نقدم هنا، على بروتوكول لتحديد في فيفو السذاجة CD4 T الخلية (خلية T) تنشيط وانتشار، والتمايز Th1 الناجمة عن نخاع العظام GM-CSF (بي أم)-اشتقاق الخلايا الجذعية (DCs). وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول العزلة BM وخلايا T، وجيل العاصمة ونقل العاصمة وخلايا T التبني.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نموذج ماوس في فيفو إلى تدبير السذاجة CD4 تي خلية التنشيط وانتشارها والتمايز Th1 الناجمة عن الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظام
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التحديد الكمي لتنشيط خلية CD4 T ساذجة والانتشار والتمايز إلى مساعد تي 1 (Th1) الخلايا طريقة مفيدة لتقييم الدور الذي تلعبه الخلايا T في استجابة مناعية. ويصف هذا البروتوكول في المختبر التفريق بين فروعه نخاع العظم (بي أم) للحصول على المحببات بلعم التي حفز مستعمرة الخلايا الجذعية المشتقة عامل (GM-CSF) (DCs). كما يصف البروتوكول نقل التبني ovalbumin الببتيد (أوفاب)-تحميل DCs مشتقة من GM-CSF وخلايا CD4 T ساذجة من الفئران المعدلة وراثيا أوتيي من أجل تحليل التنشيط في فيفو ، والانتشار، والتمايز Th1 من نقل خلايا CD4 تي. هذا البروتوكول تلتف الحد من محض في فيفو أساليب فرضها عدم القدرة على التحديد التلاعب أو حدد الخلية درس السكان. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا البروتوكول دراسات في فيفو بيئة، وبالتالي تجنب التعديلات الفنية من العوامل التي قد تحدث في المختبر وذلك إلى تأثير أنواع الخلايا وعوامل أخرى لا توجد إلا في أجهزة سليمة. البروتوكول أداة مفيدة لتوليد التغييرات في وحدات تحكم المجال Dc وخلايا تي أن تعديل الاستجابات المناعية التكيفية، يحتمل أن تقدم نتائج هامة لفهم منشأ أو تطوير محصنة ضد العديد من الأمراض المرتبطة بها.
المقدمة
خلايا CD4 T ومستضد تقديم الخلايا (Apc) مثل وحدات تحكم المجال Dc بالوسطاء مطلوب من الحصانة لمسببات الأمراض الميكروبية1،2. في الأجهزة الطرفية اللمفاوية، يتم تنشيط خلايا CD4 T عند الاعتراف بمولدات المضادات المحددة المقدمة من ناقلات الجنود المدرعة3،،من45. تنشيط خلايا CD4 تي تتكاثر وتفرق في خلايا Th المستجيب محددة مميزة ضرورية لتطوير الاستجابة المناعية التكيفية الصحيح6،7. السيطرة على هذه العمليات أمر بالغ الأهمية لإنتاج دفاع كافية تكيفية التي تقتل مسببات المرض دون ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أقر إجراءات تجريبية مؤسسة المركز الوطني البحوث كارديوفاسكولاريس كارلوس الثالث (المحوسبة بطاقة الهوية الوطني) والقبلة اوتونوما دي مدريد وفقا للمبادئ التوجيهية للاسبانية والأوروبية. الفئران كانت تربيتها في ظروف (منتدى جنوب المحيط الهادئ) مجاناً الممرض محددة وقد euthanized باستنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2).
1-عزل خلايا نخاع العظام الماوس من تيبياس وقصبة
ملاحظة: الضغط الماوس كونجينيك C57BL/6 يحمل الكريات البيض التفاضلية علامة بتبرك، يعترف عموما بأنهم CD45.1 أو Ly5.1، في حين أن السلالات البرية من نوع C57BL تحمل اليل بتبركب ، المعروفة باسم CD45.2 أو Ly5.2. يمكن ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1 الخطوات الموصوفة في هذا البروتوكول. ويبين الشكل 2 بالعزلة وثقافة الخلايا BM الماوس. إضافة GM-CSF ولبس لهذه الثقافات يتيح توليد في المختبر ونضوج DCs. الشكل 3 يوضح تحليل التدفق الخلوي للمفاضلة ونضوج DCs المستمدة من BM GM-CSF تحميل وحدات تحكم المجال Dc-أوفاب التي تم الحصول عليها ويتم نقل الخلية الحيوية المعزولة تتبع الملطخة بصبغ خلايا CD4/أوتي "تي" أدوبتيفيلي للفئران. ويبين
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يسمح هذا البروتوكول لوصف قدرة المستمدة من BM DCs تعدل التنشيط وانتشارها، والتفريق بين خلايا CD4 T ساذجة. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدامه لتقييم قابلية خلايا CD4 T للتحوير بوحدات تحكم المجال Dc المستمدة من بي أم. مع أحكام هذا البروتوكول، التغييرات في هذه الأحداث يمكن أن يقاس في فيفو.
اعتماداً على فرضية قيد التحقيق، ويمكن استخدام العديد من تركيبات من خلايا تي ووحدات تحكم المجال Dc. على سبيل المثال، يمكن تحليل إحدى عواقب يطرق في أو انقطاع جينات محددة أو كفاءة حافزا محددة لتنشيط خلايا .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
شكر وتقدير
ونحن نشكر الدكتور سيمون بارتليت لتحرير اللغة الإنجليزية. كان يؤيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من معهد دي السعود كارلوس الثالث (إيسسيي) (PI14/00526؛ PI17/01395؛ CP11/00145؛ CPII16/00022)، ميغيل سيرفيت البرنامج ومؤسسة رامون أريسيس؛ بتمويل مشترك من فوندو Europeo للتنمية الإقليمية (فدر). المحوسبة بطاقة الهوية الوطني معتمد من قبل وزارة الاقتصاد والصناعة و "القدرة التنافسية" (ميتش) ومؤسسة برو المحوسبة بطاقة الهوية الوطني وسيفيرو أوتشوا مركز التميز (SEV-2015-0505). RTF هو تأسست على يد مؤسسة رامون أريسيس والمحوسبة بطاقة الهوية الوطني، فزج من إيسسيي، بهف بمعهد دي JMG-ز البرنامج سيرفيت ميغيل إيسسيي و imas12 وبحوث سانيتاريا مستشفى 12 دي تشرين الأول/أكتوبر (imas12).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كيماويات | الإيثانول | 20،824،365 | 5 |
| لتر أدوات العلوم الدقيقة ( | FST) | 14001-12 | |
| الملقط | (FST) | 11000-13 | |
| بالملقط | الدقيق (FST) | 11253-20 | |
| للمشرط | (FST) | 10020-00 | صندوق من 100 شفرة |
| مصل الأبقار الجنيني | SIGMA | F7524 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | LONZA | DE17-602E | |
| معهد روزويل بارك التذكاري المتوسط (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| أطباق بتري معقمة | فالكون | 353003 | |
| إبرة قياس 25 | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 مل حقنة | Novico | N15663 | |
| 15 مل أنابيب مخروطية Falcon | 352096 | ||
| 50 مل أنابيب مخروطية | Falcon | 352098 | |
| 70 & mu ؛ مرشح ويب من النايلون | ب BD Falcon | 352350 | |
| عازلة تحلل الدم الأحمر | SIGMA | R7757 | 100 مل |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| مصل الأبقار الألبومين | SIGMA | A7906 | 100 جرام |
| تريبان الأزرق | SIGMA | 302643-25G | |
| الثقافة | Falcon | 353003 | |
| 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينات إيثان سلفونيك حمض (HEPES) | كامبريكس | BE17-737E | |
| بيتا ميركابتو إيثانول | ميرك | 8-05740-0250 | |
| بيروفات الصوديوم | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| مؤتلف الفئران المحبب البلاعم عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| عديد السكاريد الدهني (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 الأجسام المضادة CD11b المضادة للفأر | BD Biosciences | 560455 | |
| PE المضادة للفأر CD64 الجسم المضاد | BioLegend | 139303 | |
| PE المضاد للفأر CD115 BioLegend | 135505 | ||
| FITC المضاد للفأر الأجسام المضادة CD11c | BioLegend | 117305 | |
| FITC المضادة للفأر MHCII الأجسام المضادة | BioLegend | 125507 | |
| APC المضادة للفأر CD86 الجسم المضاد | BioLegend | 105011 | |
| APC المضاد للفأر CD80 BioLegend | 104713 | ||
| أنابيب قياس التدفق الخلوي | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5 مل |
| OTII ببتيد | البيضاويInvivoGen | 323-339 | |
| الأجسام المضادة للفأر CD8 & ألفا المضادة | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| الأجسام المضادة IgM المضادة للفأر | BioLegend | BioLegend 406503 | |
| المضادة للفأر البيوتينيل B220 الجسم المضاد | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| المضاد للفأر المضاد للبيوتينيل CD19 | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| المضاد المضاد MHCII (I-Ab) المضاد للفأر | BioLegend | 115302 | |
| الأجسام المضادة للفئران المضادة للبيوتينيل CD11b | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| المضادة للفأر المضادة للبيوتينيل CD11c | BioLegend | 117303 | |
| البيوتينيل المضاد للفأر BioLegend الأجسام المضادة CD25 | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| الأجسام المضادة للفأر المضادة للبيوتينيل DX5 | BioLegend | 108903 | |
| الميكروبيدات المغناطيسية المطلية بالستربتافيدين | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| الخلايا المغناطيسية | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS فاصل |
| أعمدة | الفصل MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE المضاد للفأر CD4 الأجسام المضادة | BioLegend | 100408 | |
| APC المضادة للفأر CD3 الأجسام المضادة | BioLegend | 100235 | |
| FITC المضادة للفأر CD8 الجسم المضاد | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet | Tracer Thermofisher | C34557 | |
| APC المضادة للفأر CD25 الجسم المضاد | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 الأجسام المضادة للفأر CD69 | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 المضادة للفأر CD45.1 الجسم المضاد | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC المضاد للفأر CD45.1 الجسم المضاد | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 المضاد للفأر CD45.1 الجسم المضاد | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC المضاد للفأر CD45.2 الأجسام المضادة | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD | 555029 | ||
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| النفاذية داخل الخلايا | eBioscience | 00-8333 | |
| APC المضاد للفأر IFNg الجسم المضاد | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (مضاد للفأر CD16 / CD32) Tonbo | Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6. SJL CD45.1 الفئران | مختبر جاكسون | 002014 | |
| BD LSRFortessa & trade; محلل الخلية | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
المراجع
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lym....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
