مقالة منهجية

تعبير البروتينات الفلورية الانصهار في مورين الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم والضامة

DOI:

10.3791/58081

⸱

أكتوبر 30, 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكول مفصل للتعبير عن البروتينات الفلورية الانصهار في نخاع العظام مورين اشتقاق الخلايا الجذعية والضامة. ويستند الأسلوب في توصيل نخاع العظام المتكفل بنيات فيروسات النسخ العكسي متبوعاً بتمايز إلى الضامة والجذعيه الخلايا في المختبر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية والضامة هي خلايا الحاسمة التي تشكل الخط الأول للدفاع ضد العوامل الممرضة. كما أنها تؤدي أدواراً هامة في بدء استجابة مناعية تكيفية. العمل التجريبي مع هذه الخلايا بدلاً من ذلك التحدي. كثرة في الأعضاء والأنسجة منخفضة نسبيا. كنتيجة لذلك، لا يمكن أن تكون معزولة بإعداد كبيرة. وأيضا صعوبة في ترانسفيكت مع بنيات كدنا. في طراز مورين، يمكن تجاوز هذه المشاكل جزئيا بالتمايز في المختبر من فروعه نخاع العظام بحضور م-CSF الضامة أو GM-CSF للخلايا الجذعية. وبهذه الطريقة، من الممكن الحصول على كميات كبيرة من هذه الخلايا من عدد قليل جداً من الحيوانات. وعلاوة على ذلك، يمكن أن ترانسدوسيد المتكفل نخاع العظام مع الفيروسات التراجعية ناقلات تحمل نيات كدنا خلال المراحل المبكرة لزراعة قبل على التمايز في الخلايا الجذعية نخاع العظام المشتقة والضامة. وهكذا، يمكن توصيل النسخ العكسي متبوعاً بتمايز في المختبر للتعبير عن مختلف بنيات كدنا في هذه الخلايا. القدرة على التعبير عن البروتينات خارج الرحم إلى حد كبير يمتد مجموعة التجارب التي يمكن إجراؤها على هذه الخلايا، بما في ذلك تصوير الخلايا الحية من البروتينات الفلورية، وتنقية جنبا إلى جنب لتحليلات إينتيراكتومي، تحليل بنية دالة، ورصد الوظائف الخلوية مع أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، وغيرها الكثير. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول مفصل لتوصيل النسخ العكسي للخلايا الجذعية نخاع العظام موريني المشتقة والضامة مع ناقلات الترميز لمعلم فلوريسسينتلي البروتينات. على سبيل المثال من اثنين من البروتينات محول، OPAL1 و PSTPIP2، علينا أن نظهر تطبيقه العملي في التدفق الخلوي والفحص المجهري. نحن أيضا مناقشة مزايا وقيود من هذا النهج.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتمثل الخلايا النقوي جزءا لا يتجزأ من آليات الدفاع لدينا ضد مسببات الأمراض. فقادرة على سرعة القضاء على الميكروبات، فضلا عن خلايا الموت. وباﻹضافة إلى ذلك، كما أنها تشارك في تنظيم التنمية الأنسجة وإصلاح والحفاظ على التوازن1،،من23. كافة الخلايا النقوي تفرق من فروعه النقوي الشائعة في نخاع العظام. على التمايز إلى عدة مجموعات فرعية متميزة وظيفيا وشكليا إلى حد كبير تسيطر عليها السيتوكينات وعلى تركيبات مختلفة4. وتشمل المجموعات الأكثر كثافة درس الخلية النقوي المحببة بالعدلات والضامة والخلايا الجذعية. عيوب في أي من هؤلاء السكان يؤدي إلى عواقب تهدد الحياة وسبب الخلل الشديد في الجهاز المناعي لدى البشر والفئران1،2،،من35، 6.

خلافا بالعدلات المحببة، الخلايا الجذعية والضامة خلايا الأنسجة المقيمين وعلى وفرة في أجهزة المناعة منخفضة نسبيا. نتيجة لذلك إلى العزلة وتنقية الخلايا الجذعية الأولية والضامة للتجارب التي تتطلب عددا كبيرا من هذه الخلايا مكلفة وغالباً ما يكون من المستحيل. لحل هذه المشكلة، وضعت بروتوكولات للحصول على كميات كبيرة من الضامة متجانسة أو الخلايا الجذعية في المختبر. تستند هذه النهج على التفريق بين خلايا نخاع العظام موريني حضور السيتوكينات: بلعم محفزة لمستعمرة عامل (م-CSF) الضامة وعامل تحفيز مستعمرة بلعم المحببات (GM-CSF) أو يجند Flt3 ل الخلايا الجذعية7،،من89،10،،من1112. ويرد عادة الخلايا التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب في الأدب نخاع العظام المستمدة الضامة (بمدمس)، ونخاع العظام المستمدة من الخلايا الجذعية (بمدكس). لديهم المزيد من الخصائص الفسيولوجية مشتركة مع الابتدائي الضامة أو الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا المناظرة. ميزة رئيسية أخرى إمكانية الحصول على هذه شكل خلايا وراثيا تعديل الفئران13. الدراسات المقارنة بين البرية من نوع الخلايا والخلايا المشتقة من الفئران المعدلة وراثيا غالباً ما تكون حاسمة بالنسبة لوظائف الرواية الكشف عن الجينات أو البروتينات للفائدة.

تحليل التعريب سوبسيلولار للبروتينات في الخلايا الحية يتطلب اقتران تسمية الفلورسنت للبروتين من الفائدة في فيفو. الأكثر شيوعاً ويتحقق ذلك بالإعراب عن بناء الانصهار وراثيا المرمزة تتألف من البروتين تم تحليلها الاقتران (غالباً عن طريق رابط قصيرة) إلى بروتين فلوري (مثلاً.، أخضر نيون البروتين (بروتينات فلورية خضراء))14،15 , 16-التعبير عن كلمات فلوريسسينتلي البروتينات في الخلايا الجذعية أو الضامة التحدي. هذه الخلايا عموما من الصعب ترانسفيكت بالإجراءات القياسية تعداء وأوجه الكفاءة التي تميل إلى أن تكون منخفضة جداً. وعلاوة على ذلك، تعداء عابر وأنه يولد الإجهاد الخلوية وكثافة المحققة من الأسفار قد لا تكون كافية للفحص المجهري17. من أجل الحصول على جزء معقول من هذه الخلايا مع مستوى كاف من التعبير التحوير، وعدوى الخلايا السلف نخاع العظام مع النسخ العكسي أصبحت هذه التفرقة اللاحقة إلى بمدمس أو بمدكس ومتجهات فعالة جداً النهج. وقد أتاح تحليل البروتينات النقوي المنشأ في بيئتها الخلوية الأصلية، سواء في حالة مستقرة أو أثناء العمليات التي تعتبر حاسمة بالنسبة للاستجابة المناعية مثل البلعمه، وتشكيل المشبك المناعية أو الهجرة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يسمح لتعبير مستقر من البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة الاهتمام بنخاع العظام موريني المستمدة الضامة، والخلايا الجذعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا "لجنة الخبراء" المعنية "رعاية الحيوانات التجريبية" لمعهد علم الوراثة الجزيئي، وأكاديمية العلوم للجمهورية التشيكية.

1-كاشف إعداد

  1. إعداد المخزن المؤقت الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK). إضافة غ 4.145 NH4Cl و 0.5 غ كهكو3 إلى 500 مل من ddH2س، ثم إضافة 100 ميليلتر من 0.5 م الإيثيلين حمض (يدتا) وتعقيم عامل التصفية.
  2. إعداد حل بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد). إضافة 0.1 غرام بي إلى 90 مل ddH2o. بينما التحريك، إضافة 1 M HCl dropwise حتى يصبح الرقم الهيدروجيني أقل من 2.0. يقلب لمدة تصل إلى 3 ساعات حتى يذوب بي ثم قم بضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.2 مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم. ضبط حجم الصوت إلى 100 مل مع ddH2س وتعقيم عامل التصفية. قم 1 – 2 مل مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: بعد ذوبان الجليد، بي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لتصل إلى 2 أسابيع لكن يجب عدم إعادة تجميد.
  3. إعداد supernatants ثقافة الخلية التي تحتوي على السائل النخاعي M أو GM-CSF. هذه سوبيرناتانتس يمكن إجراؤها مسبقاً والمخزنة في-80 درجة مئوية. لجعل هذه سوبيرناتانتس، ينمو إنتاج سيتوكين الخلايا (خلايا J558 GM-CSF 18 ) أو خلايا CMG 14-12 للخدمات القطرية م 19في 10 سم طبق بيتري في متوسطة النسر معدلة في دولبيكو (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) لالتقاء. ثم نقل كافة الخلايا إلى 200 مل من وسائل الإعلام في قارورة T150 زراعة الأنسجة والثقافة 4 أيام إضافية عند 5% CO237 درجة مئوية. جمع المادة طافية وتصفية على 0.2 ميكرون التعقيم التصفية. جعل مختبرين وتخزين هذه في-80 درجة مئوية.
  4. تحضير 100 مل من خلايا الثقافة المتوسطة: دميم وتستكمل مع 10% الحرارة FBS المعطل وخلية supernatants ثقافة من خلايا إفراز GM-CSF (للتفريق بمدك) أو M-CSF (للتمايز بمدم).
    ملاحظة: يمكن أن تختلف كمية السيتوكينات في هذه سوبيرناتانتس وتركيز العمل قد يتحدد تجريبيا. نموذجياً، يتم استخدام المادة طافية 2 – 3% من خطوط الخلايا التي تنتج GM-CSF (تركيز انطلاق الموصى به 2 ٪) أو المادة طافية 5-10% من CMG 14 – 12 الخلايا المنتجة م-CSF (تركيز انطلاق الموصى به هو 10%). وبدلاً من ذلك، تنقية تجارياً م الخدمات القطرية المتاحة في 10 نانوغرام/مل و GM-CSF في 20 نانوغرام/مل يمكن استخدامها مع نتائج متطابقة تقريبا إلى سيتوكين التي تحتوي على سوبيرناتانتس، أي.، دون أي تأثير على معدل التمايز، كفاءة الإصابة والتعريب سوبسيلولار من بنيات معلم اجفب. المضادات الحيوية، بما في ذلك البنسلين ز (100 وحدة/مل)، ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل) ومن الجنتاميسين (40 ميكروغرام/مل)، يمكن استخدامها لزراعة الخلايا في أي خطوة للبروتوكول ما لم يذكر خلاف ذلك.

2-إنتاج لفي

تنبيه: رغم أن الناقلة للفيروس آمنة نسبيا بالمقارنة مع أنواع أخرى من النواقل الفيروسية، أنها لا تزال تشكل خطرا محتملاً في سلامة. ولذلك، من الأهمية بمكان للعمل بأقصى قدر من العناية ومعدات الوقاية المناسبة، والتقيد بجميع أنظمة السلامة والمتطلبات القانونية للعمل مع الجزيئات الفيروسية.

  1. لوحة تعليق خلية مفردة للبلاتين--منظمة التعاون الاقتصادي (بلات-E) تغليف الخلايا في 10 سم طبق بيتري وزراعتها في 15 مل دميم التي تحتوي على 10% FBS حتى 50-60 ٪ روافد (24 ساعة). ينبغي أن ينمو في أحادي الطبقة الخلايا ولا ينبغي أن يشكل كتل في الثقافة.
  2. ماصة 20 ميكروغرام من بناء النسخ العكسي (مثلاً.، في بناء التعبير عن البروتين فلوريسسينتلي المعلمة الاهتمام بناقل بمسكف) و 10 ميكروغرام للتعبئة والتغليف الإيكولوجي pCL ناقلات20 إلى 1 مل دميم (بدون المصل والمضادات الحيوية) وتخلط برفق.
  3. لأنبوب ثان، بإضافة 75 ميليلتر من جزيرة الأمير إدوارد في 1 مل دميم (بدون المصل والمضادات الحيوية). احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) ثم تخلط محتويات كلا أنابيب معا واحتضانها لإضافية 10 دقيقة في الرايت
    ملاحظة: إضافة pCL-الإيكولوجية اختياري. هو ترميز لمستقبلات الفيروسية اكوتروبيك وقد تزيد من عيار الفيروس.
  4. بعناية استبدال المتوسطة في الخلايا بلات-E مع 8 مل دميمسوبليمينتيد الطازجة مع 2% FBS. قبل الحارة المتوسط إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. عدم استخدام المضادات الحيوية خلال تعداء، نظراً للمضادات الحيوية قد يقلل من كفاءة تعداء.
  5. بعناية إضافة (في قطرات) المخلوط إعدادها في الخطوة 2.3 في الخلايا بلات-E، واحتضانها ح 4 في 37 درجة مئوية.
  6. بعد الاحتضان، تبادل المتوسطة في الخلايا بلات-ه لمل 10 من دميم المعالجون مسبقاً التي تتضمن 10% FBS، وزراعة الخلايا ل 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. خلال هذه الحضانة، ستنتج خلايا ه بلات الفيروس في وسائل الإعلام.
  7. بعد 24 ساعة، جمع المتوسطة التي تحتوي على جزيئات الفيروسات التراجعية من الخلايا "البلاتين الإيكولوجية" باستخدام ماصة 5 مل ونقلها إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل (= "1 طافية" التي تحتوي على جزيئات الفيروس اكوتروبيك).
  8. لتجنب التلوث بالخلايا بلات-ه في supernatants الفيروسية، تدور الفيروس التي تم جمعها في 1250 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. للحصول على أفضل النتائج، يجب استخدام الفيروس فورا للعدوى.
    ملاحظة: مختبرين للفيروسات يمكن أيضا تخزين في-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. ومع ذلك، فإنه سيؤدي إلى في الحد من بعض في كفاءة توصيل. تجنب تكرار تجميد/ذوبان الجليد للفيروس، نظراً لأنه يؤدي إلى تدهور الفيروس.
  9. أضف 10 مل دميم المعالجون مسبقاً مع 10% FBS إلى ه بلات الخلايا وزراعتها لآخر 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  10. كرر الخطوات من 2.7. و 2.8. للحصول على "طافية 2".

3-عزل خلايا نخاع العظام مورين

  1. التضحية بخلع عنق الرحم أو أي أسلوب من أساليب المعتمدة باستخدام الماوس. رذاذ الماوس مع الإيثانول 70%.
  2. استخدام الملقط، والمقص، إزالة الجلد، فضلا عن جزء من عضلات من الخلفيتين. عناية إزاحة لحق من الورك دون كسر عظم الفخذ. قص مخلب في الكاحل. رش العظام (عظم الفخذ متصلة بالساق) مع الإيثانول 70% وإزالة بقية العضلات باستخدام منشفة ورقية.
  3. ضع العظام في طبق بتري 5 سم تحتوي على الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) بنسبة 2% FBS (برنامج تلفزيوني-FBS).  إذا إعداد المزيد من العظام، والحفاظ على طبق بيتري على الجليد حتى تتم معالجتها.
  4. لتأمين زراعة العقم، تنفيذ كافة الخطوات التالية في غطاء زراعة الأنسجة.
  5. فصل في عظم الفخذ من الساق دون كسر نهايات العظام في الركبة المشتركة وقطع بعناية مع المقص (منحنى).
  6. عملية العظام واحداً تلو الآخر. قطع جزء صغير جداً من ابيفيسيس (حوالي 1 – 2 مم) مع مقص أثناء الضغط العظام في ملاقط.
  7. استخدام إبرة ز 30 و 2 أو 5 مل حقنه مليئة ببرنامج تلفزيوني-FBS لمسح خلايا نخاع العظام من كلا طرفي العظام في أنبوب الطرد مركزي 15 مل. حرك الإبرة داخل العظام أثناء التنظيف من أجل إزالة كافة الخلايا. إذا كان يحصل انسداد الإبرة، تغييره.
    ملاحظة: العظام ينبغي أن تتحول من اللون الأحمر إلى الأبيض أثناء التنظيف. يشير هذا إلى أنه قد تم إزالة معظم الخلايا من العظام. استخدام حوالي 2 – 3 مل من برنامج تلفزيوني-FBS في العظام.
  8. الطرد المركزي الخلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  9. تجاهل المادة طافية وخلايا الدم الحمراء التي ريسوسبيندينج بيليه في 2.5 مل من المخزن المؤقت ACK لمدة 2 – 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خلال تحلل، تصفية خلايا النخاع العظمى من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب سينتريفوج طازجة 15 مل. استعادة تونيسيتي عن طريق إضافة 12 مل من برنامج تلفزيوني-FBS.
    ملاحظة: لا تتجاوز 5 دقائق لتحلل ناقص التوتر مع المخزن المؤقت ACK لتجنب موت الخلية.
  10. الطرد المركزي فورا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.

4-نخاع العظام الخلية التمايز في نخاع العظام المستمدة الضامة

  1. ريسوسبيند بيليه خلايا نخاع العظام في دميم وتستكمل مع 10% FBS والمضادات الحيوية (راجع الملاحظة بعد "الخطوة 1، 4". لتركيز المضادات الحيوية) وحساب الخلايا. لوحة للتمايز إلى BM المستمدة الضامة، 5 – 10 × 106 خلايا نخاع العظام في 10 سم غير-الأنسجة ثقافة تعامل طبق بتري (البكتيرية) مع 10 مل الإعلام دميم معدّة سلفا بمصل الدم والسائل النخاعي م من "الخطوة 1، 4".
    ملاحظة: هو عائد خلايا نخاع العظام حوالي 4 × 107 في الأسبوع 6-8-القديمة C57BL/6J الماوس.
  2. احتضان الخلايا في خلية ثقافة حاضنة لمدة 3 أيام في 5% CO2، 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: خلال أول يومين، خلايا لا تبدو حيوية جداً، ما عدد كبير من الخلايا أبوبتوتيك (خلايا غير قادر على التفريق في النقوي الخلايا والخلايا المتمايزة لا شفاء منه).
  3. بعد 3 أيام، ثقافة خلية نخاع العظم يبدأ البحث الحيوية ويتم تشكيل مجموعات من تقسيم الخلايا. يمكن فعلا ملاحظة الخلايا ملتصقة الأولى. عند هذه النقطة، الملحق الخلايا مع وسائل الإعلام سيتوكين الطازجة.
  4. أضف 10 مل من وسائط الإعلام دميم المعالجون مسبقاً مع M-CSF (من الخطوة 1، 4) والمصل في كل 10 سم طبق بيتري وإعادته في حاضنة الثقافة الخلية. ليست هناك حاجة إزالة الوسائط القديمة أثناء هذه الخطوة.
    ملاحظة: تختلف الضامة نخاع العظام بالكامل بعد 5 – 7 أيام في الثقافة. أفضل وقت للحصاد في يوم 6-8، حيث تكون أغلبية الخلايا ملتصقة وطبق بيتري مغطى تماما.
  5. في يوم 5، تأخذ طبق بيتري في خلية ثقافة غطاء محرك السيارة وانحدر الطبق حتى وسائل الإعلام تقريبا تصل إلى حافة الطبق. تأخذ بعناية بها 15 مل من وسائط الإعلام من على سطح الأرض قرب الحافة، والخلايا تميل إلى البقاء في منتصف الطبق. إضافة نفس الحجم من وسائل الإعلام قبل دافئة مع الخدمات القطرية م ووضع الطبق مرة أخرى إلى الحاضنة.
    ملاحظة: إذا كانت وسائل الإعلام ويستنشق ببطء وبعناية، تضيع تقريبا أي من الخلايا. ومع ذلك، من الممكن أيضا الطرد المركزي وسائط الإعلام يستنشق وإضافة الخلايا إلى الثقافة، لضمان أن لا يوجد غير ملتصقة (أي.، متمايزة) الخلايا يتم فقدان.
  6. للتجارب، وتستخدم الخلايا ملتصقة فقط (الضامة). لحصاد الخلايا، في يوم 6 أو 7، قم بإزالة جميع خلايا العائمة ووسائل الإعلام. أغسل الطبق مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً دون المصل.
  7. إضافة 5 مل يدتا 0.02 في المائة في برنامج تلفزيوني، واحتضان لمدة 3-5 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة استنبات الأنسجة.
  8. استخدام ماصة 5 مل، إزالة الخلايا من الطبق بتيار PBS-يدتا ووضعها في أنبوب الطرد مركزي 50 مل مع 25 مل من برنامج تلفزيوني. إذا لزم الأمر، تجمع الأطباق أكثر معا.
  9. الطرد المركزي فورا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  10. ريسوسبيند بيليه بلعم في وسائط الإعلام دميم وحساب الخلايا. التحقق من التعبير عن علامات التمايز السطحية بلعم (CD11b و F4/80) عن طريق التدفق الخلوي.
  11. للتجارب التي تتطلب الخلايا في التعليق، على سبيل المثال-، التدفق الخلوي التجارب، أو قبكر، أو تحليل لطخة غربية، واستخدم الضامة صورة مباشرة. لإجراء التجارب مع الضامة ملتصقة، لوحة الخلايا الموجودة في لوحة زراعة الأنسجة وفقا للإعداد التجريبية.
  12. تختلف الخلايا بالفعل تماما. الاحتفاظ بها في وسائل الإعلام مناسب للتجربة المقصودة أو في وسائط النمو والتمايز الأصلية مع M-CSF.
    ملاحظة: للعامل مع الضامة ملتصقة، تحويلها إلى جديدة لوحة على الأقل 6 ح قبل الاستخدام (ومن الناحية المثالية بين عشية وضحاها) للسماح بانضمام كامل إلى السطح الجديد. يمكن إزالة جزء صغير من العائمة الخلايا قبل التجربة.

5-نخاع العظام الخلية التمايز في نخاع العظام المستمدة من الخلايا الجذعية

  1. يتبع البروتوكول بمدمس مع إجراء تعديلات محددة بمدكس هو موضح أدناه في خطوات 5.2 – 5.4.
  2. ريسوسبيند بيليه التي تم الحصول عليها من خلايا نخاع العظام في دميمسوبليمينتيد مع 10% FBS والمضادات الحيوية، وحساب عدد الخلايا (بالتالي "الخطوة 4-1" من البروتوكول بلعم). تعامل بلايت 1 – 1.5 × 10 خلايا النخاع العظمى7 في 10 سم غير-زراعة الأنسجة للتمايز في الخلايا الجذعية، طبق بتري (الجرثومية) في 10 مل الإعلام دميم المعدة مسبقاً مع المصل و GM-CSF (من "الخطوة 1، 4".).
  3. اتبع نفس الخطوات كما هو الحال في البروتوكول بمدم زراعة (خطوات 4.3 – 4.5. بلعم البروتوكول). استخدام الوسائط دميم مع GM-CSF بدلاً من م-CSF والمصل. إذ لم يعد بمدكس الوقت زراعة (عادة 10 – 12 يوما)، بإضافة الوجبات الإضافية 1 – 2 في فترات اليوم 3 (بإزالة المادة طافية وإضافة وسائط زراعة جديدة كما هو موضح في الخطوة 4، 5)..
  4. هذا الجزء من البروتوكول هو تقريبا نفس الجزء المقابل من البروتوكول بلعم (خطوات 4.6 – 4.12. بلعم البروتوكول). لتجارب استخدام الخلايا ملتصقة فقط. في يوم 10-12، جمع الخلايا باستخدام يدتا، عد ولوحة لهم على سطح جديد. تحقق من التعبير عن علامات التمايز السطحية للخلايا الجذعية (CD11c +، CD11b + F4/80-) بالتدفق الخلوي.

6-إنتاج بمدمس وبمدكس التعبير عن البروتين معلم اجفب للفائدة

  1. ريسوسبيند بيليه خلايا النخاع العظمى التي تم الحصول عليها في "الخطوة 3، 10". في دميم تستكمل مع 10% FBS والمضادات الحيوية وحساب الخلايا. للعدوى، استخدم 2 – 5 × 106 خلايا BM الواحدة من ثقافة الأنسجة 6-جيدا جيدا تعامل لوحة.
  2. لوحة الخلايا الموجودة في 1 مل من وسائط الإعلام دميم استعداد كل أيضا، تستكمل مع M-CSF للتمايز في بمدمس أو GM-CSF للتمايز في بمدكس. إبقاء الخلايا ح 4 – 6 في حاضنة استنبات الأنسجة مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 2 مل فيروس حديثا جمعها ("1") طافية وتستكمل مع بوليبريني (12 ميكروغرام/مل، وتركيز النهائي 8 ميكروغرام/مل بعد، بالإضافة إلى الخلايا).
    ملاحظة: قاسمة المجمدة من المادة طافية المحتوية على الفيروس يمكن أن تستخدم أيضا، ولكن سيكون أقل فعالية.
  4. الطرد المركزي اللوحة في 1,250 س ز لمدة 90 دقيقة في 30 درجة مئوية (مع تسارع بطيئة وتباطؤ). ثم احتضانها ح 4 مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
  5. اختياري: استبدال 2 مل وسائط الثقافة مع الطازجة سيتوكين كل منها تحتوي على المتوسط (م-قوات الأمن المركزي أو GM-CSF) والثقافة مع 5% CO2 في 37 درجة مئوية. اليوم الثاني، إزالة 2 مل وسائط الثقافة وكرر الإجراء الإصابة بأكملها (الخطوة 6.3 – 6.4) مع 2 مل فيروس حديثا جمعها ("طافية 2").
    ملاحظة: هذه الخطوة قد تزيد الإصابة بفعالية. تحسن بعد الإصابة الثانية تعتمد على البروتين الهدف ونوع الخلية وفي تجربتنا يمكن أن تختلف من زيادة بنسبة 30% في كفاءة إلى أي تحسن على الإطلاق.
  6. جمع الخلايا غير ملتصقة، نقل إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل، وتدور في ز x 500 لمدة 5 دقائق (4 درجات مئوية). تجاهل المادة طافية.
  7. ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل وسائط الثقافة مع الخدمات القطرية م أو GM-CSF، ووضع الخلايا في طبق بتري معالجة غير زراعة الأنسجة 10 سم والثقافة في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. هو العدد الأمثل من الخلايا لطبق 10 سم 5 – 10 × 106 ل BM المستمدة الضامة و 10 – 15 × 106 للخلايا الجذعية المشتقة من بي أم.
    ملاحظة: يمكن استخدام أطباق أصغر أو لوحات، ولكن يجب أن تكون تبعاً لأرقام الخلية.
  8. اتبع في بلعم والخلايا الجذعية زراعة والتمايز البروتوكول هو موضح في الخطوة 4 و 5.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مما يشير إلى محول البروتينات هي البروتينات الصغيرة عادة دون أي النشاط الأنزيمي. أنها تمتلك مختلف مجالات التفاعل أو زخارف، والتوسط الملزم للبروتينات الأخرى المتورطة في توصيل الإشارة، بما في ذلك تيروسين مؤنزم، فوسفاتاسيس، ليجاسيس أوبيكويتين وغيرها21. واختيرت للتدليل على وظيفة هذا البروتوكول خلية النقوي محولات PSTPIP2 و OPAL1. PSTPIP2 بروتين كذلك تتسم مشاركة في تنظيم الاستجابة الالتهابية22. هو بروتين هيولى الذي يمكن أيضا تعيين للأغشية الخلوية ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعبير عن بروتين فائدة في الخلايا الهدف خطوة رئيسية في العديد من أنواع الدراسات البيولوجية. الضامة متمايزة والخلايا الجذعية من الصعب أن ترانسفيكت من تعداء القياسية وتقنيات توصيل النسخ العكسي. تجاوز تعداء هذه الخلايا المتمايزة بتوصيل النسخ العكسي من فروعه نخاع العظام، تليها التمايز عندما يقومون بالفعل في بناء المنشود، خطوة حاسمة تسمح التعبير عن كدناس حمل خارج الرحم في هذه أنواع الخلايا. يمكن الاطلاع على مثال للنجاح في استخدام هذا الأسلوب في أعمالنا المنشور مؤخرا25. هنا، نحن نقدم بروتوكول فعالة من ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل بالتشيكية العلم مؤسسة (جاكر) (المشروع رقم 16-07425S)، تشارلز الجامعة منحة الوكالة (جاك) (رقم المشروع 923116) وعن طريق التمويل المؤسسي من معهد الوراثة الجزيئية، أكاديمية العلوم التشيكية الجمهورية (رفو 68378050).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEMThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية15028
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية10270لتجميع الوسائط
KHCO3< / sub>Lachema ، برنو ، جمهورية التشيكN / A
NH4< / sub>ClSigma-Aldrich (Merck ، Kenilworth ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية)A9434
PenicillinBB Pharma AS, براغ, جمهورية التشيكN / APENICILIN G 1,0 DRASELNÁ سول 'BIOTIKA
StreptomycinSigma-Aldrich (ميرك ، كينيلورث ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)S9137مسحوق ملح كبريتات الستربتومايسين
GentamicinDr. Kulich Pharma ، Hradec Kr & aacute ؛ lov é ؛ ، جمهورية التشيكN / A
Polyethylenimine ، خطي ، MW 25,000Polyscience ، وارينجتون ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية23966
PolybreneSigma-Aldrich (Merck ، Kenilworth ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية)H9268
EDTASigma-Aldrich (Merck ، Kenilworth ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية)E5134
PBSتم إعداده داخليا بواسطة مرفق إعلامي لشركة IMG ASCR ، براغ ، جمهوريةالتشيكN / A
APC المضاد للفأر / الجسم المضاد CD11b البشري ، استنساخ M1 / 70BioLegend (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)101212تحليل قياس التدفق
PE المضاد للفأر F4 / 80 ، استنساخ BM8BioLegend (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)123110تحليل قياس التدفق
APC المضاد للفأر CD11c ، استنساخ N418BioLegend (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)117310تحليل قياس التدفق الخلوي
M-CSFPeproTech (روكي هيل ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)315-02
GM-CSFPeproTech (روكي هيل ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)315-03
Hoechst 33258Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةالخلوي H1398عند 1-2 & micro ؛ جم / مل
الخلوي الخلوي استخدام تحليل قياس التدفق

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
  2. Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  4. Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
  5. Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
  6. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  7. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
  8. Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
  11. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  12. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  13. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
  14. Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
  15. Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
  16. Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
  17. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
  18. Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
  19. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  20. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  21. Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
  22. Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
  23. Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
  24. Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
  25. Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
  26. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960(2014).
  27. Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766(2011).
  28. Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
  29. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  30. Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
  31. Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
  32. Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
  33. Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
  34. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
  35. McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
  36. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Platinum Eco packaging M CSF GM CSF

مقالات ذات صلة