طريقة سيفينج فعالة لعزل Glomeruli سليمة من الفئران الكبار الكلي

الكبيبة درجة عالية من التخصص خصل من الشعيرات الدموية المسؤولة عن الترشيح لتعميم البلازما. وهو يشكل بداية كليون، وهي الوحدة الوظيفية الأساسية للكلى. يتم تعريف الدالة الكبيبي بطانة شعرية فريد فينيستراتيد وشق الحجاب الحاجز من بودوسيتيس وغشاء الفاصلة. وتشكل هذه الطبقات حاجز سيميبيرميابل للسماح لإفراز المواد انتقائية في فيلتراتي. الماء والايونات والجزيئات الصغيرة الأخرى عموما تمر عبر، بينما تبقى الجزيئات الكبيرة في البلازما. بودوسيتيس هي الخلايا الظهارية المتخصصة أن تنتشر على الغشاء السفلي، المحيطة بالشعيرات الدموية مع إسقاطات هيولى المعروفة باسم عمليات سيرا على الأقدام. عمليات بودوسيتيس المتاخمة إينتيرديجيتاتي القدم وعبرت بشق أغشية تتكون من البروتينات مثل نيفرين، بودسين، فكادهيرين وزوى--1¹. في المقطع العرضي، قدم هذه العمليات بالتساوي مرتبة على الغشاء السفلي. في glomeruli المريضة، تصبح عمليات القدم صارخ غير طبيعي أو "ديانتهم"، مما أدى إلى تسرب غير طبيعي من محتويات البلازما إلى فيلتراتي. على هذا النحو، والضرر الكبيبي عموما تتميز بوجود كميات كبيرة عادية من البروتين (بروتينيةمثلاً ) و/أو خلايا الدم الحمراء في البول (بيله دمويةمثلاً ). وبالإضافة إلى ذلك، تفقد الجرحى بودوسيتيس التعبير نيفرين، فضلا عن أن منظم Wilms الورم 1 (WT1)، بروتين رئيسية مسؤولة عن الحفاظ على التمايز^2،3. جلوميرولي هي هدفا أساسيا للضرر في حدوث السكري والأخرى جلوميرولونيفريتيديس مثل المرض سوى تغيير طفيف، وحدوث الغشائي، والتنسيق القطاعي glomerulosclerosis. هذه الأمراض هي الأسباب الرئيسية للفشل الكلوي التدريجي ووضع نهاية مرحلة المرض الكلوي، وشرط الذي يعتمد بقاء الغسيل الكلوي أو زرع الكلي. ولذلك، من المهم دراسة glomeruli فهم أفضل لأمراض الكلي المزمنة مرض (كد).

نظام ثقافة خلية أمر بالغ الأهمية لدراسة البيولوجيا الكبيبي. نظراً لدورها المركزي في توليد فتحه الحجاب الحاجز، فضلا عن وجود أمراض معينة بروتينوريك بسبب شق غشاء بروتين الطفرات، استخدمت الكثير من البحوث ومن المفهوم أن بودوسيتي في عزلة. وادي ذلك إلى توليد خطوط الخلايا بودوسيتي الأولية استخدامها في المختبر. هذه الخلايا يمكن أن تكون مثقف تحت مجموعة متنوعة من الظروف، وحتى يمكن أن تزرع على نفاذية يدعم تقييم نفاذية⁴. ومع ذلك، عزل الخلايا المتكاثرة كثيرا ما يختار ديديفيرينتياتيد الخلايا التي فقدت بعض علامات بودوسيتي على. وهذا أدى إلى توليد مخلدة مشروط بودوسيتيس المستمدة من سلالة ماوس المحورة وراثيا تحمل متحولة حساسة للحرارة SV40 كبيرة تي الجينات (مثل إيمورتوموسي)، التي يمكن أن تزرع في الثقافة ولكن أيضا أن تكون متباينة للتعبير عن مجموعة كاملة من علامات بودوسيتي⁵. هذه الأساليب من الثقافة الأولية كانت محورية في فهم بيولوجيا بودوسيتي^4،،من⁶⁷.

ومع ذلك، الثقافات التي تحتوي على أنواع خلية مفردة تفتقر إلى العلاقات بين الخلايا التي تحدث في فيفو ، فضلا عن دعم هيكل والمصفوفات، ومونولاييرس من هذه الخلايا لا الخص بالضرورة ثلاثي الأبعاد بنية glomeruli. بودوسيتيس مخلدة أيضا يمكن أن تكون مرهقة ومليئة بالتحديات الثقافة⁸، وتتطلب حيازة أما إيمورتوموسي أو قاسمة انطلاق من الخلايا في المنشأة المحققين الشروع في العمل. علاوة على ذلك، يتكون في الكبيبة ليس فقط بودوسيتيس، ولكن أيضا خلايا بطانية الشعرية والغشاء، كذلك خلايا mesangial التي توفر الدعم للهيكل. ولذلك أنها مفيدة لوضع السابقين فيفو نهج متاح لجميع المحققين لدراسة سليمة جلوميرولي التي تحتفظ بها الهندسة المعمارية الأصلية، فضلا عن كافة الخلايا التي تشكل الكبيبة العادية.

ووصف كوك وبيكرينغ في عام 1958، عزل أول glomeruli من الكلي أرنب. بعد الملاحظات أن أصبح قدم انصمام الدهون في جلوميرولي، افترض أن جزيئات من نفس الحجم يمكن أن تستخدم لعزل هذه الهياكل على وجه التحديد. وفي الواقع، ضخ جسيمات أكسيد الحديد في الكلي أدى إلى محاصرة هذه الجسيمات في glomeruli. بعد الانفصال الميكانيكية والنخل الكلي، يمكن glomeruli عزل سليمة ومع نقاء عن طريق استخدام الفاصل المغناطيسي⁹. في عام 1971، ميسرا أظهرت أن أكسيد الحديد يمكن حذف دفعات، والعزل الكبيبي مع النخل مفروم الإنسان، الكلب، والأرانب أو الفئران أنسجة الكلي¹⁰. هذا الأسلوب قد تم تعديلها منذ ثم تبعاً لهدف المحققين ولكن أدى أساسا إلى تنقية الأعمال التحضيرية التي يمكن دراستها كذلك أو التي يمكن أن تكون الثقافات الخلية الابتدائية أنشئت^{11،12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17}.

هنا يمكننا وصف بروتوكول لعزل glomeruli سليمة قابلة للاستمرار من الكلي الفئران. بروتوكول كامل يستغرق ساعات قليلة فقط. على الرغم من أنها لا تتكاثر، يمكن دعم الخطط التجريبية لأي حجم ببساطة زيادة عدد الكلي كابتداء من المواد. بينما هناك بروتوكولات المنشورة لفصل المغناطيسية حبة glomeruli، أنها تتطلب حقن الوريد الخرز وهي أكثر تكلفة، وقد يغير بيولوجيا منذ الخرز يتم أما الاحتفاظ جلوميرولي في الثقافة أو تتطلب الكبيبي " ليسينج "وإزالتها بواسطة الطرد المركزي¹⁹. مقارنة glomeruli الماوس، حجم أكبر من الفئران جلوميرولي (ما يقرب من 100 ميكرومتر في الفئران هما شهرا من العمر¹⁸) يجعلها أسهل بكثير لفصلها عن غيرها من الهياكل الكلي باستخدام تقنية سيفينج بسيطة.

وكدليل على فائدتها، اتسمت نحن glomeruli لإظهار أنواع الخلايا المختلفة. يمكن أيضا أن يتعرضوا لعوامل معروفة لتصيب glomeruli الحية، ونظهر الآثار السلبية من كبريتات البروتامين (PS) على هذه الثقافات. ملاحظة: هو بوليكيشن أن يحيد أنيونى المواقع على طول الجدار الشعرية الكبيبي²⁰. تحييد هذا له تأثير كبير على الحاجز الترشيح الكبيبي وذلك يزيد إغاراته عملية بروتينية وسيرا على الأقدام. ويمكن تقييم هذه جلوميرولي مع إيمونوبلوتس للبروتينات الرئيسية مثل نيفرين و WT1 لتقييم الصحة العامة. وعلاوة على ذلك، يمكن تقييم هيكلها مع الضوء، الفلورة والمجهر الإلكتروني.

عموما، أن هذا البروتوكول الوصول إلى معظم المحققين (واحد فقط يحتاج إلى الوصول إلى الحيوانات وبعض المعدات البسيطة). مع الميزات المورفولوجية ترك غير التالفة، الباحث قادراً على تحليل جلوميرولي وانظر كيف سائر أنواع الخلايا الهامة والحفاظ على المصفوفة في جلوميرولي تؤثر على تطور وظيفة والمرض، عيب ثقافات بودوسيتي.

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة بيتسبرغ.

1-عزل Glomeruli الفئران

1. لإعداد المخزن مؤقت عزلة 1% عقيمة، إضافة 5 غ ألبومين المصل البقري (BSA) إلى 600 مل كوب.
   1. إضافة 500 مل 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى الكأس ويقلب بقضيب إثارة مغناطيسية حتى يذوب جميع جيش صرب البوسنة.
   2. تصفية العقيمة المخزن المؤقت جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني 1% في غطاء ثقافة خلية.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ المخزن المؤقت جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني 1% العقيمة في 4 درجات مئوية لتصل إلى أسبوع.
2. الحصول على الفئران سبراغ داولي 2 إلى 4 يزن 150 إلى 200 غ.
   1. Euthanize الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون باستخدام دائرة الذي قدم فيه 100% ثاني أكسيد الكربون بمعدل 10-30% حجم الدائرة في الدقيقة. مراقبة الحيوانات لوقف التنفس وتلاشي لون العين قبل إزالة من ثاني أكسيد الكربون.
   2. تعد الجلد على البطن الأمامي مع الإيثانول 70% واستخدام مقص الشعر لإزالة الشعر، إذا رغبت في ذلك. جعل شق خط الوسط في الجلد باستخدام المقص الجراحي أو مشرط. جعل آخر شق خط الوسط من خلال طبقة العضلات لكشف الأجهزة الداخلية. تمديد شق ﻷسلحته عن طريق الحجاب الحاجز والقص أو القفص الصدري كوسيلة ثانوية للقتل الرحيم.
   3. عزل وإزالة كلا الكليتين ووضعه في أنبوب مخروطي بلاستيك معقمة 50 مل مع 30 مل هانكس الحل الملح مخزنة (حبس) على الجليد.
      ملاحظة: يمكن أن euthanized الفئران عدة في الدائرة نفسها وكل من الكليتين يمكن أن توضع في أنبوب مخروطي الشكل نفسه.
3. الحفاظ على الكليتين على الجليد والنقل إلى غطاء ثقافة خلية عقيمة. نقل الكلي إلى طبق بتري عقيمة التي تحتوي على 5 مل حبس، أيضا فوق الجليد، وإزالة وتجاهل الدهون بيريرينال بالمقص والملقط حادة. إذا كان لا يزال موجوداً، أيضا إزالة وتجاهل الكبسولة المحيطة بالكلى بجعل شق سطحية صغيرة وثم استخدم الملقط حادة للطف تسحبه بعيداً عن الجهاز.
   ملاحظة: دائماً يعزل الكلي على تقنية تعقيم الجليد والممارسة في جميع أنحاء. يمكن وضع قطعة من شاش معقم في طبق بتري على سطح مادة عقد الكلي في مكانها من خلال التلاعب.
   1. قص الكلي في نصف الطول (قسم ميدساجيتال)، وإزالة وتجاهل لب (والذي أكثر قتامة في اللون) مع مشرط في طبق بتري ثاني مع 5 مل حبس.
   2. نقل القطع المتبقية، وغالباً قشرة الكلي، إلى ثالث طبق بيتري مع 5 مل حبس وفرم مع شفرة حلاقة عقيمة حتى القطع أقل من 1 ملم في الحجم، أو حتى يتم تشكيل عجينة.
4. الرطب أعلى وأسفل لغربال 180 ميكرون مع 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني على مدى 500 مل كوب نفايات. هذه الخطوة غير الحرجة كما المعاطف غربال مع البروتين ويقلل من تمسك جلوميرولي، التي من شأنها تحسين الغلة.
5. ضع قشرة مفروم على حافة صغيرة لغربال واستخدم شفة المكبس محكم (الجهة المقابلة للختم المطاطي) لحقنه 10 مل الهريسة الأنسجة من خلال المنخل في عموم أسفل يجلس على الجليد. شطف دورياً بحبس ولكن استخدام أقل قدر ممكن لتجنب إضعاف العينة.
   ملاحظة: لا تتجاوز 30 مل إجمالي المخزن المؤقت، لذا فقط 25 مل أكثر يمكن استخدامها هنا. والسبب في وضع الأنسجة مفروم على حافة واحدة فقط لغربال خفض التزام جلوميرولي عن طريق الحد من التعرض لجزء المنخل بدلاً من المساحة السطحية غربال كامل.
   1. ولتسهيل ذلك، إعادة استخدام السوائل جمع في عموم السفلي شطف المنخل. بمجرد اكتمال النخل، بعناية غسل الجزء السفلي من غربال مرة أخرى مع المخزن المؤقت لجيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني 1% من الجزء السفلي من عموم لالتقاط أي جلوميرولي التي قد تكون فضفاضة التقيد بها.
   2. جمع كل من السائل في عموم أسفل إلى عدة 10 مل المحاقن مجهزة بابر ز 20 وتمريرها من خلال الإبرة مرات إضافية على الأقل 2. في المجموعة الأخيرة، الحفاظ على السوائل المحتوية على جلوميرولي في المحاقن حتى جاهزة تمريرها من خلال غربال 90 ميكرون.
6. بينما يتم تخزين السوائل في الحقن، يغسل عموم السفلي بالتنظيف مع 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني في الكأس النفايات والرطب الأعلى وأسفل غربال 90 ميكرون مع 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني. ضعه المنخل أعلى عموم السفلي على الجليد.
   1. تطبيق العينة في الحقن إلى حافة واحدة من غربال ومش من خلال غربال مع شفة حقنه أخرى كما وصف أعلاه. يغسل مع الحل من عموم أسفل لجمع كل شيء على حافة واحدة من المنخل.
   2. النخل مرة واحدة كاملة، وتغسل بعناية أسفل غربال كما في الخطوة 1.5.1. جمع جميع السوائل في عموم السفلي في أنبوب 50 مل مخروطية بلاستيك.
7. أغسل المقلاة السفلي مع 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني في الكأس النفايات والرطب الأعلى وأسفل منخل 75 ميكرون مع 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني. ضعه المنخل أعلى عموم السفلي على الجليد.
   1. تطبيق العينة على حافة واحدة لغربال. وينبغي أن تدفق السائل من خلال بسهولة. شطف من خلال الأعلى مع مالا يقل عن 20 مل من 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني في الكأس النفايات. أغسل بعناية أسفل غربال كذلك. Glomeruli سيبقى على رأس هذا منخل 75 ميكرون.
   2. استخدام حبس لجمع جلوميرولي في طبق بتري قبل الشطف من خلال غربال رأسا على عقب. استخدام قدر حبس حسب الحاجة هنا. جمع في واحد أو أكثر 50 مل البلاستيك مخروطية الشكل tube(s) على الجليد.
8. الطرد المركزي في 1800 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية بعناية مع ماصة ريسوسبيند بيليه في 10 مل حبس الباردة. تجمع العينات إذا جمعت الأنابيب المخروطية المتعددة في 1.7.2. كرر الخطوة الطرد المركزي.
9. ريسوسبيند جلوميرولي في 5 مل حبس حتى على استعداد للمضي قدما إلى الخطوة التالية.
10. إذا رغبت في ذلك، اتخاذ عدد من جلوميرولي المجموع. لهذا، أخذ عينة ميليلتر 10 مع ماصة ومكان الهبوط على شريحة زجاجية. عرض تحت مجهر، عد جلوميرولي في الميدان وأضرب 500 للحصول على إجمالي العائد.
    ملاحظة: قد يتم تحديد نقاء بإحصاء عدد الأنابيب التي ينظر إليها في الحقل وقسمة مجموع عدد glomeruli وأنبوب الهياكل. ينبغي أن يكون هناك > 95% glomeruli في المجال البصري.
    1. إذا كان هناك تلوث أنبوبية كبيرة، كرر الخطوات 1.6.1 فصاعدا، وتأكد من أن يغسل جيدا عند إكمال الخطوة 1.7.1. وهذه هي الخطوة التي تلوث أنبوبي هو الأكثر احتمالاً أن يحدث.

2-الإصابة جلوميرولي

1. جمع glomeruli في أنبوب مخروطي البلاستيكية 15 مل وتدور إلى أسفل في 200 x زاي ريسوسبيند في مبلغ مناسب لحبس استناداً إلى العائد الكلي حيث أن هناك حوالي 9,000 glomeruli كل بئر. "الماصة؛" ميليلتر 450 من العينة في كل من لوحة 24-جيدا جيدا، أو أي شكل اللوحة التي تناسبها فحوصات المتلقين للمعلومات المطلوبة.
   ملاحظة: بيبيتينج صعودا ونزولاً مزيج glomeruli في المخزن المؤقت ليضمن حلاً متجانسة. Glomeruli لزجة وثقيلة جداً وسوف تتمسك ببعضها البعض، فضلا عن تسوية في الجزء السفلي من التوصل إلى حل بسرعة وعلى جانبي الأنبوب.
2. جعل 6 مغ/مل البروتامين سلفات الحل (PS)، أولاً حل ز 1 من PS إلى 10 مل dH2O ساخنة إلى 40 درجة مئوية في الأنبوبة المخروطية البلاستيكية 15 مل ودوامه تماما. تأخذ 30 ميليلتر من الحل، وإضافة إلى 470 ميليلتر من dH2O.
   ملاحظة: هذا سوف ينتج حلاً 6 مغ/مل، وعند إضافة 50 ميليلتر للبئر كما هو موضح أدناه، يكون التركيز النهائي 0.6 ملغ/مل.
   1. في التكرارات، إضافة 50 ميليلتر من كبريتات البروتامين (هذا 01:10 إضعاف) لكل بئر من مجموعة واحدة، وحين تزويد آخر مجموعة 50 ميليلتر من حبس (مراقبة سلبية).
3. احتضان لوحة ح 4 في 37 درجة مئوية.
4. تدور أسفل محتويات كل بئر في أنبوب ميكروسينتريفوجي (4000 x ز، 4 درجة مئوية، 10-15 ثانية) وتغسل مرتين مع 1 مل من كل برنامج تلفزيوني.
5. نضح إيقاف الغسيل النهائي وريسوسبيند في 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. تقسيم إلى مختبرين الثلاثة التي سيتم إعدادها لعزل البروتين والتصور المجهر الإلكتروني (TEM) انتقال الفلورة تلطيخ (إذا).

3-إعداد جلوميرولي للتحليل

1. تدور أسفل محتويات مختبرين (4000 x ز، 4 درجة مئوية، 10-15 ق) وأسبيراتي إيقاف تشغيل المخزن المؤقت المتبقية الثلاث والمضي قدما إلى تحليل العينات بال، إذا، أو عزل البروتين.
2. التجهيز لل
   1. إصلاح الكريات الكبيبي في 150 ميليلتر من بارد glutaraldehyde 2.5% في برنامج تلفزيوني 0.01 متر. إزالة مثبت عناية من بيليه استخدام ماصة باستور، مع التأكد من عدم عرقلة بيليه، ثم تشطف أنه مع برنامج تلفزيوني، وبعد إصلاحه في أكسيد الاوزميوم 1% مع سيانيد البوتاسيوم 1%.
   2. يذوي العينة من خلال سلسلة متدرجة من الإيثانول (30، 50، 70، 90، 100، 100، 100 ٪)، وأكسيد البروبيلين ثم تضمينها في تضمين مادة الإيبوكسي.
   3. قطع شبه رقيقة (300 نانومتر) الأقسام على أولتراميكروتومي. وصمة عار مع 0.5% أزرق تولويدين في بورات الصوديوم 1% ودراستها تحت المجهر الخفيفة.
   4. قطع المقاطع سامسونج (65 nm) ووصمة عار لهم مع خلات اليورانيل وسترات رينولد بالرصاص، وفحص مجهر إلكتروني انتقال.
3. التجهيز لحالة
   1. إضافة 150 ميليلتر الجيلاتين 12% في برنامج تلفزيوني الحل ووضع فورا في الثلج الجاف لتشكيل بيليه. نقع بيليه في 500 ميليلتر بارافورمالدهيد 2%/1 × برنامج تلفزيوني في أنبوب ميكروسينتريفوجي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   2. وضع بيليه في قاعدة العفن وتضمينها عن طريق إضافة قطع الأمثل (OCT) درجة الحرارة المتوسطة فوق الجليد الجاف. قص 5-10 ميكرون المقاطع في كريوتومي ومتابعة الفلورة/إيمونوهيستوتشيميستري أو البقع النسيجي القياسية.
4. لعزل البروتين
   1. إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت للمعهد الملكي لبيليه الكبيبي تثفيل مع 1.5 ميليلتر من مثبطات البروتياز ودونس مع أجهزة المجانسة الأنسجة.
   2. تشرع في تحديد مقدار البروتين وإيمونوبلوتينج أو تحليل البروتين الأخرى.

يمكن أن تكتمل في أقل من 2 ح البروتوكول من وقت القتل الرحيم لعزله glomeruli وعالية الإنتاجية والكفاءة. مع الاستخدام السليم لهذه التقنية، يتراوح عائد جلوميرولي كل الفئران الكلي glomeruli 6,000-10,000 عند بدء تشغيل مع الكلي 8. تعليق نهائي هو المزدحمة مع جلوميرولي ونقاء شاملة > 95%، عرض الحد الأدنى من التلوث من شرائح أنبوبي أو أنواع الخلايا الأخرى (الشكل 1أ، ب). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الملون glomeruli جزءا لا يتجزأ من أكتوبر مع البقع (H & E) الهيماتوكسيلين وويوزين لمعرفة مورفولوجية (الشكل 1ج). هذه glomeruli الحفاظ على بنيتها في جميع أنحاء البروتوكول كله، حتى بعد المعالجة. علينا أن نظهر أن تمتلك glomeruli المعزولة بودوسيتيس سليمة وقابلة للتطبيق (الشكل 2أ) وخلايا mesangial (الشكل 2ب) وخلايا بطانية (الشكل 2ج).

مرة واحدة معزولة، يمكن أن يتعرض glomeruli للإصابات الكيميائية المعروفة لمحاكاة في فيفو الباثولوجيا. في هذه الحالة، قد اختير كبريتات البروتامين (PS) لقدرتها على إعاقة المسؤول عن الحاجز الترشيح الكبيبي، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى القدم إغاراته العملية. وقد تعامل PS glomeruli تخفيض ملفتة للنظر في نيفرين (أحمر) وعدد من النوى إيجابية بالنسبة WT1 (الأخضر) عبر الفلورة (الشكل 3أ، ب). يمكن أيضا إعداد glomeruli مجهر إلكتروني (الشكل 3ج). عينات مراقبة بودوسيتي عادية مورفولوجية والقدم العمليات في حين glomeruli تعامل PS إغاراته العملية سيرا على الأقدام (الشكل 3د)، وهو علامة على الخلل في بودوسيتي وينظر في النماذج في فيفو باستخدام PS21. هذا يقابل أيضا انخفاضا في نيفرين الكشف عنها بواسطة immunoblotting (الشكل 3هاء، واو).

لتحديد صلاحية، وجرى تقييم ملصوق caspase-3 كعلامة للمبرمج. استخدام الفلورة، ملصوق caspase-3 يظهر أولاً في الخلايا قليلة بدأت ح 2 بعد عزلة (الشكل 4). عدد الخلايا معربا عن حوزتي هذا أصبح أكثر وفرة على مر الزمن، مع أعلى مستويات ينظر في 24 و 48 ساعة. وهذا يوحي بأن المبرمج تحدث نسبيا مبكرا في الثقافة، وأنه ينبغي إجراء تطبيقات المصب قريبا بعد عزلة للحصول على أفضل النتائج.

الشكل 1 . المظهر نموذجية من الثقافات الكبيبي الفئران بعد عزلة. (أ) صورة برايتفيلد للثقافة الكبيبي. على الرغم من أننا اختيار حقل الذي يوجد أنبوب كلوي واحد في هذه صورة مجهرية (رأس السهم)، الثقافات التي تم الحصول عليها بشكل عام > 95% نقية. شريط مقياس يساوي 100 ميكرومتر-(ب) الموسع صورة الكبيبة واحدة. (ج) توضع وويوزين وصمة عار الكبيبة واحدة. أشرطة مقياس في ب وج تساوي 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 . يتم الاحتفاظ بأنواع الخلايا المكونة في عزلة glomeruli. وأجرى الفحص المجهري الفلورة [كنفوكل] نيفرين (أحمر، بودوسيتيس) وعلامات خلية على حدة لتحديد بودوسيتيس وخلايا mesangial والبطانة. (أ) Costain نيفرين و WT1 (الخضراء، بودوسيتيس). (ب) Costain نيفرين وبدجفر-β (أخضر، وخلايا mesangial، السهم). (ج) Costain نيفرين و CD31 (الخلايا الخضراء، بطانية، سفن في المقطع العرضي تميزت رؤوس الأسهم). شريط المقياس = 25 ميكرومتر في كل اللوحات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 . يمكن أن تكون الإصابة بودوسيتي المستحث في المختبر باستخدام الفئران المعزولة glomeruli. (أ) [كنفوكل] الفلورة مجهرية نيفرين و WT1 بالثقافة الكبيبي غير معالجة. ملاحظة خطية نيفرين تلطيخ (أحمر) ووجود نواة WT1 الإيجابية (الأخضر) التي تعتبر عادة عندما يكون هناك بودوسيتيس صحية. (ب) بعد كبريتات البروتامين المعاملة، التعبير نيفرين المنخفض وغير الخطية، و WT1 غائب، مشيراً إلى إصابة بودوسيتي. (ج) انتقال إلكترون ميكروسكبي (TEM) صورة تبين عمليات سيرا على الأقدام والغشاء بطانة فينيستراتيد نموذجية لهيكل الكبيبي العادية. شريط يساوي 500 نانومتر. (د) بعد سلفات البروتامين، وعمليات القدم ممدود أو تﻻشيه (رؤوس)، الذي يشير إلى إصابة بودوسيتي. (ه) لطخة غربية نيفرين عرض انخفضت نيفرين بعد العلاج سلفات البروتامين. ويرد أكتين (F) تحميل عنصر التحكم للطخة غربية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 . تقييم سلامة الخلية في عزلة glomeruli. تم إجراء الفحص المجهري [كنفوكل] الفلورة ملصوق caspase-3 (أخضر). وأجرى نيفرين وصمة عار المشارك بسهولة تحديد موقع في جلوميرولي. بينما لا يوجد أي الإيجابية caspase-3 ملصوق على 0 وح 1 بعد عزل glomeruli، إشارة fluorescence في الخلايا قليلة لوحظ في حاء 2 تدريجيا المزيد من الخلايا تحولت إيجابية أطول بعد العزلة التي بحثت. أكبر عدد من الخلايا إيجابية caspase-3 لوحظ في 24 و 48 h. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.