والهدف من هذا البروتوكول هو تسهيل دراسة نمدا-مستقبلات (نمدار) على نطاق أوسع، والسماح بدراسة آثار مودولاتوري من الجزيئات الصغيرة وتطبيقاتها العلاجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مقايسة الفائق كالسيوم-التمويه لدراسة مستقبلات NMDA مع حساسية جليكاين/د-سيرين وغلوتامات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ن-الميثيل-د-اسبارتاتي مستقبلات (NMDA) (نمدار) تصنف مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك وأدوار حاسمة في التعلم والذاكرة. عطل نمدار، أعرب أما أكثر-أو وكيل-activity الناجم عن الطفرات، تغيير تعبير أو الاتجار أو التعريب، يمكن أن يسهم في العديد من الأمراض، وبخاصة في الجهاز العصبي المركزي. ولذلك، فهم البيولوجيا المستقبلات، فضلا عن تيسير اكتشاف المركبات والجزيئات الصغيرة حاسمة في الجهود المبذولة لمكافحة الأمراض العصبية. النهج الحالي لدراسة المستقبلات لها حدود بما في ذلك انخفاض الإنتاجية والتكلفة العالية وعدم القدرة على دراسة قدراته الفنية نظراً لوجود الضرورة محصرات قنوات للحيلولة دون وساطة نمدار اكسسيتوتوكسيسيتي. بالإضافة إلى ذلك، نظم التحليل القائمة حساسة للتحفيز قبل غلوتامات فقط وتفتقر إلى الحساسية للتحفيز التي جليكاين، يجند المشارك الأخرى نمدار. نقدم هنا، التحليل القائم على اللوحة الأولى مع السلطة الفائق للدراسة مستقبلات NMDA مع حساسية لكلا يغاندس المشارك وغلوتامات د-سيرين/جليكاين. هذا النهج يتيح دراسة التراكيب وحدة فرعية نمدار مختلفة ويسمح الدراسات الفنية للمستقبلات في أوضاع جليكاين-و/أو الحساسة غلوتامات. بالإضافة إلى ذلك، الطريقة لا تتطلب وجود مثبطات خلال القياسات. ويمكن الكشف عن آثار المغيرون allosteric الإيجابية والسلبية مع هذا التحليل والأدوية المعروفة من نمدار تكررت في نظامنا. هذا الأسلوب يتغلب على أوجه قصور الأساليب القائمة، وفعالة من حيث التكلفة. ونحن نعتقد أن هذه التقنية الجديدة سوف تعجل باكتشاف العلاجات للأمراض بوساطة نمدار.
المقدمة
مع التقدم الحالي في الطب، ازداد متوسط العمر المتوقع إلى حد كبير؛ ومع ذلك، قد ذلك انتشار الأمراض المرتبطة بالسن. أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) مثل الفصام والتصلب العضلي الجانبي (المرض)، ومرض الزهايمر ومرض باركنسون، بين أمور أخرى، ليست استثناء، وقد كان المتوقع أن تزيد على مدى العقد القادم1، 2 , 3-خلل مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك المعروف باسم N-الميثيل-د-اسبارتاتي مستقبلات (نمدار) ارتبط بمرض الزهايمر والفصام وإصابات الدماغ الرضية، والسكتة الدماغية، والسكري والزرق بين أمور أخرى، مما يستلزم بحاجة إلى دراسة هذه الأحياء لتطوير علاجات فعالة، والمرض--تعديل4
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد الخلايا
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول، بما في ذلك توليد البيانات، الخلايا HEK293 ترانسدوسيد مع باكولوفيروس ترميز الخلايا NR1 و NR2A.
- البذور عدد مناسب من الخلايا HEK293 وإضافة NR1 و/أو NR2A الفيروس بتركيزات النهائية المناسبة (1.00 ميليلتر في كل). لوحة 384، حسنا، استخدم 10,000 الخلايا/البئر بحجم نهائي في 30 ميليلتر.
- وبدلاً من ذلك، بذور الخلايا HEK293-NR1-NR2A في الخلية المناسبة عدد وحجم (للوحة 384، حسنا، استخدام 10,000 الخلايا/البئر بحجم نهائي في 30 ميليلتر). إضافة التتراسيكلين بتركيز 2 ميكروغرام/مل للحث على التعبير NR2A وإضافة حماية مجمع (100 ميكرومتر MDL105، 5 ميكرومتر CGP07066724أو 519).<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قبل اختبار آثار الجزيئات الصغيرة، واحد يجب أن تحدد مستويات التعبير الأمثل نمدارس، فضلا عن تركيزات يجند الأمثل. كما هو موضح، HEK293 كانت تبذر الخلايا في الخلايا 10,000 كل بئر في صفيحة 384، حسنا، حضور 5 ميكرومتر CGP060667، ثم ترانسدوسيد بمقادير متفاوتة من NR1 و NR2A الفيروسات. تم قياس الجريان بعد الحضانة بين عشية وضحاها، والتي يسببها يجند الكالسيوم (الشكل 1). وتكشف نتائج هذه التجارب أفضل كمية ونسبة من الفيروسات باستخدام لكل وحدة فرعية (الشك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعتمد نجاح هذا التحليل إلى حد كبير على صحة الخلايا HEK المستخدمة. الخلايا تشهد نمواً متسارعا وينبغي أن تستخدم بعدد مرور منخفضة. هذا التحليل ينطوي على العديد من عمليات النقل وإضافات حلول، وذلك باستخدام الحذر سوف ضمان دقة أعلى في نتائجه. ينبغي أن تكون تركيزات مركبات وجميع الكواشف الأخرى أيضا تدقيق للتقليل من الأخطاء. عند استبدال الوسائط المحمولة مع المخزن المؤقت المقايسة لتحليل تدفق الكالسيوم، اللوحة يجب أن يميل بلطف حيث أن عدم فصل الخلايا. وأخيراً، استخدام ألواح بولي-د-يسين المغلفة في هذا البروتوكول يزيد ارتباط الخلايا با.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد المؤلفون لا تضارب في المصالح وليس للكشف عن.
شكر وتقدير
الكتاب يود أن يشكر مكتب البريد البكالوريا علماء البرنامج ومعاهد نوفارتيس "البحوث الطبية الحيوية" ككل من أجل تمويل هذه الدراسة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| خط خلية مستقبلات NMDA البشري (NR1 / NR2A) | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac ناقلات التعبير المزدوج | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom | Microplate Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR الكالسيوم 6-QF مجموعة الفحص | الجزيئية الأجهزة | R8192 | |
| جلايسين | سيجما ألدريتش | G7126 | |
| الغلوتامات | سيجما ألدريتش | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701،324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| كلوريد المغنيسيوم | سيجما ألدريتش | 63069 | |
| كلوريد الكالسيوم | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM / F-12 ، وسائط GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105،519 | NIBR | تصنيعه في المنزل | |
| NVP-AAM077 | NIBR | يتم تصنيعه في المنزل | |
| CGP070667 | NIBR | تصنيعه في المنزل |
المراجع
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
