يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج ماوس في فيفو إلى تدبير السذاجة CD4 تي خلية التنشيط وانتشارها والتمايز Th1 الناجمة عن الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام

18.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58118

⸱

أغسطس 22, 2018

 ,  ,  , 
1LamImSys Lab, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 2LamImSys Lab, Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12), 3CIBER de Enfermedades Cardiovasculares

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، على بروتوكول لتحديد في فيفو السذاجة CD4 T الخلية (خلية T) تنشيط وانتشار، والتمايز Th1 الناجمة عن نخاع العظام GM-CSF (بي أم)-اشتقاق الخلايا الجذعية (DCs). وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول العزلة BM وخلايا T، وجيل العاصمة ونقل العاصمة وخلايا T التبني.

الملخص

التحديد الكمي لتنشيط خلية CD4 T ساذجة والانتشار والتمايز إلى مساعد تي 1 (Th1) الخلايا طريقة مفيدة لتقييم الدور الذي تلعبه الخلايا T في استجابة مناعية. ويصف هذا البروتوكول في المختبر التفريق بين فروعه نخاع العظم (بي أم) للحصول على المحببات بلعم التي حفز مستعمرة الخلايا الجذعية المشتقة عامل (GM-CSF) (DCs). كما يصف البروتوكول نقل التبني ovalbumin الببتيد (أوفاب)-تحميل DCs مشتقة من GM-CSF وخلايا CD4 T ساذجة من الفئران المعدلة وراثيا أوتيي من أجل تحليل التنشيط في فيفو ، والانتشار، والتمايز Th1 من نقل خلايا CD4 تي. هذا البروتوكول تلتف الحد من محض في فيفو أساليب فرضها عدم القدرة على التحديد التلاعب أو حدد الخلية درس السكان. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا البروتوكول دراسات في فيفو بيئة، وبالتالي تجنب التعديلات الفنية من العوامل التي قد تحدث في المختبر وذلك إلى تأثير أنواع الخلايا وعوامل أخرى لا توجد إلا في أجهزة سليمة. البروتوكول أداة مفيدة لتوليد التغييرات في وحدات تحكم المجال Dc وخلايا تي أن تعديل الاستجابات المناعية التكيفية، يحتمل أن تقدم نتائج هامة لفهم منشأ أو تطوير محصنة ضد العديد من الأمراض المرتبطة بها.

المقدمة

خلايا CD4 T ومستضد تقديم الخلايا (Apc) مثل وحدات تحكم المجال Dc بالوسطاء مطلوب من الحصانة لمسببات الأمراض الميكروبية1،2. في الأجهزة الطرفية اللمفاوية، يتم تنشيط خلايا CD4 T عند الاعتراف بمولدات المضادات المحددة المقدمة من ناقلات الجنود المدرعة3،،من45. تنشيط خلايا CD4 تي تتكاثر وتفرق في خلايا Th المستجيب محددة مميزة ضرورية لتطوير الاستجابة المناعية التكيفية الصحيح6،7. السيطرة على هذه العمليات أمر بالغ الأهمية لإنتاج دفاع كافية تكيفية التي تقتل مسببات المرض دون إنتاج الأنسجة الضارة الضرر8. خلايا Th تتحدد وفقا لتعبير أو إنتاج الجزيئات السطحية، وعوامل النسخ والمستجيب السيتوكينات، وأداء مهام أساسية ومحددة استجابة للعوامل الممرضة1. خلايا فرعية خلية Th1 التعبير عامل النسخ تي-الرهان و γ انترفيرون سيتوكين (IFNγ)، والمشاركة في المضيف في الدفاع ضد الجراثيم داخل الخلايا1. التحديد الكمي لتنشيط خلية CD4 T ساذجة وانتشارها، والتمايز Th1 وسيلة مفيدة لتقييم الخلايا T الدور الذي تضطلع به في استجابة مناعية.

هذا التحليل فيفو في تمكين البروتوكول من القدرة في المختبر-ولدت المستمدة من BM DCs تعدل التنشيط، وانتشار، والتمايز Th1 خلايا CD4 T ساذجة. البروتوكول يعمل أيضا لتقييم قدرة خلايا CD4 T السذاجة المنشط، والتي يسببها آخذة في الانتشار، و Th1 متباينة (الشكل 1). هذا البروتوكول تنوعاً تلتف التمكن على وجه التحديد التلاعب أو حدد الخلية درس السكان في صرفة في فيفو البروتوكولات. يمكن دراسة آثار الجزيئات المتنوعة والعلاجات على وحدات تحكم المجال Dc باستخدام BM من الفئران المعدلة وراثيا5 أو علاج أو التلاعب وراثيا الخلايا BM معزولة9. وبالمثل، يمكن استكشاف ردود الخلية T بالحصول على خلايا T لنقل التبني من مصادر مختلفة أو بعد عدة التلاعب3،،من810.

المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول ذات شقين. ويتم تحليل تنشيط خلية تي وانتشارها، والتمايز Th1 بنهج تدفق الخلوي؛ وهذا هو جنبا إلى جنب مع فيفو الدراسات، مما يمنع حدوث التغيرات التي قد تحدث في المختبر ، بما في ذلك أنواع الخلايا وعوامل أخرى لا توجد إلا في أجهزة سليمة11.

استخدام الأصباغ الحيوية تقنية تستخدم على نطاق واسع لتتبع انتشار الخلايا مع تجنب استعمال النشاط الإشعاعي. ويستند قياس الانتشار مع هذه الكواشف تمييع صبغ بعد انقسام الخلية. وعلاوة على ذلك، هذه الأصباغ يمكن الكشف عنها عند أطوال موجية متعددة ويتم تحليلها بسهولة بالتدفق الخلوي في تركيبة مع عدة علامات أو أجسام مضيئة. نسلط الضوء على فائدة هذا البروتوكول من خلال إظهار كيف يمكن تحليل تنشيط خلية تي وانتشارها، والتمايز Th1 بالتدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أقر إجراءات تجريبية مؤسسة المركز الوطني البحوث كارديوفاسكولاريس كارلوس الثالث (المحوسبة بطاقة الهوية الوطني) والقبلة اوتونوما دي مدريد وفقا للمبادئ التوجيهية للاسبانية والأوروبية. الفئران كانت تربيتها في ظروف (منتدى جنوب المحيط الهادئ) مجاناً الممرض محددة وقد euthanized باستنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2).

1-عزل خلايا نخاع العظام الماوس من تيبياس وقصبة

ملاحظة: الضغط الماوس كونجينيك C57BL/6 يحمل الكريات البيض التفاضلية علامة بتبرك، يعترف عموما بأنهم CD45.1 أو Ly5.1، في حين أن السلالات البرية من نوع C57BL تحمل اليل بتبركب ، المعروفة باسم CD45.2 أو Ly5.2. يمكن التمييز بين المتغيرات CD45.1 و CD45.2 بالتدفق الخلوي استخدام الأجسام المضادة. يمكن استخدام الفئران CD45.1 و CD45.2 و CD45.1/CD45.2 كمصادر للخلية أو كمتلقين لنقل التبني، والسماح بالبحث عن المفقودين السكان خلية متميزة بالتدفق الخلوي. استخدام تفضيلي العمر-ومطابقة الجنس الفئران الذكور أو الإناث دون 12 أسبوعا عمر.

  1. إعداد قصبة وتيبياس
    1. Euthanize الفئران باستخدام بروتوكول أقرته لجنة مؤسسات الرعاية الحيوانية.
    2. تطهير أطرافه هند بالرش على سطح الحيوان مع الإيثانول 70%.
    3. استخدام مقص معقم والملقط والمشارط. مع مشرط، جعل قطع في الجلد وإزالة الجلد من الجزء القاصي من الفأرة بما في ذلك الجلد الذي يغطي الأطراف الخلفية. قشر الجلد حول عضلة الساق السفلي وإزالة الجلد من الساقين بالكامل (الشكل 2 أ، 2).
    4. فصل في عضلة الفخذ من عظم الفخذ باستخدام مشرط. ديسارتيكولاتي الورك دون كسر رأس عظم الفخذ. إزالة العضلات الساق باستخدام مشرط (الشكل 2، 2D). فصل في عظم الفخذ من الساق دون كسر نهايات العظام.
    5. الحفاظ على العظام في طبق بتري يحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين 1% في المتوسط روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) 1640 x 1 المثلج.
  2. عزل خلية
    ملاحظة: يجب إجراء جميع الخطوات اللاحقة تحت غطاء ثقافة ومع مواد معقمة لتجنب التلوث.
    1. في طبق بتري معقم، بعناية قطع نهايات كل العظام مع مشرط القريبة والبعيدة.
    2. مسح العظام مرارا وتكرارا مع إجمالي حجم 10 مل من الحارة المتوسطة ربمي كاملة (ربمي + 10% FBS، 2 مم يدتا 1% البنسلين/ستربتوميسين، 20 مم هيبيس، 55 ميكرون 2-mercaptoethanol، بيروفات صوديوم 1 مم ومم 2 لتر-الجلوتامين). مسح العظام من كلا الطرفين باستخدام إبرة ز 25 يعلق على حقنه 1 مل.
    3. نقل افلواتي إلى أنبوب مخروطي 50 مل مزودة بعامل تصفية ويب نايلون ميكرومتر 70. عناية إزاحة التكتلات الحطام وخلية بالتحريك اللطيف وبيبيتينج.
    4. الطرد المركزي بتعليق خلية في 250 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت تحلل خلايا الدم الحمراء الباردة (0.15 م NH4Cl + 1 مم كهكو3 + 0.1 مم يدتا، تعديل درجة الحموضة إلى 7.2 مع 1 N HCl، 0.4 ميكرومتر العقيمة التي تمت تصفيتها، وتخزينها في 4 درجات مئوية). الحفاظ على الجليد لمدة 5 دقائق مع دليل تهتز.
    6. إضافة 10 مل من المخزن المؤقت الباردة (1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) + يدتا 2 مم + 2% ألبومين المصل البقري (BSA)) إلى إلغاء تنشيط وتغسل المخزن المؤقت تحلل خلايا الدم الحمراء.
    7. الطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    8. تغسل الخلايا مع 25 مل كاملة ربمي المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    9. ريسوسبيند الخلايا في 5 مل من إكمال ربمي المتوسطة. ميكس 50 ميليلتر من تعليق خلية 1:1 مع تريبان الأزرق. تحديد عدد الخلايا في دائرة عد تحت مجهر. حساب عدد الخلايا باستخدام الصيغة: خلايا/مل = [(الخلية الملطخة بغير حساب/4) × 2 × 10,000]12.
      ملاحظة: هذا الأسلوب غلة 40 × 106 إلى 60 × 106 العظام خلايا النخاع الواحدة 8 مصابة بالماوس C57BL/6 الأسبوع عمره 12.
    10. الطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.

2-DC التمايز ونضوج وتحميل مستضد

  1. خلية BM الحصاد
    1. بذور ثقافة كاملة على ألواح السطح 6-جيدا جداً منخفضة مرفق في 106 خلايا كل مل متوسطة، عادة في 5 مل كل بئر. سيتم إرفاق الضامة المتباينة للثقافة-اللوحات. بعد ح 12، نقل المادة طافية، الذي يتضمن أساسا وحيدات، لتنظيف لوحات 6-جيدا، وتجاهل لوحات 6-بئر قديمة مع الضامة التقيد بها.
    2. تعزيز التمايز الخلية، ثقافة الخلايا غير ملتصقة على 5 × 105 خلايا كل مل في عادة 5 مل في بئر المتوسطة ربمي كاملة تحتوي على 20 نانوغرام/مليلتر تجارياً حصلت GM-CSF مورين المؤتلف في غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2) 37 درجة مئوية و 5% و نلاحظ يوميا.
    3. وتدور أسفل كل 3 أيام، تدور أسفل الخلايا مع وقف التنفيذ، وجمع الخلايا ملتصقة مع 5 مم يدتا في برنامج تلفزيوني. والجمع بين وريسوسبيند في 5 × 105 خلايا/مل في المتوسط الطازجة التي تحتوي على 20 نانوغرام/مليلتر جمهورية مقدونيا-GM-CSF.
    4. اليوم 8، جمع ملتصقة وفصل الخلايا المذكورة أعلاه وريسوسبيند في 5 × 105 خلايا/مل في المتوسط تحتوي على 20 نانوغرام/مليلتر GM-CSF و 20 نانوغرام/مليلتر lipopolysaccharide (LPS) ح 24 في تعامل من زراعة الأنسجة غير معقمة بيتري طبق، للحث على ارتفاع MHC-ثانيا ، التعبير CD80 و CD86.
    5. التفريق بين العاصمة الاختيار بالتدفق الخلوي كما هو مبين في الخطوة 2، 2.
  2. تدفق التمايز الخلوي وتحليل النضوج.
    1. الطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين.
    2. مستقبلات Fc كتلة التي تفرخ بيليه حراكه الخلية في الماوس Fc مستقبلات مانع (تنقية المضادة للماوس جسم2b "مفتش" CD16/CD32) لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    3. الطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. لكل التحقيقات، ريسوسبيند الخلايا 250,000 في 300 ميليلتر من التدفق الخلوي العازلة (1 × يدتا مم 2 + برنامج تلفزيوني + 2% جيش صرب البوسنة) في 4 درجات مئوية.
    5. نقل 30 ميليلتر من حل الخلية الواحدة وكذلك إلى 96-جيدا-طبق.
    6. الطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    7. تجاهل المادة طافية وإضافة 30 ميليلتر المحتوية على جسم المخزن المؤقت لكل جيدا بعد مؤشرات الشركة المصنعة. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: عادة ما تستخدم علامات لوحدات تحكم المجال Dc ووحيدات والضامة هي CD11b، CD64، CD115، CD11c، مهسيي، CD80، و CD86 (الشكل 3).
    8. الطرد المركزي في العينات من 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وريسوسبيند في 200 ميليلتر كل من تدفق الباردة الخلوي المخزن المؤقت الذي يحتوي على علامة لاستبعاد الخلايا الميتة (يوديد propidiumمثلاً، أو 4 أو 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) أو صبغ أمين المتفاعلة جيدا ) في تركيز الموصى بها الشركة المصنعة13.
    9. مراقبة تمايز الخلية بنقل العينات إلى أنابيب التدفق الخلوي وإجراء تحليل التدفق الخلوي باستثناء الخلايا الميتة في الأيام 0, 3 و 6 و 9.
  3. تحميل مستضد DC.
    1. في يوم 8، الطرد المركزي العينات من 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند الكريات في 200 ميليلتر المتوسطة (ربمي + 10% FBS دون المضادات الحيوية). كرر هذه الخطوة مرتين.
    2. احتضان وحدات تحكم المجال Dc مع 10 ميكروغرام/مل أوفاب (323-339؛ إيسقافهاهاينيجر) الواحدة 1 × 107 وحدات تحكم المجال Dc في 1 مل متوسطة (رمبي + 1% FBS) في أنبوب بلاستيكي لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية. استخدام وحدات تحكم المجال Dc غير محملة أوفاب كشرط من شروط مراقبة سلبية.
    3. الطرد المركزي في العينات من 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند الكريات في 200 ميليلتر الكامل ربمي المتوسطة. كرر هذه الخطوة مرتين.
    4. الطرد المركزي في العينات من 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند الكريات في 200 ميليلتر المتوسطة (ربمي + 10% FBS) في 2 × 106 خلايا/مل.

3-عزل الخلايا التائية CD4 ساذجة من الفئران أوتيي

ملاحظة: هذا الأسلوب غلة حوالي 100 × 106 سبلينوسيتيس كل 8 مصابة بالماوس C57BL/6 الأسبوع عمره 12. يمكن استخدام كل من الذكور والإناث. خلايا CD4 T يمكن أن تكون معزولة عن الطحال أو الغدد الليمفاوية؛ خلايا CD4 T تمثل حوالي 25% و 50% من الخلايا في هذه الأجهزة، على التوالي. نفذ الخطوات التالية في ظروف معقمة.

  1. عزل الليمفاوية الاربية وابطي وعضدي، وسرطان عنق الرحم والمساريقي العلوي والطحال من الفئران المعدلة وراثيا أوتي (الشكل 4) ونقلها إلى بلاستيك طبق بتري يحتوي على 10 مل من إكمال ربمي المتوسطة.
  2. شطف مصفاة الخلية مع 2 مل من إكمال ربمي المتوسطة وإزالته من أنبوب 50 مل. نقل الغدد الليمفاوية والطحال إلى مصفاة خلية 70 ميكرومتر توضع في أنبوب 50 مل. مجانسة استخدام المحاقن المكبس (الشكل 5)، وإضافة متوسطة تصل إلى 15 مل.
  3. الطرد المركزي في العينات من 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند بيليه في 15 مل من إكمال ربمي المتوسطة. كرر هذه الخطوة مرتين.
  4. تعليق خلية الطحال، ريسوسبيند بيليه الخلية وخلايا الدم الحمراء كما هو مبين في الخطوة 1.2.5.
  5. الطرد المركزي من تعليق خلية في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  6. تغسل الخلايا مع 25 مل كاملة ربمي المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
  7. ريسوسبيند الخلايا في 5 مل متوسطة. ميكس 50 ميليلتر من تعليق خلية 1:1 مع تريبان الأزرق. تحديد عدد الخلايا باستخدام دائرة عد تحت مجهر. حساب عدد الخلايا باستخدام الصيغة: خلايا/مل = [(الخلية الملطخة بغير حساب/4) × 2 × 10,000]12.
  8. كرر الخطوة 2.2.2.
  9. بناء على تعليمات الشركة المصنعة، احتضان الخلايا مع تخفيف 1:800 الأجسام المضادة بيوتينيلاتيد إلى CD8α، IgM، B220، CD19، مهسيي (I-Ab)، CD11b، CD11c، CD44، CD25 و DX5 لمدة 30 دقيقة على الجليد للانتقاء السلبي في وقت لاحق من خلايا CD4 T.
  10. اتباع إرشادات الشركة المصنعة، واستنادا إلى العدد الخلايا والقدرة الخرز، حساب المبلغ المطلوب من المغلفة ستريبتافيدين ميكروبيدس المغناطيسي وعزل الخلايا CD4 T باستخدام فاصل خلية مغناطيسية والمناسبة الفصل بين الأعمدة.
  11. ريسوسبيند الخلايا في 5 مل من إكمال ربمي المتوسطة وإبقائهم على الجليد بينما عد الخلايا الحية كما هو موضح في الخطوة 3، 7.
  12. استخراج 2 × 105 خلايا والتحقق من نقاء الخلايا المجمعة باستخدام مكافحة CD8 CD4 و B220 و CD3 الأجسام المضادة الفلورسنت في سيتوميتير تدفق استخدام تخفيف جسم توصي الشركة المصنعة.
  13. لوصمة عار خلايا CD4/أوتيي "تي" السذاجة معزولة، ريسوسبيند 106 خلايا في المخزن المؤقت 500 ميليلتر (1 × يدتا مم 2 + برنامج تلفزيوني + 2% جيش صرب البوسنة). إعداد 500 ميليلتر المخزن المؤقت (1 × يدتا مم 2 + برنامج تلفزيوني + 2% جيش صرب البوسنة) التي تحتوي على مضاعفة تركيز الخلية الحيوية الراسم صبغ النهائي الموصى بها من الشركة المصنعة. مزيج من كلا الحلول عن طريق إضافة الحل الراسم الخلية ببطء إلى تعليق خلية. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  14. تغسل الخلايا مع 5 مل من إكمال ربمي المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من إكمال المتوسطة ربمي في 1 × 107خلايا/مل.

4. في فيفو التنشيط وانتشارها والمقايسة التمايز Th1

ملاحظة: الخلية الحيوية الراسم صبغ كاربوكسيفلوريسسين اسيتات سوكسينيميديل إستر (CFSE) وأخرى سوكسينيميديل المستندة إلى إستر الأصباغ، ونحن متحمسون وتنبعث منها الأسفار عند أطوال موجية مختلفة، تستخدم على نطاق واسع لتقييم انتشار اللمفاويات بالتدفق الخلوي بسبب كثافة الفلورية العالية، منذ فترة طويلة-حياتهم وتقلب منخفض، وسمية منخفضة14.

  1. نقل أدوبتيفيلي عن طريق الوريد (رابعا) 1 × 106 خلية حيوية حية الراسم السذاجة الملطخة بصبغ "تي" CD4/أوتي الخلايا في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني للماوس. يمكن نقل الخلايا التائية المسماة أدوبتيفيلي بذيل الوريد أو حقن الرجعية-المداري15؛ وفي كلتا الحالتين، سوف المنزل الخلايا للأجهزة اللمفاوية (الشكل 6A).
  2. تحدي الفئران المستفيدة يوم واحد بعد ذلك بنقل أدوبتيفيلي 100,000 نضجت لبس أوفاب-تحميل وحدات تحكم المجال Dc بالحقن تحت الجلد (s.i.) في فوتبادس (الشكل 6B).
  3. حصاد المابضيه الليمفاوية من الفئران المستفيدة ومعالجتها حتى الحصول على تعليق خلية مفردة اتباع نفس الخطوات كما سبق ذكره في 3.1 و 3.2. هذا التحصين بعد يوم 2 لقياس تنشيط خلية CD4/أوتي T، وفي اليوم الخامس لقياس الانتشار بالإضافة إلى التمايز Th1.
  4. لتحليل تنشيط الخلية تي في اليوم 2، وصمة عار الخلايا مع نيون أجسام مضادة ضد خلايا CD4 و CD69 و CD25 (اختيارياً CD45.1 و CD45.2) وتحديد النسبة المئوية ل C69+CD25+ تي خلايا CD4 السكان. تحليل من خلال التدفق الخلوي (الشكل 7).
  5. للتحقق من انتشار الخلايا تي في اليوم 5، وصمة عار الخلايا باستخدام الأجسام المضادة الفلورسنت مناسب ضد خلايا CD4 واختيارياً CD45.1 و CD45.2. تحليل انحلال إشارة صبغ الراسم خلية حيوية في السكان CD4 بالتدفق الخلوي (الشكل 8). يمكن تحديد العديد من المعلمات في هذه الدراسات، مثل عدد الشعب الخلية التي مر بها الخلايا المسمى مع صبغ الراسم الخلية الحيوية، والنسبة المئوية لتقسيم الخلايا في كل ذروة الأسفار، والنسبة المئوية لتقسيم الخلايا في خلية الإجمالي السكان.
  6. لتحديد التمايز Th1 في اليوم الخامس، لوحة خلايا 400,000 كل من صفيحة 96-جيدا في 200 ميليلتر من المتوسطة ربمي كاملة تحتوي على 1 ميكرومتر إيونوميسين و 10 نانوغرام/مل phorbol 12 ميريستاتي 13 خلات (سلطة النقد الفلسطينية) ح 6 في 37 درجة مئوية في الحاضنة جيدا. من أجل ح 4 الماضي، إضافة 3-10 ميكروغرام/مل بريفالدين أ إلى منع إفراز سيتوكين إلى المتوسط.
  7. الطرد المركزي لوحات لمدة 5 دقائق في 250 x ز في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية بعكس السريع من لوحة 96-جيدا.
  8. كرر الخطوة 2.2.2.
  9. وصمة عار أغشية الخلية بحضانة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية في 30 ميليلتر من الأجسام المضادة المخزن المؤقت (1 × يدتا مم 2 + برنامج تلفزيوني + 2% جيش صرب البوسنة) التي تحتوي على خلايا CD4 واختيارياً ل CD45.1 و CD45.2 في تخفيف الموصى بها من الشركة المصنعة. غسل الخلايا بإضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت (1 × يدتا مم 2 + برنامج تلفزيوني + 2% جيش صرب البوسنة) والطرد المركزي لوحات لمدة 5 دقائق في 250 x ز في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية.
  10. إصلاح الخلايا بإضافة 100 ميليلتر من السكروز paraformaldehyde/1% 2% لمدة 20 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي الرايت اللوحات لمدة 5 دقائق في 1,000 س ز و 4 درجة مئوية. تجاهل المادة طافية.
  11. بيرميبيليزي الخلايا بإضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن داخل الخلايا (1 × برنامج تلفزيوني + 0.1% جيش صرب البوسنة، 0.01 م هيبيس، صابونين 0.3 في المائة)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  12. إضافة 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1,000 س ز في الرايت تجاهل المادة طافية.
  13. وصمة عار السيتوكينات داخل الخلايا بإضافة 30 ميليلتر من مترافق fluorophore المضادة للأجسام المضادة IFNγ في المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + صابونين 0.1%)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
  14. غسل الخلايا بإضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + صابونين 0.1%). الطرد المركزي لوحات لمدة 5 دقائق في 1,000 س ز على RT وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرتين.
  15. تحليل السكان خلية بالتدفق الخلوي (الشكل 8).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكل 1 الخطوات الموصوفة في هذا البروتوكول. ويبين الشكل 2 بالعزلة وثقافة الخلايا BM الماوس. إضافة GM-CSF ولبس لهذه الثقافات يتيح توليد في المختبر ونضوج DCs. الشكل 3 يوضح تحليل التدفق الخلوي للمفاضلة ونضوج DCs المستمدة من BM GM-CSF تحميل وحدات تحكم المجال Dc-أوفاب التي تم الحصول عليها ويتم نقل الخلية الحيوية المعزولة تتبع الملطخة بصبغ خلايا CD4/أوتي "تي" أدوبتيفيلي للفئران. ويبين

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يسمح هذا البروتوكول لوصف قدرة المستمدة من BM DCs تعدل التنشيط وانتشارها، والتفريق بين خلايا CD4 T ساذجة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدامه لتقييم قابلية خلايا CD4 T للتحوير بوحدات تحكم المجال Dc المستمدة من بي أم. مع أحكام هذا البروتوكول، التغييرات في هذه الأحداث يمكن أن يقاس في فيفو.

اعتماداً على فرضية قيد التحقيق، ويمكن استخدام العديد من تركيبات من خلايا تي ووحدات تحكم المجال Dc. على سبيل المثال، يمكن تحليل إحدى عواقب يطرق في أو انقطاع جينات محددة أو كفاءة حافزا محددة لتنشيط خلايا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

شكر وتقدير

ونحن نشكر الدكتور سيمون بارتليت لتحرير اللغة الإنجليزية. كان يؤيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من معهد دي السعود كارلوس الثالث (إيسسيي) (PI14/00526؛ PI17/01395؛ CP11/00145؛ CPII16/00022)، ميغيل سيرفيت البرنامج ومؤسسة رامون أريسيس؛ بتمويل مشترك من فوندو Europeo للتنمية الإقليمية (فدر). المحوسبة بطاقة الهوية الوطني معتمد من قبل وزارة الاقتصاد والصناعة و "القدرة التنافسية" (ميتش) ومؤسسة برو المحوسبة بطاقة الهوية الوطني وسيفيرو أوتشوا مركز التميز (SEV-2015-0505). RTF هو تأسست على يد مؤسسة رامون أريسيس والمحوسبة بطاقة الهوية الوطني، فزج من إيسسيي، بهف بمعهد دي JMG-ز البرنامج سيرفيت ميغيل إيسسيي و imas12 وبحوث سانيتاريا مستشفى 12 دي تشرين الأول/أكتوبر (imas12).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كيماوياتالإيثانول20،824،3655
لتر أدوات العلوم الدقيقة (FST)14001-12
الملقط(FST)11000-13
بالملقطالدقيق (FST)11253-20
للمشرط(FST)10020-00صندوق من 100 شفرة
مصل الأبقار الجنينيSIGMAF7524
البنسلين / الستربتومايسينLONZADE17-602E
معهد روزويل بارك التذكاري المتوسط (RPMI)GIBCO21875-034
أطباق بتري معقمةفالكون353003
إبرة قياس 25BD Microlance 3300600
1 مل حقنةNovicoN15663
15 مل أنابيب مخروطية Falcon352096
50 مل أنابيب مخروطيةFalcon352098
70 & mu ؛ مرشح ويب من النايلونب BD Falcon352350
عازلة تحلل الدم الأحمرSIGMAR7757100 مل
EDTASIGMAED2SS-250
مصل الأبقار الألبومينSIGMAA7906100 جرام
تريبان الأزرقSIGMA302643-25G
الثقافةFalcon353003
4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينات إيثان سلفونيك حمض (HEPES)كامبريكسBE17-737E
بيتا ميركابتو إيثانولميرك8-05740-0250
بيروفات الصوديومLONZABE13-115E
L-glutamineLONZABE17-605E
مؤتلف الفئران المحبب البلاعم عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF)Prepotech315-03
عديد السكاريد الدهني (LPS)SIGMA-ALDRICHL2018
96-well-plateCostar3799
v450 الأجسام المضادة CD11b المضادة للفأرBD Biosciences560455
PE المضادة للفأر CD64 الجسم المضادBioLegend139303
PE المضاد للفأر CD115 BioLegend135505
FITC المضاد للفأر الأجسام المضادة CD11cBioLegend117305
FITC المضادة للفأر MHCII الأجسام المضادةBioLegend125507
APC المضادة للفأر CD86 الجسم المضادBioLegend105011
APC المضاد للفأر CD80 BioLegend104713
أنابيب قياس التدفق الخلويZelian300800-1PS 12X75 5 مل
OTII ببتيدالبيضاويInvivoGen323-339
الأجسام المضادة للفأر CD8 & ألفا المضادةTonbo Biosciences30-0081-U500
الأجسام المضادة IgM المضادة للفأرBioLegendBioLegend 406503
المضادة للفأر البيوتينيل B220 الجسم المضادTonbo Biosciences30-0452-U500
المضاد للفأر المضاد للبيوتينيل CD19Tonbo Biosciences30-0193-U500
المضاد المضاد MHCII (I-Ab) المضاد للفأرBioLegend115302
الأجسام المضادة للفئران المضادة للبيوتينيل CD11bTonbo Biosciences30-0112-U500
المضادة للفأر المضادة للبيوتينيل CD11cBioLegend117303
البيوتينيل المضاد للفأر BioLegend الأجسام المضادة CD25Tonbo Biosciences30-0251-U100
الأجسام المضادة للفأر المضادة للبيوتينيل DX5BioLegend108903
الميكروبيدات المغناطيسية المطلية بالستربتافيدينMACS Miltenyi Biotec130-048-101
الخلايا المغناطيسيةMACS Miltenyi Biotec130-090-976QuadroMACS فاصل
أعمدةالفصل MACS Miltenyi Biotec130-042-401
PE المضاد للفأر CD4 الأجسام المضادةBioLegend100408
APC المضادة للفأر CD3 الأجسام المضادةBioLegend100235
FITC المضادة للفأر CD8 الجسم المضادTonbo Biosciences35-0081-U025
Cell VioletTracer ThermofisherC34557
APC المضادة للفأر CD25 الجسم المضادTonbo Biosciences20-0251-U100
Alexa647 الأجسام المضادة للفأر CD69BioLegend104518
PerCPCY5.5 المضادة للفأر CD45.1 الجسم المضادTonbo Biosciences65-0453
APC المضاد للفأر CD45.1 الجسم المضادTonbo Biosciences20-0453
PECY7 المضاد للفأر CD45.1 الجسم المضادTonbo Biosciences60-0453
FITC المضاد للفأر CD45.2 الأجسام المضادةTonbo Biosciences35-0454
IonomycinSIGMA-ALDRICHI0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA)SIGMAP8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD555029
ParaformaldehydeMillipore8-18715-02100
النفاذية داخل الخلاياeBioscience00-8333
APC المضاد للفأر IFNg الجسم المضادTonbo Biosciences20-7311-U100
Fc-block (مضاد للفأر CD16 / CD32) TonboBiosciences70-0161-U100
B6. SJL CD45.1 الفئرانمختبر جاكسون002014
BD LSRFortessa & trade; محلل الخليةBD Biosciences649225
DAPI SolutionThermofisher62248
VWR أدوات العلوم الدقيقةأدوات العلوم الدقيقةأدوات العلوم الدقيقة لوحات الجسم المضادة للفئران BioLegend BioLegend 103003 فاصل

المراجع

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
  2. Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
  3. Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37(2014).
  4. Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
  5. Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
  6. Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
  7. Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
  8. Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9(2018).
  9. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  10. Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591(2017).
  11. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627(2014).
  12. Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976(2016).
  13. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  14. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  15. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  16. Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  17. Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنشيط خلايا T CD4 الساذجةنقل الخلايا التبنيتحليل قياس التدفق الخلويعزل نخاع العظمحصاد العقد اللمفاويةتكاثر خلايا Tصبغ السيتوكينات داخل الخلايافئران OTII المعدلة وراثياً
نموذج ماوس في فيفو إلى تدبير السذاجة CD4 تي خلية التنشيط وانتشارها والتمايز Th1 الناجمة عن الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.