مقالة منهجية
في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكول مفصل للتعبير عن البروتينات الفلورية الانصهار في نخاع العظام مورين اشتقاق الخلايا الجذعية والضامة. ويستند الأسلوب في توصيل نخاع العظام المتكفل بنيات فيروسات النسخ العكسي متبوعاً بتمايز إلى الضامة والجذعيه الخلايا في المختبر.
الخلايا الجذعية والضامة هي خلايا الحاسمة التي تشكل الخط الأول للدفاع ضد العوامل الممرضة. كما أنها تؤدي أدواراً هامة في بدء استجابة مناعية تكيفية. العمل التجريبي مع هذه الخلايا بدلاً من ذلك التحدي. كثرة في الأعضاء والأنسجة منخفضة نسبيا. كنتيجة لذلك، لا يمكن أن تكون معزولة بإعداد كبيرة. وأيضا صعوبة في ترانسفيكت مع بنيات كدنا. في طراز مورين، يمكن تجاوز هذه المشاكل جزئيا بالتمايز في المختبر من فروعه نخاع العظام بحضور م-CSF الضامة أو GM-CSF للخلايا الجذعية. وبهذه الطريقة، من الممكن الحصول على كميات كبيرة من هذه الخلايا من عدد قليل جداً من الحيوانات. وعلاوة على ذلك، يمكن أن ترانسدوسيد المتكفل نخاع العظام مع الفيروسات التراجعية ناقلات تحمل نيات كدنا خلال المراحل المبكرة لزراعة قبل على التمايز في الخلايا الجذعية نخاع العظام المشتقة والضامة. وهكذا، يمكن توصيل النسخ العكسي متبوعاً بتمايز في المختبر للتعبير عن مختلف بنيات كدنا في هذه الخلايا. القدرة على التعبير عن البروتينات خارج الرحم إلى حد كبير يمتد مجموعة التجارب التي يمكن إجراؤها على هذه الخلايا، بما في ذلك تصوير الخلايا الحية من البروتينات الفلورية، وتنقية جنبا إلى جنب لتحليلات إينتيراكتومي، تحليل بنية دالة، ورصد الوظائف الخلوية مع أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، وغيرها الكثير. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول مفصل لتوصيل النسخ العكسي للخلايا الجذعية نخاع العظام موريني المشتقة والضامة مع ناقلات الترميز لمعلم فلوريسسينتلي البروتينات. على سبيل المثال من اثنين من البروتينات محول، OPAL1 و PSTPIP2، علينا أن نظهر تطبيقه العملي في التدفق الخلوي والفحص المجهري. نحن أيضا مناقشة مزايا وقيود من هذا النهج.
وتمثل الخلايا النقوي جزءا لا يتجزأ من آليات الدفاع لدينا ضد مسببات الأمراض. فقادرة على سرعة القضاء على الميكروبات، فضلا عن خلايا الموت. وباﻹضافة إلى ذلك، كما أنها تشارك في تنظيم التنمية الأنسجة وإصلاح والحفاظ على التوازن1،،من23. كافة الخلايا النقوي تفرق من فروعه النقوي الشائعة في نخاع العظام. على التمايز إلى عدة مجموعات فرعية متميزة وظيفيا وشكليا إلى حد كبير تسيطر عليها السيتوكينات وعلى تركيبات مختلفة4. وتشمل المجموعات الأكثر كثافة درس الخلية النقوي المحببة بالعدلات والضامة والخلايا الجذعية. عيوب في أي من هؤلاء السكان يؤدي إلى عواقب تهدد الحياة وسبب ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا "لجنة الخبراء" المعنية "رعاية الحيوانات التجريبية" لمعهد علم الوراثة الجزيئي، وأكاديمية العلوم للجمهورية التشيكية.
1-كاشف إعداد
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
مما يشير إلى محول البروتينات هي البروتينات الصغيرة عادة دون أي النشاط الأنزيمي. أنها تمتلك مختلف مجالات التفاعل أو زخارف، والتوسط الملزم للبروتينات الأخرى المتورطة في توصيل الإشارة، بما في ذلك تيروسين مؤنزم، فوسفاتاسيس، ليجاسيس أوبيكويتين وغيرها21. واختيرت للتدليل على وظيفة هذا البروتوكول خلية النقوي محولات PSTPIP2 و OPAL1. PSTPIP2 بروتين كذلك تتسم مشاركة في تنظيم الاستجابة الالتهابية22. هو بروتين هيولى الذي يمكن أيضا تعيين للأغشية الخلوية ع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
التعبير عن بروتين فائدة في الخلايا الهدف خطوة رئيسية في العديد من أنواع الدراسات البيولوجية. الضامة متمايزة والخلايا الجذعية من الصعب أن ترانسفيكت من تعداء القياسية وتقنيات توصيل النسخ العكسي. تجاوز تعداء هذه الخلايا المتمايزة بتوصيل النسخ العكسي من فروعه نخاع العظام، تليها التمايز عندما يقومون بالفعل في بناء المنشود، خطوة حاسمة تسمح التعبير عن كدناس حمل خارج الرحم في هذه أنواع الخلايا. يمكن الاطلاع على مثال للنجاح في استخدام هذا الأسلوب في أعمالنا المنشور مؤخرا25. هنا، نحن نقدم بروتوكول فعالة من .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
وأيد هذا العمل بالتشيكية العلم مؤسسة (جاكر) (المشروع رقم 16-07425S)، تشارلز الجامعة منحة الوكالة (جاك) (رقم المشروع 923116) وعن طريق التمويل المؤسسي من معهد الوراثة الجزيئية، أكاديمية العلوم التشيكية الجمهورية (رفو 68378050).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM | Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 15028 | |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10270 | لتجميع الوسائط |
| KHCO3< / sub> | Lachema ، برنو ، جمهورية التشيك | N / A | |
| NH4< / sub>Cl | Sigma-Aldrich (Merck ، Kenilworth ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) | A9434 | |
| Penicillin | BB Pharma AS, براغ, جمهورية التشيك | N / A | PENICILIN G 1,0 DRASELNÁ سول 'BIOTIKA |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich (ميرك ، كينيلورث ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية) | S9137 | مسحوق ملح كبريتات الستربتومايسين |
| Gentamicin | Dr. Kulich Pharma ، Hradec Kr & aacute ؛ lov é ؛ ، جمهورية التشيك | N / A | |
| Polyethylenimine ، خطي ، MW 25,000 | Polyscience ، وارينجتون ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck ، Kenilworth ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck ، Kenilworth ، NJ ، الولايات المتحدة الأمريكية) | E5134 | |
| PBS | تم إعداده داخليا بواسطة مرفق إعلامي لشركة IMG ASCR ، براغ ، جمهورية | التشيكN / A | |
| APC المضاد للفأر / الجسم المضاد CD11b البشري ، استنساخ M1 / 70 | BioLegend (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 101212 | تحليل قياس التدفق |
| PE المضاد للفأر F4 / 80 ، استنساخ BM8 | BioLegend (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 123110 | تحليل قياس التدفق |
| APC المضاد للفأر CD11c ، استنساخ N418 | BioLegend (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 117310 | تحليل قياس التدفق الخلوي |
| M-CSF | PeproTech (روكي هيل ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (روكي هيل ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية) | 315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | الخلوي H1398 | عند 1-2 & micro ؛ جم / مل |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن