بروتوكول خطوة بخطوة لغير تدميري وفترة طويلة رصد عملية إعادة عرض الأوعية الدموية وتدهور سقالة في الثقافة في الوقت الحقيقي القابلة للتحلل الحيوي البوليمرية المستندة إلى سقالة الأنسجة المهندسة الأوعية الدموية مع تحفيز نابض باستخدام التصوير المقطعي التماسك الضوئية هو الموصوفة هنا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
رصد غير تدميري التنمية القابلة للتحلل القائم على سقالة هندسيا أنسجة الأوعية الدموية باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ومن المتوقع لتلبية الطلب المتزايد على تجاوز الشرياني هندسيا ترقيع الأوعية الدموية مع الخصائص الهيكلية والميكانيكية مشابهة للأوعية الدموية الطبيعية. وصف ديناميات النمو وعملية إعادة تشكيل للبوليمرات القابلة للتحلل القائم على سقالة هندسيا أنسجة الأوعية الدموية (تيبفس) مع تحفيز نابض أمر حاسم لهندسة الأنسجة الوعائية. تقنيات التصوير الضوئي تبرز بوصفها أدوات فعالة لرصد الأوعية الدموية لهندسة الأنسجة مما يتيح التصوير عالي الدقة في الثقافة في الوقت الحقيقي. يوضح هذه الورقة التصوير استراتيجية لرصد النمو غير تدميري وسريعة في الوقت الحقيقي وإعادة عرض من تيبفس في ثقافة طويلة الأجل باستخدام التصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT). يتم تقييم التشكل الهندسي، بما في ذلك عملية إعادة تشكيل الأوعية الدموية، وسمك الجدار، ومقارنة لسمك تيبف في نقاط زمنية مختلفة الثقافة ووجود التحفيز نابض. وأخيراً، توفر الإمكانيات العملية للمراقبة في الوقت الحقيقي من تدهور البوليمر في إعادة بناء الأنسجة تحت التحفيز نابض أكتوبر أو لا وفي كل قطعة من السفينة، بالمقارنة مع تقييم استخدام البوليمر تدهور مسح microscopic(SEM) إلكترون ومجهر مستقطب.
المقدمة
إجراء هندسة عكسية أنسجة الأوعية الدموية (تيبفس) من المواد الواعدة كوسيلة مثالية الاختلاس الأوعية الدموية1. بغية وضع الطعوم سريرياً مفيدة مع الخصائص الهيكلية والوظيفية المماثلة كسفن الأصلي، قد صممت تقنيات متعددة للحفاظ على وظيفة الأوعية الدموية2،3. رغم أنه كانت هناك سفن هندسيا مع معدلات مقبولة سالكيه خلال غرس وفي "المرحلة الثالثة من" الدراسة السريرية4، ثقافة طويلة الأجل وعالية التكلفة أيضا إظهار ضرورة رصد تطور تيبفس. فهم عمليات النمو ويعيد البناء، والتكيف matrix(ECM) خارج الخلية في تيبفس في البيئة الميكانيكية والكيماوي المحاكاة البيولوجية يمكن أن توفر معلومات حيوية لتطوير هندسة الأنسجة الوعائية.
ينبغي أن تكون استراتيجية مثالية تتبع تطور سفن المهندسة الصغيرة قطرها5 غير تدميري، عقيمة، والطولي، ثلاثي الأبعاد والكمية. ويمكن تقييم تيبفس تحت ظروف ثقافة مختلفة بهذه الطريقة التصوير، حتى بما في ذلك التغييرات قبل وبعد زرع الأوعية الدموية. هناك حاجة إلى استراتيجيات لوصف السمات لسفن المعيشة إجراء هندسة عكسية. تسمح تقنيات التصوير الضوئي للتصور والتقدير الكمي لترسب الأنسجة والمواد الحيوية. المزايا الأخرى هي إمكانية تمكين تصوير الأنسجة العميقة وخالية من التسمية مع دقة عالية6،7. ومع ذلك، الجزيئات الخاصة بالصورة، والمعدات البصرية أقل سهولة للرصد في الوقت الحقيقي هو عائقا عمليا كبيرا، يحد من التوسع في تطبيق الفحص المجهري الضوئي غير الخطية. التصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT) نهج بصرية بطريقة التصوير داخل الأوعية كأداة سريرية المستخدمة على نطاق واسع لتوجيه العلاج التدخلي القلب8. في الأدب ذكر طريقة أكتوبر كوسيلة لتقييم سمك الجدار تيبفس9،10، مقترنة بطرائق التصوير الإيجابي لبحوث هندسة الأنسجة الوعائية. في حين، هندسة القوى المحركة للأوعية الدموية النمو ويعيد البناء لم يلاحظ.
في هذه المخطوطة، نحن بالتفصيل إعداد القابلة للتحلل الحيوي البوليمرية تيبفس القائم على سقالة للثقافة أربعة أسابيع. توسيع نطاق خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية الشرايين الحبل السري البشري (هواسمكس) والمصنف إلى سقالات حمض (PGA) بوليجليكوليك القابلة للتحلل مسامية في مفاعل حيوي. وتلعب الدور في ركيزة مؤقتة لهندسة الأنسجة البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي بعض تدهور معدل11. بغية ضمان تطابق مناسبة بين تدهور سقالة وتشكيل النسيج الجدد، السقالات إدارة المحتوى في المؤسسة والمنظمة عوامل حاسمة لفعالية إعادة عرض الأوعية الدموية. نظام التروية يحاكي المكروية النشاط الحيوي للسفن الأصلية وتحتفظ تشوه يتمشى تحت ضغط التحفيز.
وهدف البروتوكول المقدم وصف استراتيجية بسيطة نسبيا وغير تدميري تيبفس التصوير والرصد طويل الأجل للثقافة. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتصور تغييرات الشكلية وقياسات سمك السفن هندسيا تحت ظروف ثقافة مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تحليلات لتدهور المواد المستندة إلى البوليمر في الأنسجة الهندسة السقالات لتحديد. عن طريق الجمع بين أساليب المسح الإلكترون microscopic(SEM) والاستقطاب المجهر المستخدمة في هذا البروتوكول والارتباط والتحديد الكمي لتوزيع المصفوفة خارج الخلية وتدهور الشبكة أن أمكن، التي يمكن أن تيسر تقييم سقالة تدهور جنبا إلى جنب مع تصوير OCT.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التحلل الشبكة سقالة على أساس "الثقافة سفن" هندسة الأنسجة
- تصنيع السقالة الشبكة
- خياطة شبكة البرلمانيين (19 مم وسمكه 1 مم) حول أنابيب سيليكون تعقيمها بأكسيد الإيثيلين (طول 17 سم وقطرها 5.0 مم 0.3 مم) باستخدام خياطة 5-0.
- خياطة تترافلوروايثيلين (ابتفي، طول 1 سم) مع خياطة 4-0 على كل نهاية لشبكة البرلمانيين وتتداخل من 2 مم.
- تراجع السقالات الشبكة باليد في 1 مول/لتر هيدروكسيد الصوديوم لمدة 1 دقيقة ضبط الهيكل المكاني للشبكة ونقع مع زراعة الأنسجة الصف المياه ثلاث مرات لكل 2 دقيقة. بات بلطف جاف السقالة مع ورقة الأنسجة في كل مرة. ثم تجف السقالات في غطاء مع منفاخ ح 1.
- الجمعية من مفاعل حيوي و Y-ملتقى لتصوير أكتوبر
- نقع مفاعل حيوي أسطواني الزجاج نمواً ذاتيا (قطرها 10 سم و 11.7 سم في الارتفاع مع الشفاه الأربعة داخل وأربعة أذرع جانبية خارج المفاعل كما هو مبين في الشكل رقم 1)، الشبكة السقالات، أنبوب سيليكون (القطر الخارجي 5 مم، سمك 0.3 مم)، أنابيب متوافق حيويا والموصلات، بار ضجة ومعدات للجمعية في خزان إيثانول 95% ح 2.
- سحب سقالة الشبكة عن طريق الأسلحة الجانبية لمفاعل حيوي متصل بجانب واحد مع موصل، فضلا عن جانب آخر مع Y-مفترق الطرق المستخدمة لتسليم أكتوبر جويديويري. تجميع سقالة الشبكة آخر في مفاعل حيوي نفس الطريقة. يرجى الرجوع إلى الشكل 1.
- احتواء ابتفي الشفاه مفاعل حيوي بتشديد مع خيوط 4-0.
- وضع في مفاعل حيوي في خزان الإيثانول مرة أخرى ح 1 وتجف بين عشية وضحاها في هود مع منفاخ في.
- بذر هواسمكس وتكييف مفاعل حيوي ثابت
- عزل هواسمكس من شرايين الحبل السري البشري عن طريق تقنيات explant القياسية.
- قم بتوسيع، والحفاظ على الخلايا في العضلات الملساء الخلية النمو المتوسطة تتألف من المتوسطة دميم، 20% مصل بقرى الجنين، 2.36 مغ/مل حبيس، 100 يو/مليلتر البنسلين G، 50 ميكروغرام/مل برولين، 20 ألانين ميكروغرام/مل، 50 ميكروغرام/مل جليكاين، 1.5 ميكروغرام/مل CuSO4، وحمض الأسكوربيك 50 ميكروغرام/مل ، عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية نانوغرام/مل 10 و 10 نانوغرام/مل عامل النمو المشتقة من الصفيحات.
- هواسمكس البذور بتركيز × 10 56 خلايا/مل في المتوسط الثقافة أعلاه على السقالات الشبكة.
- وضع ضجة بار (طول 1.5 سم) مفاعل حيوي. إدراج أنبوب تغذية واحد (بقطر 5 ملم، وطول 15 سم)، وثلاثة أجزاء الأنابيب قصيرة (قطرها 5 مم، وطول 7 سم) لتبادل الغازات عن طريق غطاء سداده سيليكون.
- إرفاق PTFE 0.22 ميكرون المرشحات لكل أنبوب تغير الجو وكاب الهيبارين واحد لأنبوب تغذية. ضبط شريط إثارة مع التحريك بسرعة 13 طلقة في الدقيقة الواحدة. تجميع الزجاج مفاعل حيوي وغطاء سداده السيليكون وسقالة الشبكة في نظام الثقافة.
- السماح هواسمكس على الالتزام لمدة 45 دقيقة قبل يميل مفاعل حيوي كل 15 دقيقة مع حامل، إلى اليسار واليمين. منافذ المفاعل والمفاصل كلها مختومة مع الفيلم البارافين.
- الاتصال لوه-يي مضخة، حقيبة برنامج تلفزيوني، برنامج التشغيل بواسطة أنابيب متوافق حيويا كنظام التروية. افتح محرك الأقراص لملء الأنابيب مع برنامج تلفزيوني.
- مكان مفاعل حيوي عموما في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية. ملء قاعة الثقافة مع 450 مل متوسط الثقافة هواسمكس.
- اضغط على زر إيقاف وتشغيل إيقاف الطاقة لجهاز محرك الأقراص. تنمو السقالات المصنف ضمن ثقافة ثابتة لمدة أسبوع واحد.
- تغيير المتوسطة الثقافة كل 3-4 أيام قبل يسفط نصف المتوسط القديم عن طريق التغذية اﻷنبوبية وإعادة الملء المفاعل بمبلغ معادل من جديد الثقافة المتوسطة.
- إعداد نظام التروية لتصوير أكتوبر
- مضخة سوائل في كيس برنامج تلفزيوني أن تعمم عن طريق أنابيب متوافق حيويا والعودة إلى الحقيبة.
- فتح السلطة من برنامج التشغيل وتنظيم وضع المضخة بتردد 60 نبضة في الدقيقة والإخراج systolic ضغط 120 ملم زئبق. ضبط معلمات الميكانيكية وفقا لاحتياجات زراعة الأنسجة الوعائية الهندسية.
- انقر فوق الزر تشغيل لجعل نظام التروية العمل. توفير التحفيز نابض ثابتة أعلاه للسفن لمدة 3 أسابيع بشكل تكراري الضغط أنابيب متوافق حيويا10،12 بعد أسبوع الثقافة ثابتة.
2-القيام بالتصوير الضوئي مع أكتوبر
- استخدام مصدر ضوء لضمان حل محوري 10-20µm وعمق صورة 1-2 مم لتحديد هيكل تيبف استناداً مجال التردد أكتوبر منتثر داخل الأوعية التصوير النظام9.
- قم بتشغيل مفتاح الطاقة وفتح برنامج التقاط الصور.
- قم بتوصيل الألياف البصرية التصوير القسطرة تحكم محرك الأقراص والحركية والبصرية (DOC) مع القسطرة معتكف التلقائي وظيفة.
- تعيين معلمات معدل اقتناء الصورة إلى 10 الإطارات في الثانية مع بسرعة انسحاب تلقائي من 10 مم/s.
- إرفاق القسطرة التصوير إلى تقاطع Y عن طريق كاب الهيبارين مع إبرة 18 جرام.
- وضع القسطرة في أنبوب السيليكون وتحديد ضيق خياطة لشبكة البرلمانيين قبل تحميل سقالة المنظمة على مفاعل حيوي.
- تلميح مكان القسطرة فوق المنطقة للفائدة. ضبط الجهاز الانسحاب والتحقق من جودة الصورة8.
- الحصول على الصور في 1، 4، 7، 10، 14، 17، 21، 28 يوما في الثقافة لكل تيبف الفردية وحفظ التسلسل مع مراقبة الوقت الحقيقي من المجهرية تيبف، بما في ذلك مورفولوجيا السطحية والبنية الداخلية وتكوينها.
- كرر قياس 3 مرات للحصول على قياس موثوق بها السفن هندسيا في كل مرة. التقاط سلسلة من الصور في جميع أنحاء الاختبار باستخدام برامج التقاط الصور.
3-تصوير التحليل
- استخدام برمجيات تحليل الصورة لقياس سمك الجدار تيبف. قم بتحديد الصورة ليتم تحليلها. انقر فوق أداة التتبع التعرف على الجانب الداخلي من تيبف من البرنامج تلقائياً ويدويًا رسم الجانب الخارجي. رسم تخطيطي لسمك سوف تظهر على الشاشة.
- كرر قياس 5 مرات للحصول على قياس موثوق بها من بنيات. تحليل أكتوبر أجرى من قبل اثنين من المحققين المستقلين أعمى للمعلومات التي تم الحصول عليها.
4-الحصاد تيبف وتجهيز الأنسجة
- فتح غطاء سداده سيليكون وضعها فوق مفاعل حيوي عند الانتهاء من الثقافة وتجاهل المتوسطة الثقافة. قم بفك ابتفي من مفاعل حيوي الشفاه وقطع أنابيب سيليكون من الجانب الخارجي من ابتفي مع المقص. حصاد تيبفس من مفاعل حيوي وقطع إلى أقسام لمسح فحص المجهر الإلكتروني.
- أخذ ما تبقى تيبفس ومقطعة 4 ميكرومتر سميكة المقاطع. سحب أنبوب سيليكون الداعمة وإصلاح الأجزاء مع بارافورمالدهيد 4%. أداء روتينية النسيجي تلطيخ من ماسون في تريتشرومي وسيريوس الأحمر دراسة مورفولوجية الكولاجين والشبكة10،،من1314.
- تقييم محتوى الشبكة والكولاجين المكون، مراقبة عينات نسيجية مع سيريوس الأحمر تلطيخ مجهر مستقطب. مخلفات الشبكة يتم تحديدها ومن الواضح من خلال إنكسار مزدوج ومنطقة بقايا يمكن قياسها كمياً على أساس مساحة مقطعية10.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نظام الثقافة ثلاثي الأبعاد يتألف من دائرة الثقافة في مفاعل حيوي ونظام التروية مع10،دورة السائل مغلقة13 (الشكل 1). القسطرة التصوير أكتوبر إدراجها في نهاية ص-التقاطع القاصي وانسحبت في أنبوب السيليكون للتصوير. كان أول من استخدم التصوير أكتوبر لتحديد هيكلية توصيف القابلة للتحلل الحيوي البوليمرية تيبفس القائم على سقالة أثناء زراعة مفاعل حيوي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لإنشاء تصميم السفن مع الهيكلية والميكانيكية خصائص مماثلة لتلك التي الأصلي الأوعية الدموية يمكن أن يؤدي إلى تقصير وقت الاستخدام السريري وهو الهدف النهائي للهندسة والأوعية الدموية. تقنيات التصوير الضوئي يسمح التصور من الأنسجة المهندسة مكونات محددة الأوعية الدموية، التي لا يمكن رصد ثوابت الفردية في جميع أنحاء الطعوم الثقافة والتعرض لبيئة ثقافة دون المساس بالعقم7. في هذه المقالة، يتم فصل دائرة الثقافة من نظام التروية. ويضمن النظام نضح مستقلة نسبيا انخفاض خطر التلوث من خلال الثقافة ووضع جويديويري أكتوب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن الكتاب لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
ونود أن نعترف بالعلم والتكنولوجيا مشروع التخطيط "مقاطعة قوانغدونغ الصينية" (2016B070701007) لدعم هذا العمل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
شبكة أنبوب سيليكون نظام OCT داخل الأوعية الدموية كول معهد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| PGA | Synthecon | ||
| موصل كول بارمر | |||
| بارمر | |||
| سانت جود الطبية ، وشركة | ILUMIEN & trade ؛ OPTIS™ نظام | ||
| المسح الإلكتروني المجهري | فيليبس | FEI فيليبس XL-30 | |
| مجهر مستقطب | أوليمبوس | أوليمبوس أوليمبوس BX51 | |
| خيوط | جونسون آند مضخة جونسون | ||
| النابضة | قوانغدونغ للقلب والأوعية الدموية | ||
| برنامج LightLab Imaging | St. Jude Medical، Inc |
المراجع
- Chan-Park, M. B., et al. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).
- Ballyns, J. J., Bonassar, L. J. Image-guided tissue engineering. Journal of Cellular & Molecular Medicine. 13, 1428-1436 (2009).
- Smith, L. E., et al. A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering. Microscopy Research & Technique. 73, 1123-1133 (2010).
- Chang, W. G., Niklason, L. E. A short discourse on vascular tissue engineering. NPJ Regenerative Medicine. 2, (2017).
- Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering. Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).
- Rice, W. L., et al. Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy. Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).
- Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 3335-3339 (2010).
- Zheng, K., Rupnick, M. A., Liu, B., Brezinski, M. E. Three Dimensional OCT in the Engineering of Tissue Constructs: A Potentially Powerful Tool for Assessing Optimal Scaffold Structure. Open Tissue Engineering & Regenerative Medicine Journal. 2, 8-13 (2009).
- Gurjarpadhye, A. A., et al. Imaging and characterization of bioengineered blood vessels within a bioreactor using free-space and catheter-based OCT. Lasers in Surgery and Medicine. 45, 391-400 (2013).
- Chen, W., et al. In vitro remodeling and structural characterization of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered vascular grafts using optical coherence tomography. Cell & Tissue Research. 370, 417-426 (2017).
- Naito, Y., et al. Characterization of the natural history of extracellular matrix production in tissue-engineered vascular grafts during neovessel formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
- Ye, C., et al. The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).
- Chen, W., et al. Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).
- Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis. American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).
- Martinho, J. A., et al. Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography. Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).
- Poirierquinot, M., et al. High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding. Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).
- Naito, Y., et al. Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model. Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).
- Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
