نقدم هنا، بروتوكولا لعزل فوكوكسانثين الكلوروفيل المكيفات ملزم البروتينات (FCP) من الدياتومات ودمجها في الدهنية مع التراكيب الدهن الطبيعي لدراسة نقل الطاقة الإثارة على تغييرات تكوين أيون.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل وإدماج هوائيات حصاد الضوء من دياتوم مينيغينيانا سيكلوتيلا في الدهنية مع الدهون ثايلاكويد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أداء التمثيل الضوئي للنباتات والطحالب والدياتومات يعتمد بشدة على اللائحة بسرعة وكفاءة لحصاد الضوء والطاقة عمليات نقل في غشاء ثايلاكويد المعايشة. على ضوء حصاد هوائي الدياتومات، ما يسمى فوكوكسانثين الكلوروفيل المكيفات ملزم البروتينات (FCP)، المطلوبة لامتصاص الضوء ونقل تتسم بالكفاءة لرد فعل التمثيل الضوئي المراكز كذلك أما بالنسبة لصور--الحماية من الضوء المفرط. التبديل بين هاتين الوظيفتين مسألة طويلة الأمد للبحوث. العديد من هذه الدراسات قد أجريت مع FCP في المذيلات المنظفات. دراسات التفاعل، أزيلت المنظفات، مما أدى إلى تجميع غير محدد لمجمعات FCP. وفي هذا النهج، من الصعب أن تميز بين القطع الأثرية والبيانات ذات الصلة فسيولوجيا. ومن ثم، يمكن الحصول على أكثر قيمة من المعلومات حول FCP والضوء غشاء ملزمة أخرى حصاد المجمعات بدراسة تفاعلات البروتين البروتين، ونقل الطاقة والخصائص الطيفية الأخرى إذا كانت متأصلة في بيئتها الأصلية في الدهون. والميزة الرئيسية هي أن الدهنية لها حجم محدد ونسبة محددة بدهن/بروتين الذي يتم التحكم في مدى تجميع FCP. علاوة على ذلك، يمكن بسهولة محاكاة التغييرات في تكوين الحموضة وأيون التي تنظم الضوء الحصاد في فيفو . بالمقارنة مع الغشاء ثايلاكويد، الدهنية أكثر تجانساً وأقل تعقيداً، مما يجعل من الأسهل للحصول على وفهم البيانات الطيفية. البروتوكول يصف إجراءات عزل FCP وتنقية وإعداد الحويصلية وإدماج FCP في الدهنية مع تكوين الدهن الطبيعي. ينتج عن تطبيق نموذجي يجري النظر ومناقشتها.
المقدمة
الكائنات التمثيل الضوئي مثل الدياتومات ويجب التعامل مع ظروف الإضاءة المتغيرة والاستجابة مع آليات التأقلم متطورة للحفاظ على كفاءة التمثيل الضوئي عالية وحماية من التلف صور الأكسدة بالضوء المفرط. هو عملية كبيرة واقية من الضوء في التمثيل الضوئي حقيقيات النوى الطاقة عالية التبريد (ه) يمتص الضوء الذي يحدث كمساهمة رئيسية غير الضوئية التبريد (نبق) تحت ظروف الإجهاد الخفيفة1،2 ،3. مجمعات الهوائي الحصاد الخفيفة (LHC) تشارك في تنظيم مسارات نقل الطاقة الإثارة. في استجابة للضوء العالي الناجم عن انخفاض درجة الحموضة في التجويف بلاستيدات الخضراء، مفاتيح نظام الهوائي من ضو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: المجمعات التمثيل الضوئي مثل فيرفااس معرضة بشدة للضوء والحرارة. تعمل دائماً على الجليد وتحت ضوء خافت جداً.
1-عزل FCP من الخلايا
-
عزل ثايلاكويد من الخلايا مينيغينيانا جيم
- تنمو مينيغينيانا جيم في خمس قوارير 500 مل كل مليئة 300 مل من آسيا والمحيط الهادئ-المتوسطة23،25 و 50 مليون من الخلايا. قم بتوصيل قوارير مع سداده القطن وتسمح للخلايا أن تنمو إلى مرحلة النمو الأسى لمدة أسبوع تقريبا على شاكر 120 لفة في الدقيقة مع ح 16 خفيفة وح 8 المرحلة المظلمة في 40 µmol photons/(m²s) الأبيض الضوء ودرجة حرارة بين 15-18 درجة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويصف البروتوكول عزل إجمالي FCP جزء من مينيغينيانا سيكلوتيلا وإدماج ذلك في الدهنية مع تكوين الدهن الأصلي. عزل ثايلاكويد استنساخه بدرجة عالية، ولكن قد يتغير العائد ثايلاكويد. والنتيجة مقبولة إذا كان أكثر من 50% من جميع الصبغات يتم استردادها في خطوة 1.1.4. أكثر من 80% من الأمثل.
سولوبيليزيشن ثيلاكويدس خطوة حاسمة. يتم الحصول على الأغشية solubilized جيدا إذا كانت المادة طافية بعد الخطوة 1.2.2 يحتوي على أكثر من الأصباغ. فصل F.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الدهنية FCP مع تكوين الدهن الطبيعية توفر أداة يدوية وبسيطة واستنساخه للتحقيق في الخصائص الطيفية في المختبر. البيئة المادة الدهنية في FCP الدهنية تشبه الحالة داخل الغشاء ثايلاكويد، مما أدى إلى النتائج التجريبية التي أقرب إلى الظروف الطبيعية.
وهناك العديد من المزايا لاستخدام مينيغينيانا جيم- كنظام نموذجي للهوائي FCP. أنها تنمو بسرعة نسبيا وأكثر قوة بالمقارنة مع غيرها من الأنواع النموذجية دياتوم، مثلاً، ثالاسيوسيرا بسيودونانا. الخلايا كسر سهلة نسبيا في طاحونة حبة، الذي .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونشكر أحمد عديل رنا للمساعدة في تنقية FCP. الأستاذ كلوديا بوشل المسلم لإجراء مناقشات مفيدة وقراءة المخطوطة. هذا العمل كان تدعمها "مؤسسة البحوث الألمانية" إلى دينار (DI1956-1/1) ومؤسسة هومبولدت لزمالة فيودور لنن إلى ld.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 500 مل قوارير | |||
| عالية السرعة مطحنة | حبة Heraeus | ||
| VI 2 | Edmund-B & uuml; hler (edmund-buehler.de) | أحدث إصدار: Vibrogen-Zellmü hle Vl 6 | |
| Silibeads S 400 & micro; m | Sigmund-Lindner.com | 5223-7 | |
| Silibeads S 1،-1،3 مم | Sigmund-Lindner.com | 4504 | |
| قمع مرشح VitraPOR - por1 | ROBU GmbH | 21121 | |
| قوارير طرد مركزي فائق من البولي كربونات (30 مل) ل T-865 | Beranek Laborger & auml ؛ te (Laborgeraete-beranek.de) | 314348 | |
| جهاز طرد مركزي فائق ديسكفري 90SE | سورفال | n.a.rotor | |
| T 865 | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 51411 | |
| عداد خلايا نيوباور (محسنة) | كارل روث لابوربيدارف (Carlroth.com) | T729.1 | |
| زايس ميكروسكوب بريموستار (7) | Optik-Pro (optik-pro.de) | 51428 | |
| كوفيت زجاجي بصري (6040-OG) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | "6040-10-10" | |
| UV-VIS Spectrophotometer (بما في ذلك البرنامج) | جاسكو (jasco.de) | V-630 | |
| n-Dodecyl-&beta - D-Maltopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | D310LA | |
| أنابيب فائقة الوضوح 17 مل ل AH629 | Beranek Laborger ä ؛ te (Laborgeraete-beranek.de) | 344061 | |
| الدوار AH629-17-mL | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 54285 | |
| غشاء concentrator_Centriprep 30 كيلو دالتون قطع | Millipore (merckmillipore.com) | 4307 | |
| Biometra Minigel-Twin | Analytik Jena AG (analytik-jena.de) | 846-010-100 | |
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad (bio-rad.com) | 1610449 | |
| ورقة انتشار المكتب الحرة | أساس | المستند https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/ | |
| كوفيتات زجاجية خاصة للتألق (101-0S) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | 101-10-20 | |
| مقياس الطيف فلوري FP-6500 (بما في ذلك البرنامج) | جاسكو (jasco.de) | FP-6500 | |
| SDS تحميل المخزن المؤقت روتي-لود | روث (carlroth.com) | K929.1 | |
| n-octyl & beta ؛ -D-glucopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | O311 | |
| Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1300 | يصنع محلول مخزون في الكلوروفورم |
| Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1310 | يصنع محلول مخزون في الكلوروفورم |
| Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1230 | يصنع محلول مخزون في الكلوروفورم |
| L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG) | Larodan AB (larodan.com) | 37-0150 | يصنع محلول مخزون في الكلوروفورم |
| L- & alpha ؛ - فوسفاتيديل كولين | سيجما ألدريتش (sigmaaldrich.com) | P3782 SIGMA | يصنع محلول مخزون في حمام سونيكاتير الكلوروفورم |
| S-50TH | سونيكور (getmedonline.com | SONICOR-S-50TH | |
| mini-extruder | أفانتي القطبية للدهون (Avanti.com) | 610000 | |
| غشاء بولي كربونات نوليوبور | أفانتي القطبية للدهون (Avanti.com) | 610005 | |
| غشاء غسيل الكلى فيسكينغ 14 كيلو دالتون قطع | ROTH (carlroth.com) | 0653.1 | يغلي في الماء المقطر قبل الاستخدام |
| Biobebeads SM2 الممتز | Biorad (Bio-rad.com) | 152-3920 | |
| سكروز إيبيكلورهيدرين كوبوليمر - Ficoll 400 | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | F4375 | |
| قوارير طرد مركزي فائق من البولي كربونات (2.7 مل) ل TFT 80.4 | Beranek Laborger & auml ؛ te (Laborgeraete-beranek.de) | 252150 | |
| الدوار TFT 80.4 | Millipore (merckmillipore.com) | 54356 | |
| المواد المدرجة بترتيب المظهر < / em >< / strong > | < em> للحصول على تعليمات سلامة محددة ، يرجى الرجوع إلى أوراق سلامة المواد والكتيبات المكررة. المواد والمواد المختبرية القياسية غير مدرجة.< / em> |
المراجع
- Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
- Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
