لقد قمنا بتطوير سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف لاستخراج البيانات الكمية من دراسات بيولوجية الخلية المستندة إلى تصوير fluorescence تجميع البروتين والتمويه أوتوفاجيك في الجهاز العصبي المركزي لنماذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بيولوجيا الخلية كمية من نيوروديجينيريشن في المورفولوجية من خلال تحليل غير منحازة للبروتينات فلوريسسينتلي المعلمة باستخدام إيماجيج
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مع تزايد انتشار أمراض الأعصاب، من المهم فهم الفيزيولوجيا المرضية الكامنة التي تؤدي إلى الخلل في الخلايا العصبية وفقدان. تكنولوجيات وأدوات التصوير القائم على الأسفار تمكين تحليل لم يسبق لها مثيل للعمليات العصبية الحيوية سوبسيلولار، ومع ذلك لا يزال هناك حاجة إلى اتباع نهج غير متحيز، واستنساخه، وموجودا لاستخراج البيانات القابلة للقياس الكمي من التصوير الدراسات . قمنا بتطوير سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف لاستخراج البيانات الكمية من دراسات التصوير القائم على الأسفار باستخدام نماذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن. على وجه التحديد، يمكننا وصف نهج شبه الآلي، وسهلة لمتابعة استخدام فيجي/إيماجيج لتحليل العمليات الخلوية هما: أولاً، نحن قياس محتوى البروتين الكلي والشخصية في الفص البصري المورفولوجية استخدام المسخ معلم فلوري البروتينات هونتينجتين؛ وثانيا، نقيم التمويه يحلول أوتوفاجي في نظام البصرية المورفولوجية الكمي على أساس راتيوميتريك لمراسل الفلورسنت جنبا إلى جنب مع أوتوفاجي. الأهم من ذلك، يتضمن البروتوكول الواردة هنا خطوة تقسيم شبه الآلي لضمان يتم تحليل جميع الهياكل الفلورية إلى أدنى حد تحيز الانتقاء وزيادة دقة مقارنات دقيقة. يمكن توسيع هذا النهج لتحليل الهياكل البيولوجية الأخرى الخلية وعمليات متورطين في نيوروديجينيريشن، مثل بونكتا البروتينية (حبيبات الإجهاد ومجمعات متشابك)، كذلك غشاء ربط الأجزاء الأخرى (الميتوكوندريا و غشاء الحويصلات الاتجار بالبشر). يوفر هذا الأسلوب الموحد، بعد إشارة قابلة للتكيف نقطة لتحليل الصور والقياس الكمي، ويمكن تيسير والموثوقية وإمكانية تكرار نتائج عبر الحقل، وفي نهاية المطاف تعزيز فهم الميكانيكية نيوروديجينيريشن.
المقدمة
أمراض الأعصاب تؤثر على ملايين الناس كل عام، وهو تزايد حالات الإصابة شيخوخة سكان1. بينما كل مرض الأعصاب مسببات فريدة من نوعها، يتم تجميع البروتينات تجمعات وانهيار شبكة بروتيوستاسيس بصمات المرضية الشائعة لكثير من هذه الأمراض. توضيح كيفية تعطيل هذه العمليات المترابطة والأساسية تخفق لتسهم في وفاة الخلل والخلايا العصبية أمر بالغ الأهمية لفهم أمراض الأعصاب، فضلا عن توجيه التدخلات العلاجية. تصوير المستندة إلى الأسفار يسمح للتحقيق في هذه العمليات المعقدة والديناميكية في الخلايا العصبية، وقد ساهم إلى حد كبير في فهمنا لبيولوجيا الخلايا العصبية. تحليل البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة يمثل تحديا، لا سيما عندما يتم إجراء التجارب في فيفو، سبب الأنسجة المدمجة عالية وأنواع الخلايا المختلفة وعدم تجانس الخصائص المورفولوجية. ساعد يدوياً التقدير الكمي هو بأسعار معقولة وواضحة، ولكن في كثير من الأحيان مضيعة للوقت وعرضه للتحيز البشري. ولذلك، هناك حاجة لنهج غير متحيز، واستنساخه، وموجودا لاستخراج البيانات القابلة للقياس الكمي من التصوير الدراسات.
وقد اوجزنا سير عمل بسيطة وقابلة للتكيف باستخدام فيجي/إيماجيج، صورة قوية، ويمكن الوصول إليها بحرية تجهيز البرمجيات2،3، لاستخراج البيانات الكمية من دراسات التصوير fluorescence في نماذج تجريبية من نيوروديجينيريشن استخدام المورفولوجية. باتباع هذا البروتوكول التحديد الكمي لتجميع البروتين والتمويه أوتوفاجيك – هما الخلية السمات البيولوجية التي ذات صلة وثيقة بعلم الأمراض مرض الأعصاب-أظهرنا حساسية وإمكانية تكرار نتائج هذا النهج. وكشف تحليل البروتينات هونتينجتين متحولة المعلمة فلوريسسينتلي (Htt) في الفص البصري المورفولوجية في عدد وحجم وكثافة المجاميع البروتين. يمكننا تصور مراسل فلورسنت جنبا إلى جنب للتمويه أوتوفاجيك داخل النظام المرئي المورفولوجية ، الذي يعرض إشارات الانبعاثات المختلفة تبعاً للبيئة يغلب4. التحليل القائم على راتيوميتريك للمراسل جنبا إلى جنب يسمح لطريقة عرض الكمية وشاملة للتمويه يحلول أوتوفاجي من تشكيل أوتوفاجوسومي، والنضج، والنقل إلى تدهور في يحلول، وأبرز بالإضافة إلى ذلك ضعفا المقصورات تعطلت في ظروف الأعصاب. الأهم من ذلك، في كل التحليلات نفذنا خطوات العتبة وتجزئة شبه الآلي لدينا بروتوكول للتقليل من التحيز فاقداً للوعي وزيادة قوة أخذ العينات وتقدم معياراً تيسير إجراء المقارنات بين دراسات مماثلة. سير العمل مباشرة يهدف إلى جعل قوية الإضافات فيجي/إيماجيج (وضعها علماء الكمبيوتر على أساس خوارزميات الرياضيات) أكثر يسرا نيوروبيولوجيستس والمجتمع علوم الحياة بصفة عامة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-الاعتبارات والتحضير لتصميم التجربة تحليل الصورة
- تحدد مسبقاً الخلوية التشريحية، مناسبة، أو علامات سوبسيلولار لتكون بمثابة معالم لتوحيد منطقة الاهتمام (ROI) عبر عينات مختلفة، على سبيل المثال 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، علامات غشاء، فلوري مترجمة البروتين، و ما إلى ذلك
- حدد علامة نيون يمكن تحديد بونكتا منفصلة تتجاوز مستويات الخلفية للهيكل للفائدة.
ملاحظة: هذا البروتوكول هو الأمثل للهياكل البروتينية (مثلاً، المجاميع تجمعات البروتين) وربط الغشاء العضيات (مثلاً، مراسل أوتوفاجي). تصور تجميع البروتين، كان جزء بلغة الطرفي ن معلم طلب تقديم العروض للبشرية Htt البروتين مع قطعة polyQ المسببة للأمراض ليكرر 138 (RFP-hHttQ138) تستخدم5. ويشكل البروتين Htt متحولة المجاميع هيولى عندما أعرب عن إطار العصبية برامج معينة مثل elav-GAL45،6. تصور أوتوفاجوسومي-يحلول التمويه، استخدمت أكتين-GAL4 أوبيكويتوسلي محرك التعبير عن مراسل مشري-التجارة والنقل-Atg8a جنبا إلى جنب. بونكتا مشري وبروتينات فلورية خضراء إيجابية تشير إلى أوتوفاجوسوميس، وهو رصد التدفق كما هو مروي fluorescence التجارة والنقل في بيئة حامضية يحلول، حيث يبقى مشري غير متحسسة لحمض حتى البروتين هو المتدهورة7. لتحليل راتيوميتريك، قناة واحدة هو علامة متسقة للهيكل يمكن استخدامه لتجزئة، أو إذا كان ذلك مناسباً إسقاطاً لقناتين أو أكثر يمكن استخدامها لتحديد هياكل، على الرغم من عدم وضوح المبينة في هذا البروتوكول. في هذا المثال، يتم استخدام مشري لتجزئة جزيئات Atg8 إيجابية، كما أنها غير متحسسة لحمض وسيبقي في المقصورة في جميع أنحاء التمويه من خلال المسار. - قم بتحميل وتثبيت منصة مفتوحة المصدر تحليل الصورة إيماجيج أو فيجي – المجمعة المفضل توزيع إيماجيج مع الإضافات2،3.
- قم بتثبيت البرنامج المساعد ح-ماكسيما التفاعلية مستجمعات المياه.
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول فيجي؛ ملحقات إضافية قد تكون مطلوبة من أجل إيماجيج. الأداة الإضافية وضعتها لومباردوت بينوا لصندوق إنقاذ الطفولة-معهد ماكس بلانك-CBG هو متاح على شبكة الإنترنت (https://imagej.net/Interactive_Watershed). - انتقل إلى "مساعدة | تحديث "، حدد" تحديث إدارة المواقع "من" التحديث إيماجيج "، اختر موقع التحديث SCF-معهد ماكس بلانك-CBG من القائمة، ثم قم بإغلاق وإعادة فيجي.
2-الدماغ التشريح وتلطيخ الفلورة
-
جعل سيليكون الاستومر مبطنة تشريح الأطباق.
- صب سيليكون الاستومر المكونات في كوب كما يتبين من الشركة المصنعة ويقلب جيدا حتى تمتزج جيدا.
- استخدام ماصة تعبئة 5 سم كامل أطباق زراعة الأنسجة الثلث إلى النصف (حوالي 10 مل مخلوط الاستومر). السماح لأي فقاعات الصعود إلى السطح وإزالة بلطف بالمناديل الورقية. تغطية الأطباق ووضعها على سطح مستوى لعلاج ح 48 – 72 في درجة حرارة الغرفة (RT).
-
تشريح الدماغ المورفولوجية ، ونظام البصرية إذا لزم الأمر.
- إجراء تشريح الدماغ المورفولوجية كما هو موضح سابقا8،9. إجراء التشريح في تشريح مبطنة الاستومر الأطباق، استخدام أسفل الاستومر على استقرار الدماغ لتجنب الأنسجة المدمرة أو الملقط.
- للحفاظ الصفيحة سليمة خلال التشريح، الشريحة الملقط اثنين تحت الشبكية ولطف المسيل للدموع خلال منتصف العين لإزالة الشبكية. سحب بعيداً أي نسيج الشبكية التي تعلق على الصفيحة مع الملقط الذي عقد موازيا لسطح الصفيحة.
ملاحظة: الصباغ المتبقية سوف يغسل في الخطوات التالية، وعادة لا تتداخل مع جسم تلطيخ والتصوير. - تمييع 37% فورمالدهيد في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) جعل تركيز نهائي من 3.7% الطازجة قبل استخدامها في أنبوب ميكروسينتريفوجي 500 ميليلتر. نقل تشريح الدماغ إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مع حل واحتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت مع هزاز لطيف.
ملاحظة: قد فورمالدهايد ميلا طبيعيا إلى أن تتأكسد، تنتج حمض الفورميك. ولذلك، من المقترح إلى قاسمة 37% فورمالدهيد للتخزين وتمييع إلى 3.7% طازجة قبل كل استعمال. تثبيت الزائد أو الناقص التثبيت سوف تؤثر على سلامة الأنسجة والأسفار10. - أغسل 3 مرات مع ببتكس (برنامج تلفزيوني مع 0.4% Triton X-100) لمدة 15 دقيقة.
-
أداء إيمونوهيستوتشيميستري وجبل العينات.
- إذا كانت هناك حاجة إلى تلطيخ جسم، إزالة ببتكس وإضافة جسم الابتدائي المخفف في ببتكس بمصل الماعز العادي 5% واحتضان المعني خلاط الكوة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إزالة الأجسام المضادة الأولية ويغسل 3 مرات مع ببتكس لمدة 15 دقيقة. إضافة الأجسام المضادة الثانوية المخفف في ببتكس بمصل الماعز العادي 5% واحتضانها ح 1 في الرايت أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية. أغسل 3 مرات مع ببتكس لمدة 15 دقيقة.
- إذا كانت هناك حاجة إلى تلطيخ DAPI، إزالة ببتكس، إضافة حل DAPI (الأسهم الحل: 5 ملغ/مل، تمييع لتركيز عمل من 15 ميكروغرام/مل في ببتكس)، واحتضان لمدة 10 دقيقة في الرايت الغسيل 3 مرات مع ببتكس لمدة 15 دقيقة.
- لمسح الأنسجة، ضع قطره من تصاعد المتوسطة في وسط شريحة مجهرية مع فاصل طبقة واحدة من الشريط واضحة على كلا الجانبين. نقل الدماغ إلى انخفاض المتوسط المتصاعدة، والانتظار لمدة 1 – 2 دقيقة حتى الدماغ يصبح شفافاً. بعناية إزالة المتوسطة المتصاعدة مع ماصة.
- لتحميل، تطبيق قطره من تصاعد الطازجة المتوسطة على العقول على الشريحة. تراكب زجاج غطاء تجنب فقاعات بعناية. ختم الحواف مع الأسمنت المطاط، وأيردري على RT ل 20 دقيقة المضي قدما للحصول على الصور للحصول على أفضل النتائج.
3. الحصول على الصور
- تحسين المجهر اكتساب المعلمات، بما في ذلك القرار المكانية، والهدف، والتكبير، وسرعة المسح الضوئي، وخطوة الحجم، إلى أقصى حد القرار هياكل الفائدة تيسيرا لتجزئة شبه الآلي أثناء تحليل الصور.
ملاحظة: قد يكون من المفيد التقاط صورة عينة واختبار تجزئة شبه الآلي (في الخطوة 5 من هذا البروتوكول) قبل التصوير جميع العينات التجريبية. وبهذه الطريقة يمكن للمستخدم ضبط إعدادات التصوير حيث أن الأدوات التحليلية يمكن أن نستشف سهولة الهيكل البيولوجي للفائدة. -
ضبط الصورة للكشف عن ضوابط للقبض على أعلى نسبة إشارة إلى الضجيج وأعلى النطاق الديناميكي للعينة.
- استخدام طرفية (انظر الجدول) التي تشير إلى التشبع بكسل (التعرض عالية جداً) أو أونديرساتوراتيون (الإزاحة منخفضة جداً) بينما ضبط إعدادات (الشكل 3B، الأحمر يشير إلى التشبع بكسل "طرفية" مرحبا/منخفضة).
- تحقق من إعدادات مكسب والإزاحة المناسبة لجميع المجموعات التجريبية، التلاعب التجريبية المحتمل يغير هيكل الفائدة.
ملاحظة: من الضروري أن تستخدم نفس الإعدادات لكافة المجموعات لإجراء مقارنات كمية.
- الصورة عن طريق الأنسجة لالتقاط كافة البيانات.
ملاحظة: من المستحسن لالتقاط كافة البيانات المتاحة خلال جلسة التصوير وتحديد منطقة أكثر دقة أثناء تحديد العائد على الاستثمار في الخطوة 4 إذا لزم الأمر. - حفظ الصورة كنوع ملف تدعمها برامج التصوير من أجل الحفاظ على البيانات الوصفية مثل الحصول على المعلمات ومعايرة المكانية. حفظ الصورة باسم ملف بما في ذلك الأجسام المضادة التاريخ والخلفية الوراثية والصحفيين الفلورسنت، تجريبي، أو الأصباغ المقابلة للقنوات الممسوحة ضوئياً مثل _Ch1 _ [تاريخ التجربة] _ [اسم العينة] [اسم المجموعة التجريبية]. [Fluorophore-الهدف /Dye]_Ch2.[Fluorophore-target/Dye]، إلخ
4-فيجي/إيماجيج صورة الاستيراد وتحديد العائد على الاستثمار
- فتح صورة في فيجي. استخدم مربع الحوار "خيارات استيراد تنسيقات بيو"، اختر "عرض مكدس مع: هايبرستاك" وتعيين "وضع الألوان: الرمادي".
ملاحظة: من المستحسن لفتح نوع ملف المجهر، كبيانات التعريف مثل معايرة المكانية يمكن قراءته بواسطة فيجي. -
تحديد منطقة من z-طائرة واحدة أو إسقاطات تستند علامة قناة (ق) التي يمكن استخدامها كعائد موحدة عبر العينات (الشكل 1، تحديد العائد على الاستثمار).
- استخدم شريط التمرير "ج" لعرض قناة (ق) التي تستخدم لالتقاط marker(s) المعينة في الخطوة 1، 1.
- استخدم شريط التمرير "Z" للتحرك من خلال الطائرات المحورية. اختر شريحة واحدة أو إنشاء إسقاطاً لشرائح متعددة عن طريق النقر فوق "الصورة | مكدسات | المشروع Z "وتعيين" بدء شريحة "و" إيقاف شريحة "ليشمل العائد على الاستثمار.
ملاحظة: تعيين نوع ''الإسقاط "إلى" كثافة ماكس "في مشروع" Z "مربع الحوار هو غالباً الأنسب للتأكيد على هياكل لتجزئة في القسم 5، على الرغم من أن هذا قد لا يكون مناسباً لجميع التطبيقات. إذا كان نوع آخر من الإسقاط اللازمة للتحليل، الحرص على حفظ وتوثيق هذا الملف على هذا النحو لاستخراج ميزة في القسم 6 أو 7. - إنشاء صورة جديدة تحتوي على قناة (ق) والتنسيق plane(s) من الفائدة لتبسيط الخطوات التالية في بروتوكول تحليل الصورة. حدد "صورة | مكرر "، المطلوب" القنوات "(c) و" الشرائح "(z)، وقم بتغيير اسم الملف لعكس التحديد (مثلاً، _ _ [اسم العينة] [اسم المجموعة التجريبية] [تجربة date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]).
- استخدم واحدة من "أدوات التحديد" على شريط الأدوات فيجي يدوياً تحديد عائد موحدة استناداً إلى معايير الاختيار المحددة في الخطوة 4، 2.
- إضافة العائد على الاستثمار إلى إدارة العائد على الاستثمار بواسطة النقر فوق "تحليل | أدوات | إدارة العائد على الاستثمار "وانقر فوق" إضافة "في قائمة إدارة العائد على الاستثمار. حفظ دوروا من قائمة إدارة العائد على الاستثمار بواسطة النقر فوق "أكثر | حفظ "، وقم بتسمية الملف ليعكس العائد على الاستثمار (مثلاً، _ _ قناة [(ق)] _ [تاريخ التجربة] _ [اسم العينة] [اسم المجموعة التجريبية] [z-plane(s)] _ [وصف دوروا]).
ملاحظة: هذا يمكن أن يعاد في فيجي لتحليلات لاحقة، أو يمكن تطبيقها على الصور كما هو الحال في القسم 5.3 أو قنوات أخرى.
5-تجهيزها وتجزئة مع واتيرشيدينج ح-ماكسيما
-
القيام بتجهيزها على القناة المستخدمة لالتقاط الهياكل للفائدة.
- إذا كان ملف الصورة يتكون من قنوات متعددة، فصل القنوات بواسطة النقر فوق "الصورة | لون | تقسيم القنوات "لعزل القناة للفائدة.
- تطبيق عامل تصفية مثل عامل تصفية الوسطية للحد من الضوضاء أو التمويه الضبابي لتجانس بواسطة النقر فوق "عملية | مرشحات | تصفية نوع "(مثلاً،" متوسط عامل التصفية "أو" التمويه الضبابي ").
- أخذ عينة من مرشحات مختلفة وتصفية المعلمات في الصور من كل مجموعة تجريبية. المضي قدما من خلال الخطوة 6، 2 على سبيل المثال ممثل من كل فريق لفحص أداء تجزئة. حدد الإعدادات التي تسهل تجزئة الهياكل للفائدة والتصفية.
- سجل عامل التصفية، وإعدادات. وتنطبق هذه المعلمات عبر المجموعات التجريبية.
- حفظ نسخة من الصورة كملف tiff بما في ذلك عامل التصفية المطبق للرجوع إليها. استخدم اسم مفصلة مثل _ _ [قناة] _ [تاريخ التجربة] _ [اسم العينة] [اسم المجموعة التجريبية] [z-plane(s)] _ [عامل التصفية مع المعلمات].
-
إجراء تجزئة الهياكل للاهتمام باستخدام أداة تفاعلية ح-ماكسيما مستجمعات المياه في معالجة الصورة التي تم إنشاؤها وحفظها في الخطوة 5، 1.
- مع معالجة الصورة النشطة في فيجي، بدء الأداة التفاعلية لمستجمعات المياه ح-ماكسيما بواسطة النقر فوق "صندوق إنقاذ الطفولة | وسم | H_Watershed التفاعلية ".
ملاحظة: هذا البرنامج المساعد أولاً يحسب مستجمعات المياه وثم تسمح للمستخدم باستكشاف آثار ماكسيما المحلية وخيارات عتبة على تجزئة من خلال صورة إخراج على الفور محدثة. - من لوحة التحكم، ضبط ديناميات البذور (ح) وكثافة عتبة (T) وذروة الفيضان (٪) لتحسين تجزئة.
ملاحظة: دائماً الرجوع إلى الصورة الخام قبل تجهيزها من 4.2 القسم يدوياً فحص أداء تجزئة الهياكل للفائدة. - عندما راضية عن نتائج تجزئة، حدد "تصدير قناع المناطق" واختر "تصدير". سيؤدي هذا إلى إنشاء صورة ثنائي نتائج مستجمعات المياه (الشكل 1، تجزئة).
- تسجيل المعلمات تجزئة؛ تحتاج هذه المعلمات ليتم تطبيقها عبر المجموعات التجريبية للمقارنات الكمية. حفظ قناع نتائج ثنائي إذا رغبت للرجوع إليها مع معلمات تجزئة مفصلة في الاسم مثل _ _ [قنوات] _ [تاريخ التجربة] _ [اسم العينة] [اسم المجموعة التجريبية] [z-plane(s)] _ _ [عامل التصفية مع معلمات] [معلمات H_Watershed].
- مع معالجة الصورة النشطة في فيجي، بدء الأداة التفاعلية لمستجمعات المياه ح-ماكسيما بواسطة النقر فوق "صندوق إنقاذ الطفولة | وسم | H_Watershed التفاعلية ".
-
استخراج هياكل الفائدة من نتائج لمستجمعات المياه.
- فتح دوروا المحفوظة من 4.4 خطوة، في إدارة العائد على الاستثمار. مع قناع ثنائي المناطق من الخطوة 5.2.4 النشطة، وتحديد العائد على الاستثمار من المدير ROI تطبيقها على الصورة للحد من استخراج ميزة للعائد على الاستثمار الموحد.
- عائدات الاستثمار النشط في قناع ثنائي لمستجمعات المياه، اختر "تحليل | تحليل الجزيئات "مع" إضافة إلى إدارة "المحدد في مربع الحوار لاستخراج السمات.
ملاحظة: هذا سوف تضيف معرفاً جسيمات لكل بنية محددة من خلال تجزئة إلى إدارة العائد على الاستثمار. تتوفر خيارات هذه القائمة استبعاد الميزات استناداً إلى حجم أو تدوير إذا لزم الأمر لتحسين هياكل المدرجة في التحليل. - حفظ الجزيئات بواسطة النقر فوق "أكثر | حفظ "من القائمة" إدارة "العائد على الاستثمار. تأكد من أن يتم إلغاء تحديد معرفات وجميع الجزيئات سيتم حفظ كافة في ملف مضغوط. استخدم اسم مفصلة مثل _ _ [قنوات] _ [تاريخ التجربة] _ [اسم العينة] [اسم المجموعة التجريبية] [z-plane(s)] _ [عامل التصفية مع المعلمات] _ _ [H_Watershed معلمات] [البنى].
6-الكمية والمنطقة، وكثافة التقدير الكمي وتحليل
- قم بفتح الصورة الخام التي تم إنشاؤها وحفظها في الخطوة 4، 2. قم بالتمرير إلى القناة المستخدمة لالتقاط الهياكل للفائدة.
ملاحظة: من الضروري أخذ قياسات كثافة من الصورة الخام (قبل تجهيزها) كتطبيق عوامل التصفية في الخطوة 5، 1 التغييرات في قيم بكسل. - فتح الجسيمات التي تم الحصول عليها من استخراج ميزة في الخطوة 5، 3 وحدد "إظهار الكل" من إدارة العائد على الاستثمار.
ملاحظة: هذا الإجراء سوف تراكب مخطط تفصيلي لكل جسيم على "عائد الاستثمار مدير" على الصورة ويجب أن تطابق حواف الهياكل للفائدة (الشكل 1، استخراج ميزة). - تعيين القياسات المطلوبة بواسطة النقر فوق "تحليل | تعيين قياسات ".
ملاحظة: يمكن قياس المنطقة وكثافة وكثافة الجسيمات عن طريق اختيار "المجال" و "كثافة المتكاملة". عندما يتم تحديد كثافة المتكاملة، فيجي سوف تنتج قيمتين: 'المتكاملة الكثافة' تحسب كنتاج للمنطقة ومتوسط قيمة الرمادي و 'المتكاملة الكثافة من الخام' تقاس كمجموع قيم بكسل. ويحسب كثافة البروتينات الفلورية في الجسيمات كمجموع قيم بكسل مقسمة حسب المنطقة. عدد الجسيمات التي تم إنشاؤها في الخطوة 5، 3 يشير إلى كمية الجسيمات داخل الأنسجة عائد الاستثمار المحددة في الخطوة 4، 4. - من القائمة إدارة العائد على الاستثمار، اختر "التدبير". يتم التعبير عن النتائج في وحدات معايرة طالما يتم أخذ القياسات من ملفات المستمدة في فيجي من برامج التصوير. نسخ النتائج من إطار النتائج ولصقه في برنامج جدول بيانات لتجميع والمزيد من العمليات الحسابية.
7-راتيوميتريك الكمي وتحليل البيانات
- اتبع الخطوات 6.1 و 6.2 لفتح معرفات الجسيمات في القناة الخام الأولى من الفائدة.
- تعيين القياسات المطلوبة بواسطة النقر فوق "تحليل | تعيين قياسات ".
ملاحظة: يمكن قياس كثافة متوسط كل الجسيمات عن طريق اختيار "تعني قيمة الرمادي". - حدد من إدارة العائد على الاستثمار "التدبير". نسخ البيانات من إطار النتائج ولصقه في برنامج جداول البيانات.
- حرك شريط التمرير "ج" للقناة الثانية الخام ذات الاهتمام، والتجارة والنقل في هذا المثال (الشكل 4 أ)، وكرر الخطوات من 7.2. و 7-3.
ملاحظة: سوف الافتراضية الجسيمات بحفظه في الخطوة 5، 3 إلى القناة والشريحة التي تم إنشاؤها. الحرص على ضمان تطبيق الجسيمات للقناة الصحيحة للفائدة. - حساب نسبة الكثافة من قناة واحدة لشدة الثانية لكل الجسيمات في برنامج جدول بيانات.
-
استخدام مخطط مبعثر لتصور وتحديد كمية البيانات راتيوميتريك من فلوروفوريس الذي يحمل تغييرات فردية تعكس العمليات البيولوجية الأساسية.
- إنشاء مخطط مبعثر في برامج الرسوم البيانية.
ملاحظة: تمثل كل نقطة بيانات هيكل للاهتمام حيث كثافة فلوروفوري الأولى للاهتمام هو "القيمة x" وكثافة فلوروفوري الثاني هو "القيمة y" تقاس من كل الجسيمات. - تعيين النابضة عتبات لكل فلوروفوري لتعريف الأرباع.
- إنشاء مخطط مبعثر في برامج الرسوم البيانية.
-
استخدام خط الشخصية لتصور شدة fluorophore عبر بنية للفائدة.
- حدد عائدات الاستثمار التي تم إنشاؤها في الخطوة 5، 3 واستخدام أداة الخط المستقيم على شريط الأدوات لرسم خط مستقيم من خلال العائد على الاستثمار. أضف السطر العائد على الاستثمار إلى إدارة العائد على الاستثمار.
- لكل قناة من اهتمام، مع خط عائد الاستثمار النشط، حدد "تحليل | ارسم الشخصية ".
ملاحظة: سيقوم بإنشاء الدالة الشخصية مؤامرة مؤامرة الرسم بياني، وجدول لقيم كثافة على طول الخط. قياس نتائج نسخة من كل قناة ولصق في برنامج جداول البيانات لإنشاء قطعة عرض كل القنوات على طول الخط.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
التحديد الكمي لعدد ومجال، وكثافة للمعلمة فلوريسسينتلي المجاميع Htt المسخ في الفص البصري المورفولوجية
للتحقيق في تجميع البروتين تجمعات في الجهاز العصبي المركزي لنموذج المورفولوجية لمرض هنتنغتون، معلم RFP المسخ Htt البشرية مع غير المرضية (UAS-RFP-hHttQ15) أو توسيع المرضية ( UAS-RFP-hHttQ138)، وأعرب المشترك تحت سائق عموم العصبية elav-GAL4غشاء بروتينات فلورية خضراء (UAS-mCD8::GFP)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن استخدام البروتوكول الواردة هنا قوة وتكاثر كوانتيتاتي خلية العمليات البيولوجية التي تصور بتصوير المستندة إلى الأسفار. السياق البيولوجي والقيود التقنية بحاجة إلى النظر بعناية لتوجيه تصميم تجريبي. علامات مضيئة من هياكل سوبسيلولار للفائدة، سواء المناعي، صبغي، أو أعرب وراثيا، بحاجة إلى تكون مميزة فوق الخلفية بالتشكل وكثافة. نظام UAS/GAL4 يستخدم على نطاق واسع محرك التعبير الجيني المستهدف في المورفولوجية. تستخدم الأمثلة المقدمة هنا خطوط المحورة وراثيا تحمل السائقين GAL4 لتنشيط نسخ بروتينات المعلمة فلوريسس...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
هذا العمل تدعمه شيلا، وديفيد فوينتي الأعصاب الألم برنامج الدراسات العليا زمالة بحثية (إلى J.M.B.)، وبرنامج الزملاء حياة البابا لويس (للبنود و Y.Z. و J.M.B.)، "زمالة مؤسسة" سنايدر-روبنسون بريدوكتورال (للبنود)، تي جون د. . مؤسسة ماكدونالد (للبنود)، العقود، منح من المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) HHSN268201300038C و R21GM119018 و R56NS095893 (R.G.Z.)، ومشروع الباحث تايشان (مقاطعة شاندونغ، جمهورية الصين الشعبية) (إلى R.G.Z.).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| SYLGARD (R) 184 مجموعة المطاط الصناعي المصنوعة من السيليكون | Dow Corning Corporation | PF184250 | طبق تشريح |
| Falcon 35 مم غير معالج TC سهل الإمساك بأسلوب بكتريولوجي | طبق بتري Corning | 351008 | طبق تشريح |
| Dumont # 5 ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 11251-20 | أداة تشريح |
| محلول كلوريد الصوديوم | Sigma | S3014 | PBS |
| فوسفات الصوديوم ثنائي السمك | محلول Sigma | S5136 | PBS |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | Sigma | P5655 | PBS |
| حل Triton ؛ X-100 | Sigma | T9284 | محلول الغسيل والأجسام المضادة. |
| 37٪ الفورمالديهايد | VWR | 10790-710 | تثبيت |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي يمكن التخلص منها (0.5 مل ، أزرق) | VWR | 89000-022 | التثبيت والغسيل وحاضنة الأجسام المضادة. |
| صغيرة عادية وبلورية (25 مرة; 75 مم) | VWR | 48312-004 | شرائح للتصوير متحد البؤر |
| نظارات الغطاء الصغير ، مستطيلة (22 مرة ؛ 40 مم) | VWR | 48393-172 | شرائح للتصوير متحد البؤر |
| المطاط الأسمنت | الوحل | 1051-A | تصاعد |
| VECTASHIELD المضاد للتلاشي تصاعد مختبرات ناقلات متوسطة | ، Inc. | H-1000 | تصاعد |
| سكوتش ماجيك 810 شريط غير مرئي (19 مم & مرات ؛ 25.4 م) | شركة 3M | 810 | تصاعد |
| مصل الماعز العادي | ثيرمو فيشر العلمي | PCN5000 | الأجسام المضادة incubaton |
| DAPI (4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole، Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | تلطيخ الحمض النووي. يذوب في الماء منزوع الأيونات لعمل محلول مخزون 5 مجم / مل ويخزن عند -80 درجة مئوية. جم / مل في PBTx. |
| 3.5X-90X ستيريو تكبير التفتيش المجهر الصناعي | AmScope | SM-1BNZ | نطاق التشريح. مجهزة بإضاءة مزدوجة معقوفة 6W |
| ImageJ / Fiji | NIH | v1.51u | مع SCF_MPI_CBG المكونات الإضافية (الإصدار 1.1.2) |
| FV1000-IX81 مجهر المسح الضوئي بالليزر المحوري | أوليمبوس | ||
| المؤتلف بناء | مركز مخزون بلومنجتون ذبابة الفاكهة | BL37749 |
المراجع
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671(2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model. Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057(2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887(2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257(2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
