5 سم) للمربع الذي سوف يوضع الحيوان للانتعاش في نهاية الاختبار.
    2. التبديل على الكمبيوتر محملة بالبرامج لالتقاط البيانات متصلة ببيانات ذاكرة عالية مقاومة الإدخال (> 1012Ω) وعالية الدقة (0.1 mV) الفولتميتر (الشكل 2ب).
    3. قم بتوصيل أقطاب كهربائية الفولتميتر. الاتصال الكهربائي قياس إيجابية بالقسطرة الآنف ومسرى إشارة سلبية إلى القسطرة إدراجها في الفضاء تحت الجلد في أطرافهم هند، كما هو مبين في الشكل 2ج.
    4. تراجع نصائح أقطاب معا في مزيج كريم. تحقق من قيمة الإزاحة الكهربائي الأولية. رفض أقطاب كهربائية إذا كانت القيمة أكبر من المتوسط (±) 2 (من الناحية المثالية 0 mV).
    5. التبديل على مضخة تمعجية وإدراج أنبوب المضخة في الموقف، كما هو مبين في الشكل 2.
    6. قم بتوصيل منفذ الدانية من أنبوب المضخة القنينة التي تحتوي على الحل المحدد لنضح الآنف (الشكل 2د). قم بتوصيل مأخذ القاصي من أنبوب المضخة التجويف نضح القسطرة الأنفية (الشكل 2ه).
    7. ملء التجويف واحد من القسطرة الأنفية مع مزيج كريم المنحل بالكهرباء من خلال تلميح ماصة 10 ميليلتر. التكيف مع القسطرة إلى موصل أنبوب سيليكون (الشكل 1ﻫ) وسد الموصل مع مزيج كريم وإدراج مسرى الإيجابية في الموصل (الشكل 1و). فحص قياس قيمة الإزاحة الكهربائي الجسر. رفض الجسور إذا كانت القيمة أكبر من المتوسط (±) 2 (من الناحية المثالية 0 mV).
    8. ملء التجويف الثاني القسطرة الأنفية مع الحل جديدة A1. تراجع طرف القسطرة الأنفية في القنينة التي تحتوي على حل أ عكس اتجاه مضخة تمعجية لملء طوله القسطرة الأنفية الموافق 10 ق نضح.
      ملاحظة: يسمح هذا التسجيل القيم PD القاعدية لمدة 10 ق قبل تطبيق أميلوريدي. تراجع طرف القسطرة الأنفية في مزيج كريم داخل الموصل بالقطب مرجعية (الشكل 1).
  2. بدء التعامل مع الماوس.
    1. سجل وزن الماوس لحساب جرعة التخدير بالحقن ب الطريق داخل (ip)17دقيقة.
    2. استخدام إبرة ز 26 (0.45 × 10 مم)، حقن تخدير إينترابيريتونيلي لتعزيز تنظيم دورات تعريفية للتخدير: جرعة ثابتة من 50 ميليلتر من الميدازولام 5 ملغ/مل. انتظر لمدة 5 دقائق.
    3. إعداد مزيج مخدر (شيفتشنكو, ميديتوميديني, دروبيريدول تركيزات النهائي 0.05 0.40 و 20 مغ/كغ وزن جسم على التوالي، والكلونيدين جرعة ثابتة من ميكروغرام 0.375) السماح للعمق الأمثل ومستقرة للتخدير (المرحلة الثالثة، الطائرة 2)17 . حقن حجم مزيج مخدر إينترابيريتونيلي، ومن ثم ضخ حجم الكلونيدين.
      ملاحظة: بعد 15 دقيقة، الماوس يجب أن يكون نائماً والتخدير يمكن أن تستمر لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    4. طي ورقة امتصاص الأنسجة لجعل سم 3 واسعة 'وسادة' (الشكل 2و) التي تغطي الجزء العلوي من لوحة التدفئة (الشكل 2) كدعم لرأس الماوس.
    5. تغطية لوحة تدفئة مع ورقة امتصاص الأنسجة ('ورقة السرير'؛ الشكل 2 ز)-وضع الماوس على ظهره على وسادة التدفئة. الشريط أطرافه والذيل (الشكل 2).
    6. إدراج مرجع القسطرة الوريدية (الشكل 1ز) في الفضاء تحت الجلد من أطرافهم هند. إزالة الإبرة والتكيف مع موصل أنبوب سيليكون (الشكل 1ﻫ، ج 2).
    7. شغل القسطرة والموصل مع كريم مزيج وإدراج مسرى السلبية في الموصل (الشكل 1و).
    8. إصلاح القسطرة ومسرى مع الشريط حسب الاقتضاء، لمنع أي التشرد. بعد وضع إشارة القطب والجسور، التحقق من قيمة الإزاحة جسر القطب قياس مرة أخرى بغمس طرف القسطرة الأنفية في المزيج الكهربائي كريم داخل موصل القسطرة الرابع. تسجيل قيمة الإزاحة النهائي مستقرة (ومن الناحية المثالية أقل من المتوسط (±) 2).
    9. إصلاح الماوس آذان مع الشريط "لطيف" على لوحة تدفئة في مساحة حرة بين قطعتين من امتصاص الأنسجة ('وسادة' (الشكل 2و) و 'شرشف سرير'؛ (الشكل 2ز)). إصلاح بيبرس (الشعر الشديدة المتنامية بالقرب من الخياشيم) دون لمس العينين.
    10. لامتصاص السوائل من تجويف الفم، تحريك اللسان جانبية (الشكل 3) وإدراج الفتيل أشار من ورق الترشيح ('الأنابيب'؛ الشكل 3 ب) حوالي 1 سم في الفم. لامتصاص السوائل نفاد منخر perfused، ضع قطعة ثانية من ورق الترشيح ('منديل'؛ الشكل 3 ج) عقدت في طرف الآنف.
    11. تحقق من قيمة تحكم إيجابية لإمكانات الظهارية بوضع طرف القسطرة الأنفية على اتصال بداخل الفم.
      ملاحظة: يجب أن تكون القراءة مستقرة وتتراوح بين-10-20 وأم أم.
    12. عقد مع الملقط الجميلة وتحت الإضاءة المباشرة جيدة، دقة إدخال قسطرة الآنف منخر واحد ما يصل إلى 4-6 مم من الآنف تلميح.
      ملاحظة: يقع القسطرة PD الآنف في كونتشا الأنفي الأوسط في الموضع الذي يعطي الأساس مستقرة القصوى PD قيمة17،20.
    13. 5 دقيقة بعد حقن المخدرات مخدر، بلطف إمالة وسادة تدفئة بحوالي 30° مع الحيوانات الرأس أسفل. مراقبة قيمة PD القاعدية القصوى.
    14. عندما يكون مستقرا على مدى فترة من حوالي 30 ثانية، ابدأ بيرفوسينج الغشاء المخاطي للأنف، بمعدل ثابت من 10 ميليلتر/دقيقة، مع حلول مخزنة 4 (A، A1، B1، B2) على التوالي. نتخلل الحل الأول (الخطوة 1.3.1.1) لمدة 10 ق وكل الحلول التالية (الخطوة 1، 4) لمدة 5 دقائق أو حتى تم التوصل إلى قيمة ثابتة. وقف بيرفوسينج فورسكولين (B2) عندما يبدأ الاستجابة فورسكولين عابر يحدث باستمرار.
    15. حدد فاصل s 1 لتسجيل البيانات. بدء تسجيل البيانات في وقت بدء التروية. عرض البيانات كدالة للزمن على شاشة الكمبيوتر.
    16. التقاط البيانات تتوقف في نهاية التروية مع الحل B2. حفظ البيانات كملف جدول بيانات.
    17. الحصول على البيانات الصحيحة عن طريق طرح قيمة الإزاحة النهائي.

figure-protocol-3
الشكل 3 : وضع الماوس على لوحة تدفئة بالقسطرة الآنف وتصفية ورقات في مكان- ويوضح هذا الرقم اللسان وضع جانبية (أ)، والأنابيب (ب)، ومنديل (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

3-تقييم وإدارة ما بعد الاختبار

  1. حرر زر الماوس من لوحة التدفئة.
  2. مسح الآنف الماوس مع 'الورقة سرير' (الشكل 2ز).
  3. حقن إينترابيريتونيلي خصم مخدر مزيج يتألف من جرعة ثابتة (4 ميكروغرام) من النالوكسون، وخصم المورفين تنافسية، وأتيباميزولي، ترياقا محددة ميديتوميديني (2 مغ/كغ من وزن الجسم).
  4. وضع الماوس على لوحة تدفئة أصغر في المربع استرداد حتى الشفاء التام، التي عادة ما يحتفل بعد ح 1 إلى 2.
    ملاحظة: في المختبر UCL، حوالي 10% وفيات، تتعلق أساسا برونتشواسبيريشن الحلول perfused في تجويف الآنف أثناء الاختبار، ومن الملاحظ بغض النظر عن الجنس أو التركيب الوراثي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بغية توضيح شذوذ النقل أيون مميزة في قوات التحالف، أجريت قياسات PD الآنف يتبع البروتوكول الوارد وصفها أعلاه ماوس F508del-CF وفي عنصر تحكم البرية من نوع الخلفية الوراثية ففب/129 من مستعمرة بروكسل Cftrtm1Eur الفئران30. وهذا النموذج ذات الصلة سريرياً، إيواء الأكثر شيوعاً وواحد من أشد F508del-CFTR الطفرة23،،من2425، هو الأفضل المتاحة حاليا قوات التحالف الماوس النموذجي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والغرض من هذه الورقة وصف بروتوكولا كافية لقياس PD الآنف تحت التروية المستمرة للحلول في شكل عفوي التنفس الفئران لمدة من الوقت المطلوب لاختبار سلامة أيون الناقلين، وأساساً CFTR ايناك. لقد تم تحسين جميع الخطوات للبروتوكول بعناية لضمان استرداد كامل الحيوان ونوعية جيدة واستنساخه بالبيانات. في خطوات حاسمة وخاصة يتم تقييم التخدير وإدارة، وموقف الحيوان الملائم والرعاية أثناء وبعد الاختبار.

الدراسات السابقة التي أظهرت أن الطائرة 2 المرحلة الثالثة تعرض للتخدير، التي يمكن أن يتحقق عن طريق تطبيق خليط الكو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون البروفيسور ج. ليباكق للغاية تحرير المخطوطة. Cftrtm1Eur (متماثل F508del-CFTR (ففب/129) الفئران، وضعت في إيراسموس مولودية، روتردام، "هولندا"، بالدعم من "الجماعة الاقتصادية الأوروبية العمل التنسيق الأوروبي" للبحث في "التليف الكيسي" الاتحاد الأوروبي FP6 لحم-CT-2005-018932.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب البولي إيثيلين Portex  سميث الطبية ، هيث ، كينت ، إنجلترا CT21 6JLPortex 800/100/500 ؛ معرف 2.0 مم ، 3.0 مم ODلإعداد أنابيب شعرية لمسبار الأنف
كريم قطبكهربائي باركر ، فيرفيلد ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكيةكريم Reduxلبناء جسور كهربائية
Ag / AgCl أقطابكهربائية بيوميديكالية ، بلدة كلينتون ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكيةJNS BNT131-1،0أقطاب قياس ومرجعية
أميلوريد هيدروكلوريدسيجما ، سانت لويس ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكيةA7410لإعداد حلول
فورسكولينسيجما, سانت لويس, ميشيغان, الولايات المتحدة الأمريكيةF6886لإعداد حلول التروية
Knick Portamess الفولتميترElektronisch Me& beta; gerä te, Berlin, GermanyPortavo 904 pHلقياس فرق الجهد
Paraly SW 112 Software Elektronisch Me& beta; gerä تي ، برلين ، ألمانيابرنامج Paraly SW112لالتقاط بيانات الفرق المحتمل
midazolam  ؛Mylan, Hoeilaart, BelgiumDormicum 15mg / 3mlلتكون بمثابة مخدر قبل التخدير
الفنتانيلJanssen Cilag, Berchem, بلجيكافنتانيل-يانسن 0.05 ملغ / مللتكون بمثابة دواء مخدر
ميديتوميدينأوريون فارما, إسبو, فنلنداDomitor 1 ملغ / مللتكون بمثابة دواء مخدر
دروبيريدول  Janssen  Cilag ، Berchem ، بلجيكاDehydrobenzperidol 2.5 مجم / ملليكون بمثابة دواء مخدر
كلونيدين   ؛Boehringer Ingelheim Pharma KG ، Ingelheim am Rhein ، ألمانياCatapressan 0.15 مجم / مل ،لتكون بمثابة دواء مخدر
مرجع قسطرة IVBecton Dickinson ، Sandy ، UT ، الولايات المتحدة الأمريكية24 GA × 0.75 بوصة ، BD Insyte-Wلبناء ملقط جسور القطب
  ؛أدوات العلوم الجميلة ، هايدلبرغ ، ألمانيادومون # 5 ، أدوات العلوم الدقيقةلوضع قسطرة الأنف
نالوكسون   ؛براون الطبية ، بروكسل ، بلجيكانارکان ، 0.4 مجم / ملليكون بمثابة مضاد للتخدير
أتيباميزول   ؛Zoetis ، بلومبرج ، بلجيكاأنتيسيدان ، 5 مجم / مللتكون بمثابة ترياق محدد للميدتوميدين   ؛
وسادات التدفئة جهاز هارفارد ، هوليستون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية18،8 × 37،5 سم ؛ 15،5 × 15،5 سملتجنب انخفاض حرارة الجسم أثناء وبعد الاختبار المضخة
التمعجية P1GE Life Sciences ، أوبسالا ، السويد18111091لتحسم المحاليل في غراء السيانوا أكريليت لأنف الفأر
Loctite ، Henkel ، D & uuml ؛ sseldorf, Germany Super Glue 3للصق أنبوبين شعريين معا   ؛ لمسبار الأنف
NaClSigma ، سانت لويس ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكيةRES0926S-A7Pharma-Grade ، USP
CaCl2.2H2OSigma ، سانت لويس ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكيةM7304Pharma-Grade ، USP
MgCl2.6H2OSigma ، سانت لويس ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية1551128فارما ، USP
K2HPO4Sigma ، سانت لويس ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكية1551139فارما الصف ، USP
Na gluconateSigma ، سانت لويس ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكيةS2054فارما الصف ، USP
Ca gluconateSigma ، سانت لويس ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكيةC8231فارما الصف ، USP
MgSO4.7H2Oسيجما ، سانت لويس ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكيةRES0089M-A7فارما الصف ، إبرة USP
BD   ؛بيكتون ديكنسون ، فرانكلين ليكس ، الولايات المتحدة الأمريكية26 جم دينار بحريني (0.45 × 10 مم)حقن داخل الصفاق
التروية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
  2. Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
  3. Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
  4. Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
  5. Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), Pt 1 860-865 (2000).
  6. Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
  7. Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
  8. Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5(2007).
  9. Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
  10. Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
  11. Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
  12. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
  13. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  14. Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
  15. Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
  16. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
  17. Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
  18. Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
  19. Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
  20. Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
  21. Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
  22. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  23. Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
  24. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  25. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
  26. Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
  27. Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
  28. Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
  29. Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, Suppl 2 152-171 (2011).
  30. Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
  31. Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
  32. Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
  33. Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
  34. Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
  35. Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
  36. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  37. Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
  38. Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
  39. Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
  40. Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984(2017).
  41. Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72(2017).
  42. Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O'Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
  43. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة