مقالة منهجية

تحديد الفيرومونات لامبرى البحر باستخدام تجزئة تسترشد الحشري

8.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58059

⸱

يوليو 17, 2018

 ,  , 
1Department of Fisheries and Wildlife, Michigan State University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل وتوصيف هيكل وفاعلية حاسة الشم، والاستجابة السلوكية للمركبات فرمون المفترضة للبحر الشلق.

الملخص

تجزئة تسترشد الحشري هو نهج تكرارية وتستخدم نتائج المقايسة الفسيولوجية والسلوكية لإرشاد عزل وتحديد مجمع فرمون النشطة. أدى هذا الأسلوب توصيف ناجحة من الإشارات الكيميائية التي تعمل الفيرومونات في طائفة واسعة من الأنواع الحيوانية. الشلق البحر تعتمد على أولفاكشن للكشف عن الفيرومونات التي تتوسط الاستجابات الفسيولوجية أو السلوكية. نحن نستخدم هذه المعرفة لبيولوجيا الأسماك إلى افتراض وظائف الفيرومونات المفترضة وتوجيه عزل وتحديد المكونات النشطة فرمون. يتم استخدام اللوني لاستخراج وتركيز وفصل المركبات من الماء المكيفة. وتجري التسجيلات الكهربائية-أولفاكتوجرام (EOG) لتحديد الكسور التي الحصول على ردود حاسة الشم. ثم تستخدم فحوصات السلوكية المتاهة الخيار الثاني لتحديد إذا كان أي من الكسور معطر أيضا تنشط سلوكيا والحث على تفضيل. توفير أساليب والمطيافيه والطيفية الوزن الجزيئي والمعلومات الهيكلية للمساعدة توضيح هيكل. ويؤكد بيواكتيفيتي المركبات النقية مع EOG وفحوصات السلوكية. يجب التحقق من الاستجابة السلوكية التي لوحظت في متاهات في إعداد حقل لتأكيد وظيفتها في أجواء طبيعية تيار في نهاية المطاف. هذه المقايسة بدور مزدوج 1) توجيه عملية تجزئة و 2) تأكيد وزيادة تحديد بيواكتيفيتي المكونات المعزولة. هنا، نحن تقريرا عن نتائج الممثل لتعريف فرمون لامبرى البحر التي تمثل الأداة نهج تجزئة تسترشد الحشري. تحديد الفيرومونات لامبرى البحار أهمية خاصة نظراً لتعديل نظامها للاتصالات فرمون من بين الخيارات التي نظرت للتحكم لامبرى البحر الغازية في منطقة "البحيرات الكبرى اللورنثيه". هذا الأسلوب يمكن تكييفها مع سهولة وصف البلاغ الكيميائي في طائفة واسعة من الأنواع وتسليط الضوء على الإيكولوجيا الكيميائية المنقولة بالمياه.

المقدمة

الفيرومونات هي محددة الإشارات الكيميائية الصادرة عن الأفراد بمساعدتها في تحديد مصادر الغذاء، والكشف عن الحيوانات المفترسة والتوسط في التفاعلات الاجتماعية من كونسبيسيفيكس1. وقد تم الاتصال فرمون في الحشرات2من درس جيدا؛ بيد أن تحديد الهوية الكيميائية والبيولوجية الفيرومونات الفقاريات المائية لم تدرس على نطاق واسع. يمكن تطبيق معرفة هوية ووظيفة الفيرومونات الإفراج عن تيسير انتعاش الأنواع المهددة بالانقراض3،4 أو مكافحة الآفات الأنواع5،6. ويقتضي تطبيق هذه التقنيات بعزل وتوصيف المكونات النشطة بيولوجيا فرمون.

تعريف فرمون فرع من كيمياء المنتجات الطبيعية. التقدم في البحوث فرمون اقتصر جزئيا بسبب طبيعة الجزيئات فرمون أنفسهم. الفيرومونات غالباً ما تكون غير مستقرة، وتم إصدارها بكميات صغيرة، وتوجد سوى عدد قليل من تقنيات أخذ العينات للكشف عن المبالغ الدقيقة المتطايرة7،8 أو9من المركبات للذوبان في الماء. وتشمل النهج تحديد الفيرومونات 1) لفحص مستهدفة المركبات المعروفة، 2) جميع، ووجود 3) الموجهة بالعينة. اختبارات لفحص مستهدفة من المركبات المعروفة المتاحة تجارياً الآثار الجانبية الأيضية للعمليات الفسيولوجية التي افترض أن تعمل الفيرومونات. هذا النهج هو الحد للباحثين فقط اختبار المركبات المعروفة والمتاحة. ومع ذلك، أنها أدت في تحديد نجاح الهرمونات الجنسية في ذهبية تلك الوظيفة الفيرومونات10،،من1112. جميع هو نهج تحديد فرمون ثانية التي تميز المنتجات الأيضية جزيء صغير المحتملة داخل نظام البيولوجي13. مقارنة بين التشكيلات الجانبية الأيضية للفريقين (أينشاط مقابل مقتطف غير نشطة) يمكن تحديد تشكيل جانبي الأيضية المحتملة من الذي يتم تنقيته في المستقلب، هو توضيح الهيكل، بيواكتيفيتي هو تأكيد14. الآثار المضافة أو التآزر تركيبات معقدة من الخلائط محددة أكثر من المحتمل أن يكون اكتشاف مع جميع لأنها تعتبر نواتج الأيض معا وليس كسلسلة من الكسور13. حتى الآن، تنفيذ جميع يعتمد على توافر المراجع الاصطناعية لأن البيانات الناتجة لا تيسر الكشف عن هياكل جديدة.

تجزئة تسترشد الحشري هو نهج متكامل وتكرارية يمتد على حقلين: الكيمياء وعلم الأحياء. يستخدم هذا النهج نتائج المقايسة الفسيولوجية والسلوكية لإرشاد عزل وتحديد مجمع فرمون النشطة. استخراج النفط خام هو مجزأ حسب خاصية كيميائية (أي، حجم الجزيئية، قطبية، إلخ) واختبارها مع التسجيلات الكهربائية-أولفاكتوجرام (EOG) و/أو العينة. يتم فحص المكونات النشطة بيولوجيا بتكرار هذه الخطوات لتجزئة وأوجس و/أو المقايسة. يتم توضيح هياكل المركبات النشطة نقية بأساليب والمطيافيه والطيفية، التي توفر الوزن الجزيئي والمعلومات الهيكلية لإنتاج قالب من المجمع لتوليف. يمكن أن تسفر عن وجود تسترشد الحشري والايضات المتنوعة، ويحتمل أن تكون رواية الفيرومونات مع الهياكل العظمية الكيميائية الفريدة التي من غير المحتمل أن التنبؤ بمسارات السكروز.

هنا، يمكننا وصف تجزئة تسترشد الحشري البروتوكول المستخدم لعزل وتوصيف بيواكتيفيتي المركبات فرمون الجنس الذكور البحر لامبرى. لامبرى البحر (مارينوس Petromyzon) نموذج فقاريات مثالية لدراسة الاتصالات فرمون لهذه الأسماك تعتمد بشكل كبير على اكتشاف حاسة الشم من الإشارات الكيميائية للتوسط في تاريخهم الحياة البحرية النهرية السرء وتتألف من ثلاث مراحل متميزة: اليرقات والأحداث والبالغين. لامبرى البحر تحفر اليرقات في الترسبات مجاري المياه العذبة، وتمر تحول جذري، وتحويل الأحداث التي تهاجر إلى البحيرة أو المحيط حيث أنهم شوش السمك المضيف كبيرة. بعد فصلها من السمك المضيف، ترحيل البالغين إلى تيارات التفريخ، تسترشد الفيرومونات المهاجرة الإفراج اليرقات المقيم في تيار15،16،،من1718،19 . الذكور الناضجة تصعد إلى حديقة التفريخ، وإطلاق سراح من فرمون جنس متعدد عناصر جذب الأصحاب وتفرخ بشكل متقطع لمدة أسبوع تقريبا ثم يموت15،20. تحديد الفيرومونات لامبرى البحر مهم لتعديل نظام الاتصالات فرمون من بين الخيارات التي نظرت للتحكم الشلق البحر الغازية في "البحيرات الكبرى اللورنثيه"21.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة ولاية ميشيغان (عوف # 03/14-054-00 و 02/17-031-00).

1-جمع واستخراج لامبرى البحر مكيفة المياه

  1. مكان ناضجة جنسياً الذكور البحر الشلق (15-30 الحيوانات) في صهريج لتزويد 250 لتر مياه بحيرة هورون الرغوة المحافظة في 16-18 درجة مئوية.
  2. جمع المياه مكيفة الذكور في جميع أنحاء كل ليلة من حزيران/يونيه إلى تموز/يوليه.
    ملاحظة: الشلق البحر يموت بطبيعة الحال بعد التفريخ. إذا كان السمك يقترب من هذه النقطة في حياته، استبدلها بالذكور ناضجة طازجة.
  3. استخراج الماء مشروطة باستخراج المرحلة الصلبة.
    1. امتصاص الراتنج في الميثانول ح 4 قبل تحميله إلى عمود. تحميل الراتنج في العمود، ثم ضخ 10 لتر مياه من خلال العمود لإزالة المذيبات العضوية.
    2. تمرير المياه مكيفة من خزان الضغط الأسماك عبر نظام ضخ المياه إلى أعلى العمود. الماء يمر من خلال سرير من 2 كغ من راتنج التبادل الأيوني البوليمرية معتدل القطبية (على سبيل المثال.، راتنج HP XAD أمبيرليتي-7)، الواردة في سلسلة من أربعة أعمدة الزجاج L سعة 2.5. الحفاظ على سرعة التحميل بين 400 و 600 مل/6 دقيقة الوت تليها مباشرة ل 5 من الأسيتون والايضات مع 10 لتر ميثانول.
      تنبيه: هذه الخطوة يستخدم الميثانول والاسيتون. وكلاهما قابل للاشتعال والسامة.
      ملاحظة: يمكن تخزين المتبقي المجمعة في-80 درجة مئوية حتى مواصلة معالجتها.
  4. إعادة تنشيط العمود بعد أسبوع واحد لتخصيب اليورانيوم قبل غسله بالماء (حوالي 10 لتر).
  5. إزالة المذيبات العضوية (الخليط من الميثانول والمياه) وحصاد المقتطف بالتبخر الدنمارك ح 5 تحت ضغط انخفاض (تحت 300 [مبر]) عند 40 درجة مئوية. يركز رواسب المياه التي lyophilization مجفف التجميد ح 48 في-20 درجة مئوية حتى الجاف.

2-عزل مجمعات الكسر مع اللوني

  1. نقع هلام السليكا (230-400 مش) في المرحلة الأولية المتنقلة ل 30 دقيقة نقل الجل مع المذيب (تعليق) لعمود زجاج. فتح الصمام للعمود للسماح لمرحلة الجوال من خلال الذهاب إلى. السماح هلام السليكا يعجل وتشكيل سرير هلام السليكا.
  2. مزيج المقتطفات مع السليكا هلام (مش 70-230) دقة وتحميلها على العمود اللوني السائل على السرير هلام السليكا. الوت لهم مع تدرج من 95% شكل3 (كلوروفورم)/ميوه (الميثانول) إلى 100% ميوه، 2.5 لتر في الحجم الإجمالي. جمع الوينت في قارورة فردية (كل 10 مل).
    تنبيه: كلوروفورم المستخدمة في هذه الخطوة كاشف سامة.
  3. دليل تجميع الوينتس في الكسور 20 بتحليل طبقة رقيقة لوني (TLC).
    1. إجراء التجربة TLC على ألواح مغلفة مسبقاً السليكا جل بتطبيق النموذج على خط البداية وغمر خط البداية لصفيحة في المذيبات النامي (اختر الأقطاب بالنسبة لشكل3 إلى الميثانول من 100-0 في المائة) في زجاج مختومة دبابة.
    2. حدد نسبة وضع المذيب لجعل جميع TLC البقع مع احتفاظ بعامل (Rf) تتراوح بين 0.3-0.8.
    3. بعد المذيب النامية تصل إلى خط النهاية، تأخذ اللوحة من الخزان، وانتظر 10 دقائق المذيب تتبخر.
    4. تصور أن البقع أولاً تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في 254 نانومتر ووصمة عار ثم منهم برش عليها مع حلاً ميثانول حمضية من أنيسالديهيدي 5% (20 ميكروليتر) ببخاخ لوني وتدفئة لهم في 85 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
      ملاحظة: تشير البقع الملونة على صفيحة TLC المكون الرئيسي في الكسر.
    5. الجمع بين الوينت إلى 20 الكسور على أساس اللون الموضعي وتشابه العنصر الرئيسيو R.
  4. تركز الكسر لبقايا بالتبخر الدنمارك تحت ضغط انخفاض (300 [مبر] وفقا لخاصية المذيبات) عند 40 درجة مئوية لمدة حوالي 30 دقيقة.

3-الكهربائية-أولفاكتوجرام (EOG) تسجيلات لتحديد الكسور معطر/المركبات

  1. سحب الشعيرات الدموية البورسليكات الزجاج (القطر الخارجي: 1.5 مم؛ والقطر الداخلي: 0.86 مم؛ والطول: 100 مم) مع ميكروبيبيتي تعيين ساحبة مع مستوى سخان إلى 65.
  2. نقاط وقطع فتح في غيض شعري مع قطع زجاج الماس ذات الرؤوس وملئه المنصهر أجار 0.4% في المحلول الملحي 0.9 في المائة. وينبغي فتح في تلميح شعري حوالي 10 ميكرون في القطر.
  3. تعبئة أقطاب كهربائية الشعرية سحبت من الخطوات 3.1-3.2 وأصحاب أقطاب الحالة الصلبة ملفقة مسبقاً مع الكريات Ag/AgCl (انظر الجدول للمواد) مع 3 م بوكل استخدام ميكروبيبيتي.
    ملاحظة: إزاحة أي فقاعات الهواء في الشعرية أو صاحب القطب.
  4. إدراج أقطاب سحبت في أصحاب القطب.
  5. تحضير 100 مل من 10-5 م ارجينين في المياه تصفية الفحم من 10-2 م ارجينين حل أسهم في المياه (المخزنة على 4 درجة مئوية) في دورق حجمي. نقل 20 مل من 10-5 م ارجينين لقنينة زجاج.
  6. لمنحنى الاستجابة للتركيز، وإعداد 10 مل تخفيف إذ برك جزء من الخطوة 2.3 في قارورة من الزجاج. إعداد تخفيف الطازجة يوميا قبل التجارب والاستفادة منها خلال يوم واحد. وضع قنينة زجاج من الحلول العامل ارجينين وتخفيف تجمع الكسر في حمام مائي مغلق للسماح بدرجة الحرارة إلى حجته إلى 8 درجات مئوية.
  7. تخدير لامبرى مع إستر إيثيل حمض 3-امينوبنزويك (MS222؛ 100 مغ/لتر) وشل مع حقن العضلي من جالاميني تريثيوديدي (3 مغ/كغ وزن الجسم، في المياه المالحة 0.9 في المائة) مع المحاقن معقمة.
    ملاحظة: يتحدد عمق الكافي للتخدير لمراقبة لا جيل الحركة، عدم قدرة على الاحتفاظ موقف تستقيم، ولا شفط إلى جانبي الخزان باستخدام على القرص عن طريق الفم. لتقليل التلوث الميكروبي أي قبل وأثناء الجراحة، ارتداء قفازات معقمة ونقع أدوات التشريح في الإيثانول 70% (الخامس: الخامس) في المياه لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
  8. توجيه لامبرى أنيسثيتيزيد في الوقوف على شكل V، والانتهاء من ذلك مع منشفة ورقية مبللة لمنع جفاف.
    ملاحظة: لا تعرقل الفتحات الخيشومية.
  9. إدراج أنبوب لتعميم المياه الغازية التي تحتوي على 50 مغ/لتر MS222 في التجويف الشدقى وضبط معدل تدفق، والتأكد من أن الماء هو الخروج عبر الفتحات الخيشومية لري الخياشيم باستمرار.
  10. استخدام مشرط معقم والملقط [تحت المجهر مجسمة في تكبير X 1.25 (انظر الجدول للمواد)] إزالة مقطع2 5 ملم في الجلد على سطح الكبسولة حاسة الشم لفضح ظهارة حاسة الشم.
  11. تدفق أنابيب توصيل الرائحة مع تصفية المياه وتوصيله إلى صمام شنت على ميكرومانيبولاتور. مكان التسليم الرائحة الأنبوبة الشعرية في تجويف ظهارة حاسة الشم استخدام ميكرومانيبولاتور لتوصيل المياه التي تمت تصفيتها إلى ظهارة حاسة الشم لمنع جفاف عندما لا إدارة odorants.
  12. جبل أقطاب تسجيل وإشارة على ميكرومانيبولاتورس. انخفاض مسرى إشارة على الجلد الخارجي بالقرب من منح. استخدام مجهر مجسم (1.25 X)، انخفاض مسرى التسجيل بالكاد لمس سطح ظهارة حاسة الشم.
  13. نقل الانتفاع بأنبوب إيصال الرائحة من المياه الخلفية التي تمت تصفيتها في حل ارجينين 10-5 م.
  14. قم بتشغيل الكمبيوتر، مكبر للصوت (تعيين إلى وضع العاصمة)، والتصفية، وجهاز الالتقاط الرقمي. استخدام برنامج تشغيل صمام، البرنامج الداخلي لإدارة 4 s نبضة واحدة من الرائحة عن طريق التحقق من المربع T1، إعداد T إلى 4 s، والتحقق من مربع T2.
  15. في البرنامج الحصول على البيانات (انظر الجدول للمواد)، قم بتعيين وضع اقتناء للذبذبات عالية السرعة، انقر أيقونة اللعب، وثم انقر فوق البدء في تشغيل صمام لتحريك النبض الرائحة.
    ملاحظة: برنامج اقتناء بيانات السجلات تلقائياً السعة استجابة EOG التفاضلية ل 20 s (3 s قبل 4 s أثناء نبض الرائحة و 13 s بعد ذلك). استخدم في ميكرومانيبولاتور للمناورة ومواقف تسجيل القطب، والقطب مرجع، أو الرائحة إيصال الأنبوب زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء مع استجابة الحد أقصى لمستوى ارجينين واستجابة الحد أدنى إلى (عنصر التحكم فارغاً تصفية المياه). الأرض مكبر للصوت بتبديل رمز التبديل مكبر للصوت AC-DC إلى GND أثناء تحريك أقطاب كهربائية.
  16. بدء تسجيل عنصر التحكم فارغاً، ارجينين، ومن ثم أودورانتس إعدادها في الخطوة 3.6 من منخفض إلى تركيزات عالية مع تدفق المياه التي تمت تصفيتها 2 دقيقة بين التطبيقات.
  17. بعد تسجيل الردود على جميع أودورانتس أن تختبر، الأرض مكبر للصوت، وسحب بعناية أقطاب والرائحة توصيل الأنبوبة الشعرية. اتباع أساليب "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) تمت الموافقة عليها، في إنهاء التجربة EOG، euthanize لامبرى أنيسثيتيزيد مع جرعة زائدة من MS222 (1 غرام/لتر).
    ملاحظة: تحقق من القتل الرحيم ناجحة مشيراً إلى انعدام حركة الخياشيم ونبضات القلب لمدة 5 دقائق على الأقل متبوعاً بيثينج الدماغ.
  18. تحليل ورسم البيانات باستخدام برمجيات التحليل. تحديد عتبة الكشف عن أودورانتس22 لتحديد الكسور معطر بالحصول على ردود أكبر من عنصر التحكم فارغاً من المياه. ثم يتم اختبارها في تجمعات الكسر الحصول على ردود حاسة الشم تعتمد على تركيز مختلفة من عنصر التحكم فارغاً من المياه في تحليل السلوكي (الخطوة 4).

4-اثنين-اختيار المتاهة الحشري السلوكية لتحديد الكسور/المركبات النشطة سلوكيا

  1. تأقلم لامبرى البحر أنثى ناضجة جنسياً في قفص الإفراج في المتاهة (انظر التكميلية الرقم 1) 5 كحد أدنى للحفاظ على معدل تدفق مياه النهر في المتاهة
    ملاحظة: المتاهة بنيت من الخشب ملمع الصف البحرية وتدابير 6.5 متر في الطول و 1.2 متر في العرض مع مقسم 2.7 متر في الطول لفصل المتاهة إلى قناتين في نهاية المراحل الأولى. يتم تحويل المياه مؤقتاً إلى المتاهة. ينبغي الإبقاء على عمق المياه في 0.19 م وينبغي المحافظة على السرعة في 0.07 m/s ± 0.01.
  2. إطلاق سراح لامبرى البحر وتسجيل المبلغ التراكمي للوقت لامبرى تنفق في التجريبية وقناة التحكم كل نهر المحتوية على الماء لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: إذا فشل لامبرى البحر أدخل التجريبية والتحكم في القناة لمالا يقل عن 10 s خلال هذه الفترة 10 دقيقة، في نهاية المحاكمة، حيث أن هذا إشارة إلى التحيز القائم على الخمول أو الجانب قوية.
  3. تطبيق حافز الاختبار (أي، فرمون المفترضة في 10-12 م حله في 50 ٪ الميثانول/المياه) إلى القناة التجريبية تم تعيينها عشوائياً والمركبة (50 ٪ الميثانول/المياه) إلى عنصر التحكم باستخدام قناة تحوي مضخات بمعدلات ثابتة من 200 مل/دقيقة لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يجب استخدام تركيز عتبة الكشف عن حافز الاختبار كما هو محدد مع التسجيلات الكهربائية-أولفاكتوجرام كتركيز الأولية لاختبار سلوكية.
  4. تطبيق حافز اختبار ووسيلة 10 دقيقة إضافية وتسجيل المبلغ التراكمي للوقت لامبرى تنفق في التجريبية وقناة التحكم.
  5. مسح المتاهة مع الماء لمدة 10 دقائق قبل بدء المحاكمة القادمة. كرر الخطوات من 4.1-4.4 مع الشلق 7 على الأقل إذا كانت متوفرة كافية اختبار التحفيز.
  6. حساب مؤشر ل تفضيل22 لكل محاكمة وتقييم أهمية استخدام اختبار رتبة وقعت الرتبي.
    ملاحظة: نتائج مؤشر في رقم واحد التي يمكن أن تكون أما إيجابية أو سلبية. تشير قيمة إيجابية مؤشر من تفضيل إلى الجذب، بينما قيمة سالبة من الفهرس لتفضيل مؤشرات التنافر. إذا كان الرقم القياسي لتفضيل يختلف كثيرا عن الصفر، يعتبر الكسر النشطة.
    figure-protocol-1
    هنا،
    بج = الوقت الذي يقضيه لامبرى الاختبار في قناة التحكم قبل تطبيق الرائحة،
    به = الوقت الذي يقضيه في قناة تجريبية قبل تطبيق الرائحة،
    ج = الوقت الذي يقضيه في قناة التحكم بعد تطبيق الرائحة، و
    ه = الوقت الذي يقضيه في القناة التجريبية بعد تطبيق الرائحة.

5-الكروماتوغرافي عزل المركبات النقية من الكسور النشطة

  1. كرر الخطوات من 2.1-2.4 مع تجمعات الكسر التي تحفز استجابات حاسة الشم (الخطوة 3) والحصول على ردود السلوكية (الخطوة 4).
  2. كذلك تنقية الكسور النشطة إلى مركبات مع حجم الاستبعاد اللوني باستخدام عمود Sephadex LH-20.
    1. تحضير العينة في 0.5 مل في المرحلة الأولية المتنقلة [شكل3-ميوه (1:1) أو ميوه 100%] وتحميل في العمود المطابق في شكل3-ميوه (1:1) عمود ثم عمود ميوه (100%)، والوت لهم تؤتي المركبات.

6-هيكل توضيح مركب نقي مع الطيف الكتلي (مللي ثانية) والرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي)

  1. حل وتمييع المجمع المنقاة في المرحلة الأولية المتنقلة (عادة، الميثانول للمياه، 1:1، الخامس: الخامس) كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) أن يشكل حلاً ميكروليتر 10 تقريبا 1 ميكروغرام/مل.
    1. نقل الحل عينة إلى قارورة [هبلك] ومجموعة منهم إلى أوتوسامبلير من [هبلك]. حقن العينة (10 ميكروليتر) اليكتروسبراي التأين الطيف الكتلي (اسيمس) وتسجيل الأطياف الكتلي (هريسيمس) التأين اليكتروسبراي عالية الدقة باستخدام مطياف كتلة لوني23.
  2. التنبؤ بالصيغة الجزيئية ووفقا لقاعدة البيانات في البرنامج الشامل مطياف (انظر الجدول للمواد)24.
    1. فتح chromatogram من حقن العينة والحصول على الطيف الشامل عن طريق تحديد ذروة الكروماتوغرافي.
    2. إدخال كتلة قياس القيمة أيون (m/z) (4 الأرقام العشرية) في تكوين عنصري ضمن الوحدة النمطية أداة . تعيين المعلمة التسامح إلى جزء في المليون < 5.
    3. ضبط معلمات رمز لتناسب تكوين العنصر جزيء المقاسة. ينتج البرنامج تنبؤ بالصيغة الجزيئية استناداً إلى تحليل شامل واحد.
  3. حدد المذيبات الديوتيريوم (600 ميكروليتر، CH3OH-د4 أو [دمس]-د6) وفقا لبروتوكول25 لإذابة العينات.
    1. حل تماما العينة في المذيبات الديوتيريوم المحدد تشكل حلاً مع تركيز تتراوح تقريبا بين 0.1 إلى 10 ملغ/مل. نقل الحل العينة في أنبوب الرنين المغناطيسي لتسجيل د 1 (1ح، 13ج) والرنين المغناطيسي في 2D [واحد1ح-1ح ارتباط مطيافية (مريحة)، هيتيرونوكلير الكم الاتساق (هسقك)، هيتيرونوكلير متعددة بوند الارتباط (همبك)] الأطياف في مطياف 900 ميغاهيرتز الرنين المغناطيسي النووي26.
  4. ضع أنبوب الرنين المغناطيسي النووي مع العينة داخل التوربينات زر الزيادة والنقصان. استخدام قياس العمق لضمان ارتفاع العينة في منتصف الإطار قياس. فتح برنامج الرنين المغناطيسي النووي (انظر الجدول للمواد) وانقر على زر رفع لتغيير العينة في المغناطيس.
    ملاحظة: اضغط يد عبر الجزء العلوي من المغناطيس تشعر بالغاز القادمة من الجزء العلوي من المغناطيس. في الوقت نفسه، ينبغي أن يكون صوت صفير مسموع.
  5. بلطف ضع العينة على وسادة الهواء فوق المغناطيس والضغط على الزر رفع مرة أخرى لتنزل العينة إلى المغناطيس الرنين المغناطيسي النووي.
    ملاحظة: الاستماع لضوضاء "فوق" للإشارة إلى النموذج في الموضع الصحيح.
  6. إنشاء مجموعة بيانات جديدة وتحميل المعلمات الافتراضية وأوصى بأن الصك الرنين المغناطيسي النووي (انظر الجدول للمواد).
    1. اكتب "تأمين" لاستدعاء إجراء القفل التلقائي وحدد المذيب في الصفحة فورا.
    2. لصقل، في لوحة التحكم، قم بضبط الزر في نموذج فتح وضبط المؤشر على لوحة التحكم، وقفل المغناطيس مرة أخرى.
    3. على موجه عتمة الصفحة، قم بضبط المعلمة في لوحة التحكم على ضبط الإجراءات، والذي قد يستغرق بضع دقائق. انتظر حتى اكتمال ضبط للمضي قدما.
    4. بدء تشغيل روتين شيمينج التلقائي بكتابة "توبشيم" في موجه الأوامر. انتظر حتى اكتمال الملئ المضي قدما.
    5. نوع "رجا" تعيين تلقائي تلقي التعديلات الكسب، ثم نوع "d1" لتعيين التأخير بين البقول، ثم نوع "زج" البدء في اقتناء، والانتظار حتى انتهاء حيازة.
    6. اكتب "ef" أو "efp" معالجة البيانات ومن ثم اكتب "أية بي كيه" التدريجي التلقائي. معالجة البيانات في برامج معالجة الرنين المغناطيسي النووي.
  7. توضيح التركيب الكيميائي بتفسير لتحليل البيانات الرنين المغناطيسي النووي.
  8. عد الإشارات الكربون في طيف "الرنين المغناطيسي النووي ج" 13. حدد الصيغة الجزيئية متطابقة من النتيجة المتوقعة في الاستبانة الطيف الكتلي (HR-MS).
  9. دمج إشارات بروتون في طيف "الرنين المغناطيسي ح" 1وتعيين الاتصال الكربون-وبروتون-بناء على الإشارات في الطيف هسقك.
  10. تعيين اتصال هيكل عظمى الكربون على أساس العلاقات المتبادلة في 1ح-1"ح مريحة" والطيف همبك.
  11. مبدئياً تعيين التركيب الكيميائي استناداً إلى الأساس المنطقي الهيكل27. البحث عن هيكل مؤقت في قواعد بيانات التركيب الكيميائي. مقارنة هيكل مؤقت مع النظير في المراجع.
  12. تعيين التكوين النسبي مع النطاق الطيفي تأثير أوفرهوزر النووية (نويسي).
    ملاحظة: نظراً لخصائص الهوية متبلور مضاد المعروض في قياس الطيف الكتلي والطرق الطيفية متطابقة، تكوين بعض المركبات، لا سيما تلك مع2، 2 '--الكحول و 2'--NH المطلق قد يتحدد مع رد فعل derivatization. بعد رد فعل derivatization، تيسير الاختلافات المشار إليه على الأطياف الإحالة لا لبس فيه من تكوينات المطلقة لمعظم المركبات28.

7-EOG والحشري لتأكيد المركبات النقية معطر وسلوكيا النشطة

  1. كرر الخطوات من 3.1 إلى 3.5.
  2. لمنحنى الاستجابة للتركيز، وإعداد 10 مل تخفيف إذ من المركبات النقية من 10-6 م-10-13 م حل الأسهم فرمون 10-3 متر في 50 ٪ الميثانول والمياه المخزنة في-20 درجة مئوية استناداً إلى تحديد الوزن الجزيئي الخطوة 6.2. وضع قنينة الزجاج مع حلول العامل ارجينين والمركبات النقية في حمام مائي مغلق للسماح بدرجة الحرارة إلى حجته إلى 8 درجات مئوية.
  3. كرر الخطوات من 3.7-3.18.
  4. كرر الخطوات من 4.1-4.2.
  5. تطبيق مجمع نقية في تركيز عتبة الكشف عن EOG للقناة التجريبية تم تعيينها عشوائياً والمركبة (50 ٪ الميثانول/المياه) لقناة التحكم باستخدام مضخة تمعجية بمعدلات ثابتة من 200 مل/دقيقة لمدة 5 دقائق.
  6. كرر الخطوات من 4، 4، 4-6.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويرد في الشكل 1رسم تخطيطي يلخص الخطوات الموصوفة في البروتوكول لتجزئة تسترشد الحشري. ويشمل البروتوكول خطوات لعزل وتوصيف الهيكل وفاعلية حاسة الشم والنشاط السلوكي من الفيرومونات المفترضة البحر لامبرى 5 (الشكل 2). استخدام كتلة والمطيافيه وبيانات الرنين المغناطيسي النووي (الشكل 3 و الشكل 4)، تم توضيح هياكل بيتروميزيني أ-ب وبيتروميزوني أ-ج من المياه مكيفة مع الشلق البحر الذكور...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الأسماك تعيش في عالم الكيميائي كامل للمركبات بعد تحديد. ثبت تسترشد الحشري تجزئة أساسية لتحديد وتوصيف النشطة بيولوجيا الجزيئات التي تتوسط العديد من التفاعلات الكيميائية، مثل تلك التي لوحظت في سمك السلمون masu31والفيلة الآسيوية32الشلق البحر33، ،من 3435. تجزئة تسترشد الحشري هو نهج فعال لتتبع بدقة وتحديد استخراج المركبات النشطة بيولوجيا من البداية المجمع النشط المنقي. باستخدام هذا النه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونحن نشكر الولايات المتحدة الجيولوجية المسح هاموند خليج البيولوجية المحطة لاستخدام مرافقها البحثية وموظفي الولايات المتحدة للأسماك والأحياء البرية ومصائد الأسماك والمحيطات في كندا لتوفير الشلق البحر. وأيد هذا البحث المنح المقدمة من "لجنة مصايد الأسماك في البحيرات العظمى" للي ويي، ولي كه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الشعيرات الدموية البورسليكات القياسية الممتازة مع خيوط   ؛من Warner InstrumentsG150F-4(OD 1.5 مم ، المعرف 0.86 مم)
أداة سحب الماصةNarishigePC-10تسحب أقطاب كهربائية ل EOGs
قاطع زجاجي ذو رأسمقطوع عامللأقطاب الكهربائية
للشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكاتWorld Precision Instruments1B150-4ل EOG
حامل القطب الكهربائي للتسجيل الجسم المستقيم من السلسلة E مع بيليه Ag / AgCl للزجاج الشعري OD 1.5 ممWarner Instrumentsقطب تسجيلESP-M15N
حامل قطب كهربائي مرجعي E Series مع مقبض مع   ؛ Ag / AgCl بيليه  للزجاج الشعري OD 1.5 ممWarner InstrumentsE45P-F15NHحامل القطب المرجعي
1 مم دبوسWarner InstrumentsWC1-10لجسر حوامل القطب المرجعي والتسجيل
مم دبوسWarner InstrumentsWC2-5لجسر حوامل القطب المرجعي وتسجيل
AgarSigmaA1296أجار المصهور لملء الأقطاب
الكهربائيةكلوريد البوتاسيوم (KCl)SigmaP93333M KCl لملء الأقطاب الكهربائية وحاملي الأقطاب
Micropipette microfilWorld Precision InstrumentsMF28G-5لملء الأقطاب الكهربائية وحاملي الأقطاب
الكهربائية L-ArginineSigmaA5006رائحة التحكم الإيجابي ل EOG
MethanolSigma34860
حمام مائيمخصصN / Aيحمل روائح ل EOG
3-حمض أمينوبنزويك إيثيل إستر (MS222)Syndel USATricaine1GEOG مخدر
غالامين ثلاثي الإيثيوديدسيجماG8134-5GEOG مشلول
1 مل حقنةBD Biosciences301025
إبرة تحت الجلد الشللية 26G 5/8BD Biosciences305115لإدارة
مشبك الأسطوانةدقة العالم الأدوات14043-20ضبط معدل تدفق المخدر في فم لامبري
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)جي تي بيكر3624-05لإعداد حامل بلاستيكي على شكل حرف V بنسبة 0.9٪ من المحلول الملحي
كمرحلة عينة مصنوعحسب الطلبN / Aيحمل لامبري أثناء حوض بلاستيكي EOG
مصنوع حسب الطلبN / Aيحمل حاملا بلاستيكيا على شكل حرف V أثناء
شفرات مشرط EOG - # 11أدوات العلومالدقيقة 10011-00لمقبض مشرط تشريح EOG
- # 3أدوات العلومالدقيقة 10003-12لتشريح EOG
ملقط مستقيم فائق الدقةأدوات العلومالدقيقة 11252-00لتشريح EOG ، ملقط Dumont #5SF
ملقط منحني فائق النعومةأدوات العلومالدقيقة 11370-42لتشريح EOG ، مقص
Moria MC40B مستقيمأدوات العلوم الدقيقة15003-08لتشريح EOG
مجهر مجسمZeissDiscovery V8لتشريح EOG
ضوء الإضاءةZeissCL 1500 ECOلتشريح EOG
أنابيب بلاستيكيةعامةلتوصيل إعادة تدوير إعداد EOG وحمامات المياه
أنابيب توصيل الرائحةحسب الطلبN / A
In خط مرشح ومجموعة حشيةLeeTCFA1201035A
MicromanipulatorsNarishigeMM-3لوضع الأقطاب الكهربائية وأنبوب الشعيرات الدموية لتوصيل الرائحة
أجهزة القابضة المغناطيسيةKanetecMB-K
سائق صمامArduinoمخصص للتحكمفي فتح الصمام لتحفيز الرائحة
صمام كهرومغناطيسيلي صمامLFAA1201618Hلتحفيز الرائحة
مضخم NeuroLog AC / DCDigitimer Ltd.NL106لزيادة سعة مضخم الصوت المسبق للإشارة الإليكترية
NeuroLog DC مع headstageDigitimer Ltd.NL102Gلزيادة سعة الإشارة الإليكترية
مرشح التمرير المنخفض 60 هرتزDigitimer Ltd.NL125
DigitizerMolecular Devices LLCAxon Digidata 1440A
كمبيوتر Dell (OptiPlex 745) الذي يقوم بتشغيل برنامج الحصول على بيانات Axoscopeالأجهزة الجزيئية LLCAxoScope الإصدار 10.4
قفص فارادايمخصص غيرللحماية من الضوضاء الكهرومغناطيسية
متاهة من خيارينالطلبغير متوفرالخشب الرقائقي البحري المقاوم للماء مغطى ببطانة بلاستيكية
مضخة القمامةتملأ هونداWT30XK4Aالمتاهة بالماء من مضخة التمعج القريبة للنهر
مع أنابيبكول بارمرماسترفليكس 07557-00إلى إدارة الروائح الكريهة في متاهة
مولد العاكسهونداEU1000iيقوي مضخة البلستالتية
إطلاق قفصمخصص غيرمتاحتستخدم للتأقلم مع لامبري في المتاهة
شبكةGenericتستخدم لاحتواء أبعاد المتاهة وتقليل اضطراب المياه باستخدام بكرات شبكية
دلاء (5 جالون)عاملخلط الروائح
مقياس التدفقMarsh-McBirneyFlo-Mate 2000لقياس التفريغ
XAD 7 HP راتنجداو الكيميائية37380-43-1لاستخراج المياه المكيفة 
الميثانولسيجما34860لاستخراج المياه المكيفة   ؛
حمام مائيياماتوBM 200لاستخراج المياه المكيفة   ؛
مجفف التجميدLabconcoCentriVap المكثفلاستخراج
كلوروفورمالمكيف SigmaCX1050لعزل حمامات الكسر
هلام السيليكا 70-230 شبكةSigma112926-00-8لعزل حمامات الكسر
هلام السيليكا 230-400 شبكةSigma112926-00-8لعزل حمامات الكسر
السيليكا المطلية مسبقا هلام TLC لوحاتSigma99571لعزل تجمعات الكسور
أنيسالديهايدSigmaA88107لعزل حمامات الكسر
Sephadex LH-20GE Healthcare17-0090-01لعزل تجمعات الكسور
Amberlite XAD 7 HP راتنجSigmaXAD7HPلاستخراج المياه المكيفة   ؛
4 ، أعمدة زجاجية بسعة 2.5 لترشركة Ace Glass Inc.5820لاستخراج المياه المكيفة   ؛
الأسيتونسيجما650501لاستخراج المياه المكيفة   ؛
TQ-S TOF LC مطياف الكتلة (أو ما يعادله)شركة ووترزN / Aلتوضيح الهيكل
مضخة HPLC الثنائيةشركة Waters Co.1525لعزل تجمعات / مركبات
الكسور مطياف الرنين المغناطيسي النووي Agilent ، 900 ميجا هرتز (أو ما يعادلها)AgilentN / Aلتوضيح الهيكل
نظام تجفيف RotovapBuchiRIIلاستخراج المياه المكيفة   ؛
مصباح الأشعة فوق البنفسجية (254 نانومتر) شركةسبكترونيكسENF-240Cلكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة   ؛
القطب الكهربائي للتسجيل والمرجع ماسي طرف حامل 2 الكهربائية لإدارة المشلول شركة الشركة متاح حسب الماء

المراجع

  1. Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
  2. El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
  3. Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
  4. Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
  5. Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
  6. Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
  7. Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
  8. Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , Springer Science & Business Media. (2013).
  9. Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
  10. Stacey, N., Sorensen, P. Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , Elsevier Inc. (2011).
  11. Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
  12. Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
  13. Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
  14. Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
  15. Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
  16. Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
  17. Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
  18. Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
  19. Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour? Animal Behaviour. 78, (2009).
  20. Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
  21. Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).
  22. Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
  23. Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
  24. Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
  25. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692(2007).
  26. Kaiser, B., Wright, A. Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , BRUKER. Madison, WI. (2008).
  27. Breitmaier, E., Sinnema, A. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).
  28. Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
  29. Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
  30. Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , In press (2018).
  31. Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
  32. Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
  33. Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
  34. Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
  35. Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
  36. De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
  37. De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
  38. Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
  39. Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Electro Olfactogram

مقالات ذات صلة