يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب

13K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58055

⸱

مايو 16, 2019

 ,  ,  , 
1Departament of Animal Science, Institute for Animal Science and Technology (ICTA), Universitat Politècnica de València (UPV), 2Animal Technology and Research Center (CITA), Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)

في هذه المقالة

ملخص

وتجري تقييمات مستمرة لتقنيات الإنجاب المساعدة (الفنون) لتحسين النتائج والحد من المخاطر المرتبطة بها. تصف هذه المخطوطة اجراء لنقل الاجنه بالحد الأدنى من التوغل مع بروتوكول فعال للحجز بالتبريد يسمح باستخدام الأرانب كنموذج حيواني مثالي لتكاثر البشر.

الملخص

وتؤثر تقنيات الإنجاب المساعدة (الفنون) ، مثل ثقافة الاجنه في المختبر أو التجميد الجنيني ، علي أنماط التنمية الطبيعية التي تترتب عليها عواقب ما قبل الولادة وبعدها. لضمان البراءة من التطبيقات الفنية ، والدراسات في النماذج الحيوانية ضرورية. الاضافه إلى ذلك ، وكخطوه أخيره ، تتطلب دراسات تنميه الاجنه تقييم قدرتها علي تطوير نسل صحي كامل الأجل. هنا ، لا غني عن نقل الاجنه إلى الرحم للقيام بأي تجربه ذات صله بالفنون.

وقد استخدم الأرنب كنموذج الكائن الحي لدراسة تكاثر الثدييات لأكثر من قرن. بالاضافه إلى قربها الوراثي للأنواع البشرية وحجمها الصغير وتكلفه صيانتها المنخفضة ، فان لها خصائص انجابيه مهمة مثل الاباضه المستحثة ، والتسلسل الزمني للتطور الجنيني المبكر علي غرار البشر والحمل القصير التي تسمح لنا لدراسة عواقب تطبيق الفن بسهوله. وعلاوة علي ذلك ، يتم تطبيق الفنون (مثل حقن السائل المنوي داخل الجنين ، وثقافة الاجنه ، أو التجميد) مع الكفاءة المناسبة في هذا النوع.

باستخدام تقنيه نقل الاجنه بالمنظار وبروتوكول الحفظ بالتبريد المقدمة في هذه المقالة ، ونحن وصف 1) كيفيه نقل الاجنه من خلال تقنيه سهله وطفيفه التوغل و 2) بروتوكول فعال للتخزين علي المدى الطويل من الأرنب الاجنه لتوفير القدرات اللوجستية المرنة الوقت والقدرة علي نقل العينة. وتشير النتائج التي تم الحصول عليها بعد نقل أجنه الأرانب في مراحل تنموية مختلفه إلى ان المستنقع هو المرحلة المثالية لشفاء ونقل أجنه الأرانب. التالي ، فانه يلزم نقل الاجنه الجنينية ، مما يبرر العملية الجراحية. وعلاوة علي ذلك ، يتم بنجاح المزجج الأرنب الاجنه ومنظار نقلها ، مما يثبت فعاليه التقنيات الموصوفة.

المقدمة

وبهدف تجاوز العقم البشري أو تحسين نشر الماشية ذات القيمة الجينية العالية والحفاظ علي الموارد الوراثية الحيوانية ، فان مجموعه من التقنيات تسمي مجتمعه تكنولوجيات الإنجاب المساعدة ، مثل الاباضه الفائقة ، في تم تطوير الإخصاب الأنبوبي ، وثقافة الاجنه ، أو التجميد ،1،2. حاليا ، يتم إعطاء العلاجات الهرمونية لتحفيز المبيضين وإنتاج عدد كبير من بصيلات المبيض عدد الجريبات الغاريه1. البويضات التي يتم جمعها من هذه البصيلات يمكن نضجها ، المخصبة ، وتطويرها في المختبر حتى يتم اما بالتبريد أو نقلها إلى الأمهات البديلة3. ومع ذلك ، خلال هذه العلاجات ، ويتعرض الامشاج و تخليق ملقح لسلسله من العمليات غير الفسيولوجية التي يمكن ان تتطلب التكيف الجنين للبقاء علي قيد الحياة في هذه الظروف4،5. هذا التكيف هو ممكن بسبب اللدونة الجنين في وقت مبكر ، والذي يسمح التغييرات الجنينية في التعبير الجيني والبرمجة التنموية6. ومع ذلك ، يمكن ان تؤثر هذه التعديلات علي المراحل اللاحقة من تطور الجنين حتى سن الرشد ، ومن المقبول علي نطاق واسع الآن ان الأساليب والتوقيت وإجراءات التجميد أو الظروف الثقافية تظهر نتائج مختلفه علي مصير الجنين7 , 8. لذلك ، لتوضيح الآثار المستحثة محدده من الفنون ، واستخدام نماذج الحيوانية تتميز جيدا لا مفر منه.

وقد حدثت أول ولادة حيه موثقه ناتجه عن نقل أجنه ثدييه في ال18909. اليوم ، نقل الاجنه (ET) إلى انثي بديله هو خطوه حاسمه في دراسة الآثار الناجمة عن الفن خلال مرحله ما قبل الغرس علي مراحل تطوير الاجنه اللاحقة10. تقنيات ET تعتمد علي حجم والهيكل التشريحي لكل الحيوانية. وفي حاله النماذج الحيوانية الكبيرة الحجم ، كان من الممكن القيام بعمليات ET عن طريق تقنيات ET غير جراحيه لعنق الرحم ، ولكن في قسطرة الأنواع الأصغر حجما من عنق الرحم هي أكثر تعقيدا وتستخدم التقنيات الجراحية في كثير من الأحيان11. ومع ذلك ، يمكن ان يسبب الجراحة ET نزيف التي يمكن ان تضعف زرع ونمو الجنين ، والدم يمكن ان تغزو تجويف الرحم ، مما تسبب في وفاه الجنين10. ولا تزال التقنيات غير الجراحية عبر عنق الرحم تطبق في البشر ، والبالونات ، والأبقار ، والخنازير والفئران12،13،14، 15،16،17، ولكن الجراحية لا تزال تستخدم ETs في أنواع مثل الماعز والأغنام أو الحيوانية الأخرى التي تمثل صعوبات اضافيه10،18،19،20،21، مثل الأرانب (اثنين الاجهزه المستقلة) أو الفئران (حجم صغير). ومع ذلك ، تميل أساليب النقل الجراحية تدريجيا إلى استبدالها بطرق اقل الغازية. واستخدم التنظير الباطني لنقل الاجنه ، علي سبيل المثال ، في الأرانب والخنازير والتاملات الصغيرة18و19و20. ويمكن استخدام هذه الطرق التنظير طفيف التوغل لنقل الاجنه في أمبول عن طريق infundibulum ، وهو أمر ضروري في الأرانب وأظهرت اثار مفيده في بعض الأنواع20. ويستند هذا إلى اهميه الحوار الصحيح بين الجنين والام خلال مراحل الاجنه المبكرة في القناة. وكما ذكر أعلاه ، فان أعاده عرض الاجنه التي تجري في الأرانب اثناء هجره الاجنه من خلال القناة الهوائية ضرورية لتحقيق الاجنه القادرة علي زرع22،23.

نماذج الحيوانية أكبر حجما ، مثل الأبقار ، هي مثيره للاهتمام لان السمات البيوكيميائية وما قبل الغرس مماثله لتلك الموجودة في الأنواع البشرية24. ومع ذلك ، الحيوانية الكبيرة مكلفه للغاية لاستخدامها في التجارب الاوليه ، وتعتبر القوارض نموذجا مثاليا (76 ٪ الكائنات الحية النموذجية هي القوارض) للبحوث المختبرية25. ومع ذلك ، فان نموذج الأرنب يوفر بعض المزايا علي القوارض في الدراسات الانجابيه ، كما ان بعض العمليات البيولوجية الانجابيه التي عرضها البشر هي أكثر تشابها في الأرانب من تلك الموجودة في الفئران. الإنسان والأرانب تقديم مماثله الوراثية الجنينية تنشيط الجينوم ، والذواقة وبنيه المشيمة الأرقاء. الاضافه إلى ذلك ، باستخدام الأرانب فمن الممكن ان نعرف التوقيت الدقيق للإخصاب ومراحل الحمل بسبب الاباضه المستحثة25. الأرنب دورات الحياة قصيرة ، واستكمال الحمل في 31 يوما والوصول إلى سن البلوغ في حوالي 4-5 أشهر ؛ الحيوانية من السهل التعامل معها بسبب سلوكها المنصاع وغير العدواني ، وصيانتها اقتصاديه جدا بالمقارنة مع حساب الأكبر من الماشية. وعلاوة علي ذلك ، من المهم ان نذكر ان الأرانب لديها الرحم المزدوج مع اثنين من cervixes مستقله11،25. هذا يضع الأرنب في وضع تفضيلي ، كما يمكن نقل الاجنه من المجموعات التجريبية المختلفة إلى نفس الحيوانية ، ولكن في قرن الرحم مختلفه. وهذا يتيح لنا مقارنه كل من الآثار التجريبية ، والحد من عامل الامومه من النتائج.

اليوم ، غير الجراحية أساليب ET ليست في استخدامها في الأرنب. بعض الدراسات التي أجريت في أواخر 90s باستخدام تقنيه ET عبر عنق الرحم أسفرت عن انخفاض معدلات التسليم تتراوح بين 5.5 ٪ إلى 20.0 ٪11،26 مقابل 50-65 ٪ من الطرق الجراحية ، من بينها اجراء تنظير البطن الموصوفة من قبل Besenfelder و Brem18. معدلات النجاح المنخفضة لهذه الطرق غير الجراحية ET في الأرانب تتزامن مع عدم وجود أعاده عرض الاجنه اللازمة في القناة ، والتي يتم تجنبها في الناقلات العنقية. هنا ، ونحن وصف فعاله الحد الأدنى من الجراحة بالمنظار ET الاجراء باستخدام الأرانب كنموذج الكائن الحي. هذا الأسلوب يوفر نموذجا لمزيد من البحوث الانجابيه في الحيوانية الكبيرة والبشر.

لان الأرانب لديها نافذه زمنيه ضيقه بشكل خاص لغرس الاجنه ، ET في هذا النوع يتطلب درجه عاليه من التزامن بين المرحلة التنموية للجنين في ET والوضع الفسيولوجي للمستلم27. في بعض الحالات ، بعد العلاج التناسلي الذي يبطئ نمو الجنين (مثل الثقافة الانبوبيه) أو يغير من تقبل بطانة الرحم (مثل علاجات الاباضه) ، لا يوجد تزامن بين الجنين ورحم الام. ويمكن ان تؤثر هذه الحالات سلبا علي النتيجة. للرد في هذه السياقات ، ونحن وصف الفعالة الأرنب مورلي التزجيج البروتوكول الذي يسمح لنا لوقفه ، وتنظيم واستئناف التجارب. وهذه العملية مستصوبه من النواحي اللوجستية للدراسات الانجابيه وتتيح لنا القدرة علي تخزين الاجنه علي المدى الطويل ، مما يسمح بنقلها. الاجراء بالمنظار واستراتيجيات الحفظ بالتبريد تسمح بتخطيط أفضل للدراسات مع عدد اقل من الماشية. التالي ، فان منهجيتنا توفر مزايا صحية واقتصاديه وتتوافق مع مفهوم 3Rs (الاستبدال والتخفيض والصقل) للبحوث الحيوانية مع الهدف المعلن لتحسين العلاج البشري للحيوانات التجريبية. وهكذا ، مع هذه الأساليب ، والأرانب تشكل كائن نموذجي مثالي لاختبارات التكاثر في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع الإجراءات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة وفقا للتوجيه 2010/63/EU EEC للتجارب الحيوانية واستعرضتها ووافقت عليها اللجنة الاخلاقيه لتجريب الماشية في الجامعة الvalènciaه ، اسبانيا (قانون البحث: 2015/VSC/PEA/00170). XGD ، FMJ ، MPVC و JSV يحمل شهادة تفويض صادره عن الاداره الحكومية بلنسية لتجربه علي الحيوانية. ويؤذن ل XGD في الموقع بالاشراف علي رعاية ورعاية الماشية اثناء التجربة.

1. نقل الاجنه

  1. اعداد الإناث المستفيدات
    1. استخدام الإناث الناضجة جنسيا فقط (> 4.5 أشهر من العمر).
    2. قبل أسبوع واحد من ET ، وتكييف الإناث إلى 16 ح الضوء/8 ح النظام المظلم لبدء نمو جرابي وتعزيز تقبل الإناث.
    3. حدد الإناث المتلقية ، ومراقبه العمق واللون من الفرج. إذا كان الفرج هو العكر والمحمر ، والأنثى تقبلا.
    4. الحمل بالورم الكاذب (الاباضه) من خلال حقنه عضلية واحده من 1 ميكروغرام من خلات بوسريلين (التناظرية الاصطناعية من هرمون الإفراج عن تروج) بغض الجسم عن وزنه.
      ملاحظه: عاده ، 0.8 ميكروغرام هو جرعه مناسبه لتحريض الاباضه في الأرانب متوسطه الحجم (4-5 كجم) ، لذلك 1 ميكروغرام يضمن عموما الاباضه.
    5. حمل الاباضه قبل أيام عديده كعمر الاجنه ليتم نقلها (علي سبيل المثال ، 70-72 h قبل الطازجة مورلي ET).
  2. التخدير والتسكين
    1. تزن الأرنب وتحميل التخدير والمسكنات التالية.
      1. في حقنه 1 مل مع ابره 30G: تحميل اكسيليازين (5 مغ/كغ) وبوبرينورفين هيدروكلوريد (0.03 ملغ/كغ). في حقنه أخرى 1 مل مع ابره بيريكرانيال 23G, تحميل هيدروكلوريد الكيتامين (35 مغ/كغ).
    2. امسكي الأرنب واحقني خليط الزيازين-البوبرينورفين عضل.
    3. ادخل ابره بيريكرانيال مع الكيتامين في وريد الاذن الحديه ، ببطء إدخال جميع محتويات حقنه عن الوريد.
    4. إصلاح الابره وتركها ادراجها في جميع انحاء الخطوات المتبقية لأداره المزيد من التخدير إذا لزم الأمر.
    5. ترك الأرنب في القفص (نظيفه ودون اي الأخرى الحيوانية) في مرحله دافئه.
    6. مره واحده فاقد الوعي ، وتطبيق مرهم العين لتجنب جفاف العين والتحقق من عدم وجود freflex جفني.
      ملاحظه: هذا البروتوكول يوفر التخدير الجراحي الطائرة لمده لا تقل عن 30 دقيقه. إذا كان مطلوبا وقتا أطول, حقن جرعات اضافيه مع نصف كميه من هيدروكلوريد الكيتامين وصفها في 1.2.1 بعد 30 دقيقه.
    7. راقب عمق التخدير عن طريق التحقق من الدواسة المنعكسة وحركه التنفس. تشير التغيرات في نمط التنفس إلى معدل غير منتظم وأسرع إلى فقدان المستوي المناسب من التخدير.
    8. مراقبه لون الاغشيه المخاطية (العينين والشفتين ، الخ) ، ومعدل التنفس (30-60 الأنفاس في الدقيقة الواحدة) ، ومعدل ضربات القلب (120-325 نبضه في الدقيقة) ودرجه الحرارة المستقيم (38-39.6 درجه مئوية).
    9. قبل ثماني ساعات من النقل ، وحجب الطعام من الحيوانية لتجنب أكبر حجم الأمعاء والنشاط حتى يتم الانتهاء من عمليه ET. اترك حريه الوصول إلى الماء.
  3. اعداد الاجنه
    1. سخن وسائل الاعلام الخاصة بمعالجه الاجنه إلى 25 درجه مئوية: القاعدة المتوسطة (BM) ، المكونة من محلول الفوسفات المخزن في دولبيكو (DPBS) المكمل بنسبه 0.2% (w/v) من زلال مصل الأبقار.
    2. العمل تحت المجسم ، شطف الاجنه الطازجة أو المذابة (الخطوة 2) مع BM.
    3. باستخدام القفازات المعقمة ، قم بإرفاق قسطرة فوق الجافية مكونه بشكل مناسب 17 جرام إلى حقنه 1 مل.
    4. يستنشق 1 سم من BM في القسطرة ، تليها فقاعه الهواء الصغيرة.
    5. يستنشق 5-7 أجنه في حجم 10 μL من BM ، تليها فقاعه الهواء الصغيرة الأخرى.
    6. الانتهاء من تحميل القسطرة عن طريق الشفط 1 سم من BM.
  4. نقل الاجنه
    1. النظر في استخدام قفازات معقمه ، ثوب وقناع لضمان بيئة معقمه.
    2. تعقيم الاداات الجراحية ، وتنظيف الأسطح حيث سيتم اجراء الجراحة ، ويمسح لهم مع 70 ٪ الايثانول.
    3. اجراء التخدير كما هو مفصل سابقا (الخطوة 1.2) ، والتحقق من فقدان ردود الفعل.
    4. حلق الفراء من البطن البطني مع الحلاقة الكهربائية.
    5. اعداد البطن بطني بشكل اسيبكالي.
      1. تنظيف المنطقة الجراحية وأزاله اي الشعر المتبقية. اغسل المنطقة الجراحية بصابون غلوكونات الكلورهسيدين. تعقيم المنطقة مع محلول الكلوركهيكسيدين و الايثانول 96 º (3 مرات).
    6. وضع الحيوانية علي طاوله الجراحية الدافئة ، في موقف Trendelenburg (الراس إلى أسفل في 45 درجه) للتاكد من ان المعدة والأمعاء وتقع في الجمجمة. النظر في اخلاء المثانة إذا كان العكر. إذا تضررت اي الأحشاء في هذه العملية ، قد يموت الحيوانية. ولذلك فمن المهم ان يكون لها مكان مناسب (الشكل 1).
    7. تغطيه المنطقة باستخدام منشفه معقمه ، مع ثقب (الفيستاستين) تعريض المنطقة حليق ، لفصل الموقع الجراحي من اي مناطق تلوث المحتملة.
    8. ادراج واحده مبزل بالمنظار 5 سم في تجويف البطن ، 2 سم الذيليه إلى عمليه الخنجري ، وغير كافيه من خلال ذلك التجويف البريتوني مع الضغط-تنظيم الميكانيكية inسوفيلاتور.
      ملاحظه: يجب ان يكون الضغط داخل البطن 8-12 مم زئبق مع CO2 (الشكل 1a).
    9. ادخل كاميرا المنظار من خلال المنظار التنظيري (الشكل 1 ب).
      ملاحظه: التعرف علي الجهاز التناسلي ، وتحديد حاله وموقف اينفونديبولوم و أمبول قبل ET لتسهيل الخطوات التالية.
    10. قم بإدخال ابره فوق الجافية 17 جرام في المنطقة الاربيه بين 2-3 سم من الداخل (الشكل 1B).
    11. التعرف علي مدخل اينفونديبولوم (الشكل 2 ا، 2 ب).
    12. ادخل القسطرة المحملة (الخطوة 1.3) من خلال ابره فوق الجافية في البطن (الشكل 1C).
    13. تحديد موقع القناة وادراج 1-2 سم من القسطرة فوق الجافية من خلال اينفونديبولوم في أمبول (الشكل 2a-2a). لا تقدم بعيدا جدا في القناة لمنع الضرر والنزيف.
    14. الإفراج عن الاجنه في القناة عن طريق الضغط برفق علي المكبس من حقنه إلى جانب القسطرة (الشكل 2D-2d). يجب علي كل من فقاعات الهواء الخروج من القسطرة.
    15. قم بازاله القثطار مباشره بعد الإفراج عن الاجنه.
    16. شطف القسطرة ، والشفط والإفراج عن التلاعب المتوسطة للتحقق من عدم وجود الاجنه وتاكيد نقلها بنجاح.
    17. كرر الخطوات ال1.4.11ه ل1.4.16 في الجانب الآخر من الرحم ، إذا رغبت في ذلك.
    18. أزاله الابره فوق الجافية وكاميرا المنظار.
    19. الإفراج عن CO2 من خلال trocar بالمنظار. إذا بقي الغاز الزائد في بطن الحيوانية ، فانه سيكون الم وعدم الراحة.
    20. أزاله السيارة بالمنظار من تجويف البطن. أزاله منشفه الجراحية.
    21. توقف عن التخدير.
    22. تنظيف الشق الذي ادلي به تروكار مع محلول الكلوههيكسيدين. إغلاق الشق الذي ادلي به مبزل مع ألومنيوم ميكروزيد وخلع الملابس البلاستيكية.
  5. الرعاية بعد الجراحة
    1. علاج الماشية بالمضادات الحيوية: 10 مغ/كغ من الانروفلوكساسين ، جلد ، كل 24-ساعة لمده 5 أيام.
    2. أداره المسكنات: هيدروكلوريد البوبرينورفين (0.03 ملغم/كغ) ، عضل ، كل 12 ساعة لمده 3 أيام ؛ Meloxicam (0.2 ملغ/كغ) ، جلد ، كل 24-ح لمده 3 أيام.
    3. مراقبه الماشية لمده 30 دقيقه علي الأقل بعد الجراحة (اعتمادا علي الحيوانية وجرعه التخدير المستخدمة) التاكد من انها استعاده الظروف الفسيولوجية.
    4. تحديد المستلم (علي سبيل المثال ، وشم الاذن) والمنزل الحيوانية بشكل فردي في قفص نظيف مع الحالة البيئية المناسبة.

figure-protocol-1
الشكل 1: نقل الاجنه بالمنظار بمساعده تنظير البطن (المنظر الخارجي). ا) إدخال السيارة بالمنظار (منفذ واحد). ب) إدخال الكاميرا بالمنظار وابره فوق الجافية (السهم الأسود). ج) إدخال قسطرة نقل الاجنه (السهم الأبيض) من خلال ابره فوق الجافية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-2
الشكل 2: نقل الاجنه بالمنظار بمساعده تنظير البطن (المنظر الداخلي). ا: إدخال القثطار من خلال ابره فوق الجافية في منطقه البطن. تشير النجمة إلى infundibulum. باء ، جيم ، دال: يتم إدخال القسطرة المحملة بالاجنه في منطقه أمبول عبر infundibulum. هاء ، واو: الإفراج عن الاجنه ، وأكد من قبل التصور من القناات تورم. وقد تم تكييف هذا الرقم من ماركو-خيمينيز وآخرون. 38. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

2-التزجيج الجنيني والاحترار

  1. اجراء جميع التلاعبات في درجه حرارة الغرفة (حوالي 22 درجه مئوية) للحد من سميه محلول التزجيج في درجات حرارة أكثر دفئا.
    ملاحظه: يمكن نقل الاجنه باستخدام الماصة التلقائية 0.1-2 μL في هذا البروتوكول ، ولكن الاجهزه المشابهة الأخرى لنقل الاجنه التي تسحب الحد الأدنى للحجم يمكن ان تكون مناسبه.
  2. التزجيج الاجنه في اجراء بالاضافه إلى خطوتين:
    1. ضعي الاجنه لمده دقيقتين في محلول تولد يتكون من 10% (v/v) جلايكول الاثيلين و 10% (v/v) ثنائي ميثيل سولفوكسيد مذاب في BM.
    2. نقل الاجنه (من الخطوة 2.2.1) لمده دقيقه واحده إلى محلول التزجيج الذي يتكون من 20 ٪ (v/v) جلايكول الاثيلين و 20 ٪ (v/v) ثنائي ميثيل سولفوكيد المذاب في BM.
  3. تحميل الاجنه إلى 125 μL البلاستيك الإسعاف (الذي يحتوي علي نهاية واحده مغلقه مع المكونات القطنية واحده مفتوحة المدقع). وهذه العملية مخططه في الشكل 3.
    1. زوج النهاية مغلقه من 0.125 μL الإسعاف مع الدقيق المناسب (مثل كابترول الثالث®).
    2. يستنشق BM حتى 1/3 من طول القش ، تليها فقاعه الهواء الصغيرة.
    3. يستنشق الاجنه في حجم 40 μL من محلول التزجيج ، تليها فقاعه الهواء الصغيرة الأخرى.
    4. يستنشق BM حتى الجزء السائل الأول (الخطوة 2-3-2) تصل إلى القطن.
    5. اغلق النهاية المفتوحة بقابس من القش.
  4. نفذ الخطوة 2-2-2 بينما يتم القيام بالخطوة 2.3 لضمان عدم انقضاء أكثر من دقيقه واحده ، والتي من شانها ان تكون سامه لأجنه.
  5. يغرق الإسعاف مباشره في النيتروجين السائل لتحقيق التزجيج.
  6. تخزين الإسعاف في ديوار للنيتروجين للوقت المطلوب.
  7. أذابه الاجنه في خطوه واحده.
    1. وضع الإسعاف أفقيا 10 سم من بخار النيتروجين السائل ل 20-30 s.
    2. عندما تبدا عمليه التبلور داخل الإسعاف ، تزج الإسعاف في حمام مائي عند 25 درجه مئوية ل 10-15 s.
    3. أزاله قابس الإسعاف وقطع المكونات القطنية.
    4. مع مايكرو موزع ، وطرد جميع المحتوي إسعاف في لوحه تحتوي علي 0.33 M محلول السكروز في 25 درجه مئوية في BM لمده 5 دقائق.
      ملاحظه: يجب القيام بهذه الخطوة بسرعة من أجل الحد من تعرض الاجنه لمحلول التزجيج.
    5. نقل الاجنه إلى لوحه جديده تحتوي علي حل BM لمده 5 دقائق أخرى.
    6. النظر فقط الاجنه غير التالفة (مع معطف الميوسين سليمه وبيلوسيدا زؤانا) لمواصله مع ET.
      ملاحظه: تاخذ في الاعتبار انه في الاجنه المذابة ، قد تحسن التحويلات غير المتزامنة (علي سبيل المثال ، 60-62 h في التحويلات مورلي) النتائج من خلال السماح باعاده المزامنة بين الجنين وبطانة الرحم الام.

figure-protocol-3
الشكل 3: مخطط القش المحمل بشكل صحيح. ا) يشير BM إلى وسائل الاعلام التي تتلاعب بالاجنه المستخدمة اثناء التزجيج. يجب تحميل الاجنه في محلول التزجيج. ب) المظهر المجهري لقشه المحملة بتفاصيل مكبره لوضعيه الجنين. هذا الجهاز كبير الحجم يسمح لنا للمزجج عدد كبير من الاجنه ، علي عكس الاجهزه حجم الحد الأدنى. وعلاوة علي ذلك ، فان التعامل مع هذا الجهاز هو أسهل مقارنه مع الاجهزه حجم الحد الأدنى ، في حين ان النتائج متشابهة في الأرانب41. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الحد الأدنى الغازية نقل بالمنظار من الاجنه الطازجة أو المزجج يضع الأرنب بين أفضل النماذج الحيوانية للدراسات الانجابيه. ويبين الجدول 1 نتائج الاجنه المنقولة الطازجة في مراحل تنموية مختلفه (الشكل 4). معدل البقاء علي قيد الحياة عند الولادة (النسبة المئوية من الاجنه مما ادي إلى الجرو) أثبتت فعاليه تقنيه بالمنظار الموصوفة في هذه الورقة. وقد تحققت القيم الأعلى عندما أجريت العمليات الخاصة بالاجنه في مرحله المستنقعات ، سواء كانت في وقت مبكر أو في الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

منذ أول حاله الولادة الحية موثقه من الاجنه المنقولة9، وقد أصبحت هذه التقنية وأنواع الأرانب حاسمه في الدراسات الانجابيه. والي جانب ذلك ، تتطلب الدراسات البحثية المتعلقة بالاجنه ، التي تنطوي علي التلاعب والإنتاج والتجميد وما إلى ذلك ، كخطوه أخيره ، تقييم قدره الاجنه علي توليد نسل صحي كامل الأجل. ولذلك ، فان تقنيه نقل الاجنه لا غني عنها13،28. علي مر السنتين ، تم استبدال الطرق الجراحية المستخدمة في البداية لنقل الاجنه في رحم الام تدري...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل بأموال من وزاره الاقتصاد والقدرة التنافسية في اسبانيا (AGL2017-85162-1-R) وبرنامج البحوث المتعلقة بالعموميات في فالنسيا (PrometeoII 2014/036). نسخه النص الإنكليزي المنقحة من قبل n. Macowan خدمه اللغة الانجليزيه

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ألبومين مصل الأبقار (BSA)VWR332
بوبرينورفين هيدروكلوريدألفيت إسكارت & iacute;626أن يأمر بها طبيب بيطري مرخص.
بوسيرلين أسيتاتسيجما ألدريتشB3303
صابون كلوريكسيدين ثنائي جلوكوناتAlvet Escart & iacute;0265DCCJ500B
محلول كلورهيكسيدين ثنائي جلوكوناتAlvet Escart í0265DCCA500B
CO2< / sub>Air Liquide99921CO2 N48.
حاضنة CO2فيشر15385194
ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتشW387509
Dulbecco ' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS)سيجما ألدريتشD5773بدون كلوريد الكالسيوم.
ماكينة حلاقة كهربائيةOster Golden A5078005-140-002
كاميرا المنظارالبصري إسبانيا S.AOP-714
منظار داخلي مع صمام نشرة سيليكونKarl Storz Endoscopia Ib & eacute; ريكا S.A.30114GKموديل مبزل خفيف الوزن.
EnrofloxacinAlvet Escart í9993046أن يكون بطلب من طبيب بيطري مرخص.
إبرة Epicraneal 23GAlvet Escart í514056353يمكن أيضا استخدام الإبر الأصغر.
قسطرة فوق الجافيةVygon Corporation187.10
إبرة فوق الجافيةVygon Corporation187.10
Ethylene GlycolSigma Aldrich102466-M
مرهم العينAlvet Escart & iacute ؛5273
هيدروكلوريد الكيتامينAlvet Escart & iacute ؛184أن يأمر بها طبيب بيطري مرخص.
معدات تنظير البطنKarl Storz Endoscopia Ib & eacute; ريكا S.A.26003 AAهوبكنز & ريج; منظار البطن ، منظار البطن المستقيم 0 مم ، بطول 30 سم ، قناة عمل 5 مم.
مصدر الضوءOptomic Spain S.AFibrolux 250
سائل هواء النيتروجينالسائل P1505XXX
ثاني أكسيد الكربون الميكانيكي InufflatorKarl Storz Endoscopia Ib & eacute ؛ ريكا S.A.Endoflator®
MeloxicamAlvet Escart í9993501أن يكون بطلب من طبيب بيطري مرخص.
أطباق بتري ، 35 ممSigma AldrichCLS430165-500EA
ضمادة بلاستيكية (Nobecutan) IBORmedica7140028
ماصة بلاستيكية 0.25 ملIMV - تقنيات6431
محلول يوديد بوفيدونAlvet Escart & iacute ؛02656DPYS500S
مقصROBOZRS-5880أي مقص فولاذي صغير مستقيم من الدرجة الجراحية سيعمل.
أنبوب سيليكون ل insufflatorKarl Storz Endoscopia Ib & eacute ؛ ريكا S.A.20400040
المجهر المجسمLeicaMZ16Fهناك خيارات أرخص مثل Leica MZ8 أو Nikon SMZ-10 أو SMZ-2B ، على سبيل المثال لا الحصر.
قفازات معقمةAlvet Escart & iacute ؛087GL010075
ثوب معقمAlvet Escart í12261501
قناع معقمAlvet Escart & iacute ؛058B15924B
قابس القشIMV - تقنيات6431
حقنةسكروز سيجما ألدريتشS7903
11750425علمية فيشرسعة 1 مل
، قسطرة بولية 11773313فيشر
5 مل IMV - تقنيات17722
حمام مائيRAYPABAE-4
XylazineAlvet Escart & iacute ؛525225أن يطلبها طبيب بيطري مرخص.
جامعة الأرانبPolit & egrave ؛ cnica de Val & egrave; يمكناستخدام خطوط الأمومة الأخرى ، مثل الخط الخامس أو الخط HP.
العلمية ثنائي ، حقنة العلمية

المراجع

  1. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
  2. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84 (5), 674-680 (2015).
  3. Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 411-417 (2017).
  4. Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 403-410 (2017).
  5. Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
  6. Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6 (5), 377-383 (2015).
  7. Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 128-144 (2015).
  8. Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 103-117 (2015).
  9. Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
  10. Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214(2014).
  11. Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116 (2), 235-242 (1999).
  12. Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32 (4), 291-296 (2014).
  13. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
  14. Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101 (3), e13(2014).
  15. Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81 (1), 152-169 (2014).
  16. Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92 (2), 120-123 (2015).
  17. Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587(2015).
  18. Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
  19. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
  20. Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73 (6), 768-776 (2010).
  21. Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86 (1), 144-151 (2016).
  22. Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
  23. Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48 (6), 967-973 (2013).
  24. Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4 (2), 170-175 (2002).
  25. Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144 (1), 1-10 (2012).
  26. Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45 (9), 577-579 (1998).
  27. Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (1), (2010).
  28. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147 (6), 789-801 (2014).
  29. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
  30. Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32 (4), 440-446 (2016).
  31. Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
  32. Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
  33. Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
  34. Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
  35. Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13 (3), 221-228 (1987).
  36. Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127 (1), 65-71 (2000).
  37. Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27(2013).
  38. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11 (2), e0148661(2016).
  39. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
  40. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
  41. Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79 (7), 1124-1129 (2013).
  42. Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
  43. Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
  44. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
  45. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
  46. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
  47. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
  48. Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21 (1), 49-53 (2017).
  49. Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 483-487 (1982).
  50. Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
  51. Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76 (4), 652-657 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.