Method Article

الفائق، والمحتوى السامي، المستندة إلى سائل C. ايليجانس باثوسيستيم

DOI:

10.3791/58068

⸱

July 1st, 2018

 ,  , 
1Department of Biosciences, Rice University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يمكننا وصف بروتوكول هو المضيف قابلة للتكيف، وكله، أداة فحص عالية المحتوى التي يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات بين المضيف الممرض ويمكن استخدامها لاكتشاف المخدرات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عدد الأدوية الجديدة التي حددت بالتقليدية، في المختبر شاشات تضاءل، الحد من نجاح هذا النهج في البحث عن أسلحة جديدة لمكافحة مقاومة الأدوية المتعددة. وادي هذا إلى الاستنتاج بأن الباحثين لا تحتاج فقط إلى العثور على أدوية جديدة، ولكن أيضا بحاجة إلى تطوير طرق جديدة للعثور عليهم. بين المرشح الأكثر تبشيرا بالنجاح أساليب مسببة للجامعة، في فيفو فحوصات هذا الاستخدام الفائق، والمظهرية قراءات ويستضيف أن تتراوح بين ايليجانس كاينورهابديتيس دانيو rerio. هذه الأجهزة المضيفة لها العديد من المزايا القوية، بما في ذلك تخفيضات هائلة في عدد الزيارات إيجابية كاذبة، كما يتم عادة إسقاط مركبات سامة للمضيف و/أو بيونافيلابل في الشاشة الأولى، قبل متابعة مكلفة حتى.

هنا نعرض كيف استخدمت لدينا المقايسة لاستجواب تباين المضيف في الموثقة توثيقاً جيدا C. ايليجانس–الزائفة الزّنجاريّة قتل السائل باثوسيستيم. كما نبدي ملحقات عدة لهذا الأسلوب جيدا عملت بها. على سبيل المثال، نحن قادرون على الاضطلاع بشاشات الجينية الفائق باستخدام [رني] في بئر 24 أو 96 لوحة الأشكال لعوامل المضيف الاستعلام في هذا التفاعل المضيف الممرض. باستخدام هذا التحليل، يمكن أن تكتمل شاشات الجينوم كله في بضعة أشهر فقط، التي يمكن تبسيط مهمة تحديد أهداف المخدرات، يحتمل أن تكون دون الحاجة إلى اتباع نهج التنقية البيوكيميائية شاقة بشكل كبير.

نحن أيضا تقرير هنا تلاف أسلوب لدينا بدائل بكتيريا إيجابية faecalis البرازية الممرض الغرام P. الزّنجاريّة. كثير كما الحال بالنسبة P. الزّنجاريّة، قتل faecalis هاء- تعتمد على الوقت. على عكس السابق C. ايليجانس– فحوصاتفايكاليس هاء ، ولدينا المقايسة faecalis هاء- لا يتطلب برينفيكتيون، تحسين صورتها السلامة وتقليل فرص تلوث معدات مناولة السائل. المقايسة قوية جداً، عرض ~ 95% معدلات الوفاة 96 ساعة بعد الإصابة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد وتطوير المضادات الحيوية واسعة الطيف، وفعالة، الآن تقريبا قبل قرن من الزمان، أدت إلى لحظة فاصلة في مجال الصحة العامة حيث كان هناك اعتقاد على نطاق واسع أن المعدية المرض سيكون آفة من الماضي. في بضعة عقود قصيرة، بدأ هذا التفاؤل إلى الزوال، الممرض بعد الممرض وضعت آليات المقاومة التي تحد من هذه العلاجات المعجزة مرة واحدة. لبعض الوقت، ويبدو أن سباق التسلح بين الجهود الرامية إلى اكتشاف المخدرات ومسببات الأمراض متوازنا. ومع ذلك، قد توجت إساءة استخدام مضادات الميكروبات مؤخرا في ظهور سلالات مقاومة للعقاقير عموم الكلبسيله الرئويةو راكدة بوماني، السراتية marcescensو, P. الزّنجاريّة1 2،،من34.

من P. الزّنجاريّة انتهازية، غرام السلبية، متعدد المضيف ممرض أن تهديدا شديدا للمرضى الذين يعانون من حروق شديدة، أولئك الذين هم المناعة أو التليف الكيسي. فإنه يتم تعريف أيضا بصورة متزايدة كعامل المسبّب للمرض في العداوي المستشفوية شديدة، لا سيما بسبب حيازته الجارية لمقاومة مضادات الميكروبات. للبدء في التصدي لهذا التهديد، وقد استخدمنا موثقة توثيقاً جيدا C. ايليجانس-P. الزّنجاريّة عدوى النظام5. وقد الاستدانة لدينا مختبر هذا النظام لتطوير منصة فرز المستندة إلى السائل، والفائق، وعالية المحتوى لتحديد المركبات الرواية التي تحد من قدرة مسببات المرض قتل المضيف6. الفضول، تبدو هذه المركبات تنتمي إلى مالا يقل عن ثلاث فئات عامة، بما في ذلك مضادات الميكروبات7 وضراوة مثبطات8. وردت أخرى فحوصات اكتشاف المخدرات عالية المحتوى في C. ايليجانس لبكتريا توبيركولوسوم، والمتدثرة الحثريه، واليرسينيا بيستيس، الليستريه المستوحدة، فرانسيسيلا تولارنسيس، المكوّرات العنقودية الذهبية، المبيضات البيض، و فايكاليس البرازية، بين أمور أخرى9،10،11،،من1213،14،،من1516. هذه الأنواع من فحوصات لها العديد من المزايا المعترف بها جيدا، مثل الحد من يضرب الإيجابية الكاذبة التي قد تكون سامة للبلد المضيف والممرض، احتمال زيادة التوافر الحيوي بالمقارنة مع شاشة كيميائية، والقدرة على تحديد عدد الزيارات خارج مجرد الحد من نمو الميكروبات، مثل مكافحة فيرولينتس أو جزيئات محفزة محصنة ضد المركبات إلا إمالة توازن التفاعل المضيف الممرض صالح السابقة. بالإضافة إلى ذلك، أن المركبات التي اكتشفت في هذه الشاشات غالباً ما تكون فعالة في الثدييات المضيفين.

تجدر الإشارة إلى أن مالا يقل عن اثنين آخرين فحوصات17،18 متاحة للاضطلاع بشاشات الفائق في C. ايليجانس في السائل. ومع ذلك، كل من هذه الاختبارات هو تعديل يسمح الإنزيم المعوية الاستعمار تنميط، المعروف بالقتل البطيء، يمكن أداؤها في السائل، زيادة الإنتاجية، والسماح لمركبات فحص أكثر سهولة. وقد أظهرت توصيف دقيق قاطع أن آليات الفوعة الجرثومية المختلفة بين هذه الاختبارات ولدينا الشاشة المستندة إلى السائل7. إذ لوحظت كلا النوعين من ضراوة في نظم الثدييات، من المهم النظر المحدد ضراوة الذي هو الأكثر ملاءمة لمصالح المجرب قبل اختيار المقايسة.

هنا نظهر إصدار محسن من السائل على أساس مقايسة C. ايليجانس P. الزّنجاريّة . ونحن أيضا تقرير تكييف أسلوب التحليل القائم على سائل لدينا لاستيعاب الممرضات البكتيرية إيجابية البرازية faecalis. مثل P. الزّنجاريّة، يتم تعريف faecalis هاء- يتزايد كتهديد خطير المستشفيات مع تسلح متزايد لمقاومة مضادات الميكروبات مسارات1. على الرغم من وجود أسلوب سابقة للفرز الفائق من faecalis هاء- 14، فإنه يتطلب بريينفيكشن مع مسببات المرض، مما يزيد من تعقيد الإجراءات ويزيد من احتمال تلويث المعدات مثل فلووسورت COPAS. لدينا بروتوكول يلغي الحاجة لقبل الإصابة، تحسين السلامة الشخصية. أخيرا، نحن التقرير وسيلة بها أي من هذه الاختبارات يمكن دمجها مع تغذية [رني]، مما يتيح للمستخدم البحث عن المضيف من العوامل التي تلعب دوراً في إنشاء، أو مقاومة للعدوى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنبيه: P. الزّنجاريّة و faecalis هاء- 2 مستوى السلامة البيولوجية المسببة للأمراض، ويجب اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة لمنع الإصابة بعرضي والتقليل من تلوث الأسطح. يجب تعقيم جميع وسائل الإعلام والمواد التي تتلامس مع مسببات الأمراض أو التخلص منها. وتتوفر المزيد من المبادئ التوجيهية من المنشور منها السلامة الأحيائية في الأحياء المجهرية والمختبرات الطبية الحيوية (بمبل)، الطبعة الخامسة.

1-إعداد وصيانة P. الزّنجاريّة

  1. الانتصارات P. الزّنجاريّة من أسهم مجمدة على صفيحة أجار رطل (مرق ليسوجيني). احتضان ح 16 إلى 24 في 37 درجة مئوية
    ملاحظة: إجراء تجارب P. الزّنجاريّة داخل سلامة بيولوجية BSL-2 مجلس الوزراء لضمان العقم. استخدام احتياطات السلامة المناسبة لتقليل فرصة الإصابة المسببة للأمراض أو التلوث.
  2. نقل هذه اللوحة إلى 4 درجات مئوية. يجوز الإبقاء على 4 درجة مئوية هذه اللوحة ويستخدم لتطعيم الثقافات لمدة تصل إلى أسبوع واحد. بعد أسبوع واحد، إزالة التلوث وتجاهل اللوحة وجعل لوحة الانتصارات رطل جديدة.
    ملاحظة: إنقاص الفوعة P. الزّنجاريّة بعد تخزين طويلة.
  3. يومين قبل إعداد لوحات المقايسة، وتطعيم 3-5 مل مرق LB العقيمة مع مستعمرة واحدة من P. الزّنجاريّة من اللوحة في 1.1. احتضان في 37 درجة مئوية ح 12 إلى 16.
    ملاحظة: لا احتضان أطول من ح 16. في الثقافات السائلة الغنية، يبدأ PA14 P. الزّنجاريّة ليسي.
  4. إعداد لوحات العقيمة 10 سم مع وسائل الإعلام "قتل بطيء" (الجيل الثالث 3g كلوريد الصوديوم، ببتون 3.5 g, 1 مم كاكل2, 1 مم MgSO4، 25 مل من المخزن المؤقت للفوسفات (المبلغ للتر الواحد: 132 مل ك2هبو4 (م 1) ومل 868 من خ2ص4 (1 م)) واجار 18 جرام/لتر).
    ملاحظة: إعداد لوحات قبل الموعد المحدد. يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 3 أسابيع في وعاء محكم في 4 درجات مئوية.
  5. البذور كل 10 سم "قتل بطيء" لوحة (لوحة كورونا) مع ميكروليتر 350 من P. الزّنجاريّة من جديد بين عشية وضحاها الثقافة رطل. استخدام الناشرة جرثومي عقيمة، تنتشر البكتيريا بالتساوي عبر السطح من وسائل الإعلام والسماح لتجف في سلامة بيولوجية BSL-2 مجلس الوزراء.
  6. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية ح 24.

2-إعداد البكتيريا [رني]

  1. خط خارجاً أو دبوس-نقل المطلوب سلالات من البكتيريا التي تحتوي على [رني] على لوحات أجار رطل المحتوية على المضادات الحيوية المناسبة (كاربينيسيلين في 100 ميكروغرام/مل) والتتراسيكلين في 15 ميكروغرام/مل للمكتبات أهرينجير وفيدال من الأوراق المالية مجمدة.
    ملاحظة: عند العمل مع nonpathogenic البكتيريا، استخدم أما BSL-2 أ/ب السلامة البيولوجية مجلس الوزراء أو تدفق الصفحي BSL-1 هود لضمان عقم الثقافات وتقليل فرصة التلوث عبر مكتبة.
  2. احتضان لوحات ل 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    1. وبعد أسبوعين، تجاهل اللوحات واستبدالها بلوحات تقدم طازجة.
  4. اختبار متعددة [رني] سلالات بالتوازي بتطعيم مستعمرة واحدة من كل استنساخ منفردة في 4 مل من استكمال كاربينيسيلين رطل في واحدة جيدا في صحن عميق 24-بئر أو في أنبوب اختبار عقيمة.
    ملاحظة: التتراسيكلين قد أبلغ إلى تقليل الكفاءة [رني]. لا تستخدم في هذه الوسائط.
  5. وضع لوحات جيدا 24-بئر عميقة في حاضنة تهز الأمثل للوحات مولتيويل واحتضان في 37 درجة مئوية ح 16 بينما تهز 950 لفة في الدقيقة.
    ملاحظة: من الصعب الحصول على النمو البكتيري موحدة في لوحات مولتيويل حاضنة تهز تقليدية باستخدام. حاضنة تهز يحتاج ليتمكن من هزة في الحد أدنى من 750 دورة في الدقيقة في ترتيب للثقافات أن تنمو بشكل صحيح. نظراً لغياب شاكر المتخصصة، من الممكن أن ينمو كل ثقافة في أنبوب فردية. يمكن نقل الثقافات في لوحة 24-جيدا للطرد المركزي بعد ذلك، إذا رغبت في ذلك.
  6. جمع البكتيريا التي سينتريفوجينج لمدة 5 دقائق في 2,000 س ز.
  7. صب المادة طافية بعكس اللوحة وتهتز بقوة. ريسوسبيند البكتيريا [رني] في 100 ميليلتر من القاعدية S (ز 5.85 كلوريد الصوديوم، ز 1 ك2مكتب البراءات الهنغاري4، ز 6 خ2بو4 حله في 1 لتر الماء عالي النقاوة وتعقيمها قبل اﻷوتوكﻻف).
  8. "الماصة؛" حراكه البكتيريا إلى عدد مناسب من الآبار لصفيحة NGM مولتيويل (ديدان أسطوانية وسائط النمو، الجيل الثالث 3g كلوريد الصوديوم، ببتون 2.5 g, 1 مم كاكل2, 1 مم MgSO4، 25 مل من المخزن المؤقت للفوسفات (المبلغ للتر الواحد: 132 مل ك2هبو4 (1 م) ومل 868 من خ2ص4 (1 م))، واجار ز 18 لتر من الماء) تستكمل مع إيبتج (تركيز النهائي 1 مم) وكاربينيسيلين (100 ميكروغرام/مل تركيز النهائي).
    1. استخدام 3.5 مل NGM وسائل الإعلام كل من لوحة 6، حسنا، 1 مل كل من صفيحة 24-جيدا جيدا، أو 150 ميليلتر كل من لوحة 96-جيدا جيدا جيدا.
    2. استخدام 100 ميكروليتر/جيدا للبكتيريا للوحة 6-جيدا؛ 50 ميكروليتر/جيدا ل 24-جيدا؛ أو 20 ميكروليتر/جيدا للوحة 96-جيدا. السماح لتجف.
      ملاحظة: التجفيف يتم عادة في غطاء تدفق عقيمة لتعزيز تجفيف سريع وموحد. تجفيف موحد مهم جداً. تجنب الإفراط في التجفيف، الشقوق في أجار الترويج تختبئ من الديدان. وهذا يؤدي إلى دودة الخسائر وانسداد المحتملة لنظم معالجة السائل.
  9. استخدام لوحات مستعدة فورا أو تخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين لاستخدامها في وقت لاحق.
    ملاحظة: لمنع الجفاف، لوحات يمكن مختومة مع الفيلم البلاستيك البارافين أو وضعها في حاويات مختومة محكم مع مناشف ورقية رطبة.

3-صيانة وإعداد C. ايليجانس

ملاحظة: قبل الشروع في تجارب، توليد عدد سكانها متزامنة من الديدان hermaphroditic جرابيد، والكبار كما يلي.

  1. أغسل جرابيد البالغين (أي، مع أجنة متعددة مرئية داخل الغدد التناسلية) من 4-6 لوحات NGM 10 سم في أنبوب مخروطي 15 مل بإضافة 4 مل من S القاعدية للوحة ويحوم بلطف وثم صب في أنبوب مخروطي 15 مل.
  2. بيليه الديدان عن طريق استخدام الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 30 ثانية.
  3. نضح المادة طافية، رعاية لا لعرقلة بيليه دودة.
  4. إضافة 3.5 مل من محلول التبييض دودة (التركيز النهائي 0.5M هيدروكسيد الصوديوم، محلول هيبوكلوريت الصوديوم 1%، في الماء المعقم) دودة بيليه، ومزيج من عكس لمدة 1 دقيقة.
  5. باختصار من دوامة وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 30 ثانية.
  6. نضح أو صب المادة طافية، مع الحرص على عدم تعكير بيليه دودة.
  7. إضافة 3.5 مل من محلول التبييض دودة جديدة إلى بيليه دودة.
  8. قوة مزيج الديدان في حل التبييض. بشكل دوري (تقريبا كل عشر ثوان) تفقد بصريا الديدان تحت مجهر تشريح. لمشاهدة البشرة دودة لكسر، الإفراج عن البيض. مرة واحدة وكانت معظم الديدان الكبار المذابة (~ 95 ٪)، يؤدي إلى تمييع التبييض إلى 15 مل مع S القاعدية لوقف عملية الهضم.
    ملاحظة: قشرة البيض أكثر مقاومة للتبييض من أنسجة البالغين، إلا أنها يمكن أن تحل خلال التعرض لفترة طويلة. ولتجنب تفكك البيض، لا تعرض البيض دودة حل التبييض لمدة أطول من 7 دقائق. في حالة تلف قشرة البيض مفرطة، سوف يموت الأجنة.
  9. بيليه الأجنة في 1,000 س ز لمدة 30 ثانية ونضح أو صب المادة طافية دون إزالة بيليه للأجنة.
  10. ريسوسبيند الديدان في S القاعدية لوحدة تخزين نهائي من 15 مل تمييع الحل التبييض المتبقية.
  11. كرر الخطوات الغسيل (3.9-3.10) ثلاث مرات أكثر لما مجموعة 4 يغسل على التوالي.
  12. وبعد الغسيل الرابعة، نضح المادة طافية وتضيف ما يصل إلى 5 أو 6 مل من S العقيمة "القاعدية" في أنبوب مخروطي 15 مل. والهدف من ذلك ريسوسبيند الأجنة إلى تركيز ديدان ~ 50 كل ميليلتر.
    ملاحظة: مقدار القاعدية S يعتمد على حجم بيليه البيض؛ أكبر بيليه، القاعدية S أكثر من الضروري.
  13. احتضان الأنبوبة المخروطية بين عشية وضحاها في دوار أعلى الجدول في درجة حرارة الغرفة أو 48 ساعة في 15 درجة مئوية. وسوف تفقس اليرقات، ولكن سيتم القبض على التنمية اليرقات في مرحلة L1 (L1 ديبوس) بسبب الحرمان المغذيات.
  14. فحص الأجنة تحت مجهر تشريح للتحقق من أن معظمهم قد دبرت واعتقل في المرحلة L1 للتنمية.
  15. تحديد عدد دودة بأخذ 20 ميليلتر من دودة الإعدادية واذابته مع 80 ميليلتر من S القاعدية. "الماصة؛" 10 ميليلتر من محلول دودة المخفف مباشرة على لوحة NGM فارغة. كرر 2 مرات أكثر.
    1. عد اليرقات في كل بقعة وتحديد متوسط عدد. قسمة هذا المتوسط 2 للحصول على تعداد تقريبي للديدان كل ميليلتر في الإعدادية دودة. ثم يمكن استخدام محضرات دودة لوحات النشر أو للتجارب.
      ملاحظة: بعد 4-5 أيام، سيبدأ اليرقات المتعطشة للموت؛ تجاهل prep عند هذه النقطة.
  16. لنشر السلالة، تتركز ماصة رصدت عددا مناسباً من الديدان L1 (5,000-6,000) على لوحات NGM 10 سم 3-4 مع OP50 كولاي – "سوبيرفود" (OP50كولاي رصدت 25 X تركيز (أي 1 لتر من OP50 بين عشية وضحاها ثقافة نمت في رطل غلة 40 مل من عشب البحر X OP50 25)؛ رصدت 2 مل من هذا التعليق البكتيرية تتركز على كل لوح NGM 10 سم).
  17. لإعداد لوحات لإجراء تجارب عليها، قم بأحد الإجراءات التالية (بالنسبة للإعداد استخدام 3.17.1 "بروتوكول الأساسية"، "[رني] شاشة إعداد" استخدام الخطوات 3.17.2-3.17.4 حسب الاقتضاء):
    1. ماصة ~ 5,000 الديدان/10 سم لوحة المصنف مع عشب البحر [رني] أو OP50.
    2. ماصة ~ المصنف 500 الديدان/بئر في لوحة 6-جيدا مع [رني].
    3. المصنف ماصة ~ 300 الديدان/بئر في صفيحة 24-جيدا مع [رني].
    4. المصنف ماصة ~ 100 الديدان/بئر في صفيحة 96-جيدا مع [رني].
      ملاحظة: للحصول على إرشادات حول كيف كان المصنف [رني] يرجى الرجوع إلى الخطوات 2.7 2.9 في إعداد البكتيريا [رني].
  18. إذا كان يتم استخدام سلالة خصبة من الديدان، احتضان الديدان عند 25 درجة مئوية ل ~ 44-48 h. استخدام هذه الديدان، في أسرع وقت ممكن بعد أن السكان قد بلغ السن المناسبة. وهذا يقلل من أثر بيض الفقس داخل الديدان خلال المقايسة.
  19. إذا كان يتم استخدام السلالة هو درجة الحرارة العقيمة (مثلاً، fer-15(b26)؛ fem-1(hc17) أو glp-4(bn2))، احتضان الديدان عند 15 درجة مئوية ح ~ 16 وثم نقل إلى 25 درجة مئوية ح 44 استكمال تطوير ومنع امبريوجينيسيس.

4-سائل قتل إعداد المقايسة (بروتوكول الأساسية)

ملاحظة: هذا بروتوكول لسلالة بكتيرية واحدة ومصدر واحد من الديدان.

  1. باستخدام مكشطة خلية، إزالة P. الزّنجاريّة من صفيحة كورونا وريسوسبيند في ~ 5 مل من S القاعدية. مقياس إذا لزم الأمر. قياس الكثافة البصرية تعليق البكتيرية باستخدام جهاز المطياف الضوئي (OD600)
  2. إعداد مل 24 من الأسهم المخفف من P. الزّنجاريّة في القاعدية S في التطوير التنظيمي600 ≈ 0.09 (3 X تركيز النهائي). انظر 4.6.2 للمحتوى النهائي للبئر الواحد، والحجم لتمييع البكتيرية تبعاً لذلك.
  3. إضافة مل 21 من وسائل الإعلام السائلة "القتل البطيء" (غ 3 من كلوريد الصوديوم، غ 3.5 ببتون/لتر تستكمل مع كاكل2 و مجسو4 لتركيز نهائي من 1 مم). استخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 45 ميليلتر من البكتيريا ووسائط الإعلام لكل بئر من صفيحة 384-جيدا.
  4. أغسل الديدان من مصدرها (أيخطوة 3.17.1) في أنبوب 50 مل مخروطية والسماح للديدان تسوية تحت قوة الجاذبية. نضح المادة طافية إلى 5 مل. ريسوسبيند في ما مجموعة 50 مل S القاعدية.
  5. كرر الخطوة 4، 4 مرتين.
  6. استخدام أرز دودة، فرز حوالي 22 الديدان في كل من لوحة 384-جيدا جيدا.
    ملاحظة: الإعداد يسقط كل دودة في ~1.1 ميليلتر من السائل. الديدان 22 ستصل إلى 25 ميليلتر، يصل حجم إجمالي المقايسة إلى 70 ميليلتر/جيدا.
    1. التشكيل النهائي لكل بئر ويتألف من 70 ميليلتر. 45 ميليلتر من هذا الحجم يتم إضافته كالمتوسطة البكتيرية (OD 0.03600 البكتيريا في 24 ميليلتر S ميليلتر القاعدية، و 21 كورونا تستكمل مع كاكل2 ومجسو4). يتم إضافة ميليلتر 25 أخرى مع الديدان 22.
    2. في حالة استخدام فارز غير متوفر هنا (انظر الجدول للمواد)، يمكن أن تضعف الديدان إلى تركيز نهائي للدودة 1/ميليلتر في S القاعدية وبيبيتيد 25 ميليلتر/البئر باستخدام ماصة الأقنية. ومع ذلك، قد يحمل نتائج زيادة التقلبات. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن استخدام موزع سائلة تحوي، كما وصفها ليونغ والزملاء19.
  7. بعد أن تم فرز الديدان في لوحة 384، حسنا، ختم اللوحة مع فيلم غاز نفاذية واحتضان لوحات عند 25 درجة مئوية ح 24-48.
  8. وفي الوقت المطلوب، استخدم غسالة ميكروسكوبية لغسل لوحة 384-جيدا مع القاعدية S ما مجموعة 5 مرات.
    1. بعد الغسيل الثاني، نضح معظم وسائل الإعلام، تاركاً ~ 20 ميليلتر. قوة تهز لوحات باستخدام فورتيكسير ميكروسكوبية لمدة 30 ثانية على الأقل لتخفيف أي حطام من الجزء السفلي من الآبار).
  9. بعد الغسيل النهائي، المادة طافية aspirate وصولاً إلى 20 ميليلتر. إضافة 50 ميليلتر من الحمض النووي ميكرومتر 0.98 وصمة عار (انظر الجدول للمواد)/كذلك من لوحة 384، حسنا، لتركيز نهائي من 0.7 ميكرومتر.
  10. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 12-16. فقط سوف هذه الصبغة من وصمة عار الديدان الميت. بعد فترة الحضانة المرجوة، وصمة ألواح الغسيل باستخدام الغسالة الميكروسكوبية لإزالة أي فائض (الحد أدنى ليغسل 3).
  11. للحصول على البيانات، استخدم جهاز المطياف الضوئي أو مجهر الآلي للصور الخفيفة المنقولة والأسفار (531 نانومتر الإثارة والانبعاثات 593).
    1. استخدم هدفا تضخم منخفضة للسماح لصورة البئر كله لالتقاطها.
    2. وبدلاً من ذلك، استخدم فيرميميتري التدفق. ويستخدم هذا الأسلوب من سيتوميتير تدفق كائن كبير فلوريميتير دودة، قياس حجم والأسفار للكائن الحي كله (أي، C. ايليجانس) بطريقة مشابهة بشدة للتدفق الخلوي.
  12. استخدام برنامج تحليل الصور الآلي (مثل سيلبروفيلير، استوديو تحليل صور حرة استناداً إلى مطلب http://cellprofiler.org/) لحساب مجالات دودة الفلورسنت ومجموع كل بئر بطريقة غير متحيزة.
    ملاحظة: يمثل حاصل قسمة هذه الأرقام الموت كسر لكل بئر. إذا كان كذلك 7 الملون الديدان خارجاً من 20 المجموع، ثم وفاة الكسر يتألف 0.35 أو 35%.
    1. قبل أول استخدام، يجب التحقق من صحة الأنابيب ومعالجة الصور الآلي بتسجيله يدوياً. يتم ذلك عن طريق مقارنة النتائج من خط الأنابيب الآلي للنتائج التي تم الحصول عليها بتفتيش الصور بصريا وتسجيل كسور ديدان الميت لكل منها. ويضمن عملية التحقق من صحة المعلمات من أجل تجهيز التصوير الآلي دقيقة وتمثيل البيانات بشكل صحيح.

5-التكيف لسلالات "الفرز متعددة" C. ايليجانس أو كنوكدوونس ([رني] شاشة الإعداد)

ملاحظة: هذا شاشة [رني] ووصف لإعداد لوحة 24-جيدا.

  1. أضف 1 مل من القاعدية S كل من صفيحة 24-جيدا جيدا (راجع الخطوة 3.17.3). بلطف تحرض الديدان التي تهز اللوحة، ثم نقل الديدان إلى صفيحة الآبار العميقة 24 فارغة، وعقيمة. السماح للديدان لتسوية جذبي (~ 5 دقائق).
  2. نضح المادة طافية، ترك حوالي 1 مل. إضافة 7 مل من S القاعدية لكل بئر.
  3. كرر الخطوات من 5، 1-5، 2 كحد أدنى من 2 مرات أكثر. بعد الغسيل النهائي، نضح المادة طافية، تاركاً ما يقرب من 400 ميليلتر.
  4. استخدام الدالة ريسامبلير فارز دودة، فرز الديدان 22 من تعليق دودة لوحة 24-جيدا في كل بئر من صفيحة 384-جيدا (كل بئر آبار غلة 8-12 لوحة 24-جيدا من صفيحة 384-جيدا).
    1. لتجنب المجاعة، ماصة البكتيريا في لوحات 384-جيدا (سلالة يخدم فقط كالغذاء، مثل OP50، أو سلالة ممرضة) قبل الفرز.
      ملاحظة: يمكن إضافة الكائنات الممرضة بواسطة الخطوات التالية 2.3 2.5 أو 6.4-6.5، والمصدر الغذائي يمكن أن تضعف البكتيريا وإضافتها باتباع نفس نظام أما P. الزّنجاريّة.
  5. بعد أن تم فرز الديدان في لوحة 384، حسنا، إضافة الجزيئات الصغيرة أو غيرها من المواد الخاصة بالتجربة.

6-التكيف هاء-فايكاليس

ملاحظة: يتم وصف الاختلافات فقط من P. الزّنجاريّة المقايسة.

  1. تعد مصدرا جديداً ل faecalis هاء- streaking البكتيريا من أسهم مجمدة على طبق أجار بهي (ضخ القلب الدماغ) وتفرخ ح 16 إلى 24 في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: القيام بتجارب faecalis هاء- داخل سلامة بيولوجية BSL-2 مجلس الوزراء التأكد من العقم. استخدام احتياطات السلامة المناسبة لتقليل فرصة الإصابة المسببة للأمراض أو التلوث.
  2. ويمكن تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. وبعد هذه الفترة، استبدل بلوحة جديدة.
  3. ليلة قبل الفرز الديدان، تطعيم 3-5 مل بهي العقيمة مع مستعمرة واحدة من هاء-فايكاليس. احتضان ح 12-16 في 37 درجة مئوية مع إثارة الشغب.
  4. إضافة البكتيريا إلى الآبار أما P. الزّنجاريّة (3 x البكتيريا الموجودة في S القاعدية، OD600≈0.09).
    ملاحظة: هاء-faecalis، تكوين جيدا النهائي: faecalis هاء (OD600≈0.03)، وبهي = 10% v/v، مع حجم المتبقية المؤلفة من S القاعدية. تذكر أنه سيتم تسليم 25 ميليلتر من S القاعدية مع الديدان.
    ملاحظة: تنتج faecalis هاء- سميكة الأغشية الحيوية التي تستوعب وصمة عار الفلورسنت، مما تسبب في عدم وضوح الصور. الغسيل واسعة النطاق قد لا تكون كافية لإزالة هذا بيوفيلم. في هذه الحالة، يمكن نقل الديدان إلى صفيحة فارغة استخدام ماصة متعددة القنوات. لتسهيل نقل، يمكن إضافة 20 توين إلى S القاعدية لتركيز 0.1% (v/v) 20 توين في القاعدية S نهائية. وهذا يساعد في إزالة الديدان من بيوفيلم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعالم الهامة لتحليل الأداء

فهم سليم للبيولوجيا الكامنة وراء هذا التحليل ضروري لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتحسين المقايسة. تحقيقا لهذه الغاية، ونشير أولاً إلى عدة ورقات رئيسية توضيح آليات إمراضية P. الزّنجاريّة-بوساطة قتل في السائل7،20. شريطة أن يتم اتباع الخطوات المذكورة أعلاه (انظر الشكل 1 لتخطيطي البروتوكول المقايسة) سيت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا الإنزيم (أو فحوصات مماثلة حيث يتم استبدال مسببات الأمراض الأخرى عن P. الزّنجاريّة أو هاء-faecalis) مفيدة لمجموعة متنوعة من الأغراض، بما في ذلك اكتشاف المخدرات. كما أنها مفيدة لمعالجة المسائل البيولوجية الأساسية، مثل تحديد عوامل الفوعة، توضيح سبل الدفاع المضيف، وتحديد الآلية التنظيمية المشتركة في التفاعل الممرض المضيف.

على الرغم من مقايسة "قتل" P. الزّنجاريّة السائل قوية، هناك عدة نقاط حيث ينبغي إيلاء اهتمام دقيق لتقليل الفرصة للفشل. أولاً، وكما ذكر، يجب أن تظل لو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذه الدراسة بالوقاية من السرطان ومعهد أبحاث من ولاية تكساس (كبريت) جائزة RR150044، ج المنح البحثية مؤسسة ولش-1930، ومن المعاهد الوطنية من AI110552 K22 على الصحة، منح NVK. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
COPAS FP BioSorterUnion Biometrica مقياستدفق الجسم الكبير / فارز الدودة
Cytation 5BioTek
EL406 موزع غسالةBioTek
Multitron ProInfors HT
24 Deep-Well RB BlockThermo Fisher ScientificCS15124
384-Well لوحةGreiner Bio-OneMPG-781091
وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM)الكمية لكل لتر: 18 جرام أجار ، 3 جرام كلوريد الصوديوم ، 2.5 جرام بيبتون ، 1 مل كلور المكالسيوم < الفرعي >2< / فرعي > (1 م) ، 1 مل MgSO4< / sub> (1 م) ، 25 مل عازلة الفوسبات ، و 973 مل من
ألواحالقتل البطيء للماء (SK)الكمية لكل لتر: 18 جرام أجار ، 3 جرام كلوريد الصوديوم ، 3.5 جرام بيبتون ، 1 مل كلور كالسيوم < >2 < / فرعي > (1 م) ، 1 مل MgSO4< / sub> (1 م) ، 25 مل عازلة فوسبات ، و 973 مل من
القتل البطيء للماء (SK)الكمية لكل لتر:   ؛ 3 جرام كلوريد الصوديوم ، 3.5 جرام بيبتون ، 1 مل CaCl 2 < / sub > (1 M) ، 1 مل MgSO4< / sub> (1 M) ، 25 مل عازلة فوسفات ، و 973 مل من مرق
Lysogeny Water milli-Q (LB)USBiological Life SciencesL1520
مرق بريان لضخ القلب (BHI) ResearchProducts International Corp50-488-526
محلولمبيض الدودةالكمية لكل 100 مل: 10 مل من محلول هيبوكسيد الصوديوم 5 M ، 20 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 5٪ ، و 70 مل من الماء المعقم
Sلكل لتر: 5.85 جرام كلوريد الصوديوم ، 6 جرام كيلو كلوريد الصوديوم < >2< / فرعي >PO 4< / sub > ، 1 جرام K2< / sub>HPO4< / sub> ، و 1 لتر من ماء مللي Q
أجارUSBiological Life SciencesA0930
NaClUSBiological Life SciencesS5000
PeptoneUSBiological Life SciencesP3300
CaCl2< / sub>USBiological Life Sciences
MgSO4< / sub>Fisher ScientificM63-500
العازلةلكل لتر: 132 مل من K2HPO4 (1M) و 868 مل من KH2PO4 (1M)
KH2< / sub>PO4< / sub>Acros Organics7778-77-0
K2< / sub>HPO4< / sub>USBiological Life SciencesP5100
5٪ محلول هيبوكلوريت الصوديومBICCA7495.5-32
حل هيدروكسيد الصوديومفيشر ScientificSS255-1
التنفس السهلالتكنولوجيا الحيوية المتنوعةBEM-1
SYTOX البرتقال الحمض النووي وصمة عارفيشر ScientificS11368
<قوية >سلالات بكتيرية< / قوية >
< > P. aeruginosa < / em > (PA14)
< em>E. faecalis< / em> (OG1RF)
الإشريكية القولونية < / em>superfood (OP50)
الإشريكية القولونية < / em>RNAi التي تعبر عن البكتيريا (HT115)
< قوية > سلالات الدودة < / قوية >
< > glp-4 < / em> (bn2< / em>) (Beanan and Strome ، 1992 ، PMID: 1289064)
PINK-1 :: مراسل GFP (Kang et al. ، 2018 ، PMID: 29532717)
وسائط الكمية الأساسية كمية للفوسبات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Falagas, M. E., et al. Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).
  2. Hsueh, P. R., et al. Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).
  3. Wang, C. Y., et al. Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes. Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).
  4. Yao, Y., et al. Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1. Genome Announcements. 5 (3), (2017).
  5. Utari, P. D., Quax, W. J. Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism. Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).
  6. Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model. Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).
  7. Kirienko, N. V., et al. Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death. Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).
  8. Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence. mSphere. 1 (4), (2016).
  9. Manning, A. J., et al. A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis. Methods. 127, 3-11 (2017).
  10. Marwaha, S., et al. N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).
  11. Kota, K. P., et al. Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection. PLoS One. 8 (1), e55167(2013).
  12. Arif, M., et al. Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion. Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).
  13. Jayamani, E., et al. Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).
  14. Moy, T. I., et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).
  15. Rajamuthiah, R., et al. Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 9 (2), e89189(2014).
  16. Breger, J., et al. Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay. PLoS Pathogens. 3 (2), e18(2007).
  17. Garvis, S., et al. Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence. PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540(2009).
  18. Zhou, Y. M., et al. An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).
  19. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visual Experiments. (51), (2011).
  20. Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).
  21. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).
  22. Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response. Virulence. , 1-41 (2018).
  23. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921(2003).
  24. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).
  25. Tjahjono, E., Kirienko, N. V. A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genetics. 13 (6), e1006876(2017).
  26. Moy, T. I., et al. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).
  27. Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).
  28. Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), 755-766 (1992).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C Elegans PathosystemLiquid Killing AssayHigh throughput ScreeningRNAi Genetic ScreenPseudomonas AeruginosaEnterococcus FaecalisWorm SortingSpectrophotometer AnalysisMulti well PlateBiosafety Cabinet

Related Articles