التحديد الكمي لنشاط نقص التصبغ في المختبر

الميلانين يلعب دوراً حاسما في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض، وعلم السموم للعديد من الأجهزة بما في ذلك الجلد والعيون، والدماغ¹. المهام الرئيسية الميلانين تأثيرات الصور-الفحص والبيوكيميائية. يمتص الميلانين الخفيفة القريبة من الأشعة تحت الحمراء والمرئية فضلا عن إشعاع الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)، مع معدلات زيادة امتصاص عند أطوال موجية أقصر من الضوء؛ وهكذا، الميلانين تحمي الأنسجة من الأضرار التي يسببها الضوء المرئي أو الأشعة فوق البنفسجية الإشعاع². الميلانين هو مضاد للأكسدة وقد تقارب للمعادن وغيرها من المواد الكيميائية السامة؛ ولذلك، يمكن أن تحمي الأنسجة من الإجهاد التأكسدي والكيميائية³. بيد الإفراط في إنتاج الميلانين يسبب مشاكل الأمراض الجلدية.

كمية ونوعية الميلانين في الجلد وقزحية العين هي أهم العوامل المحددة للون قزحية العين والجلد. قد يكون الأفراد تفضيلات لون البشرة المختلفة؛ لصالح بعض الجلد المدبوغة، بينما آخرون يفضلون ألوان البشرة أخف. اعتماداً على هذه التشكيلات الجانبية للمستهلك، استحدثت مستحضرات التجميل نقص التصبغ لإرضاء الأسواق الفردية للجلد يفضل الألوان⁴. وبناء على ذلك، دراسات النشاط نقص التصبغ ومكافحة ميلانوجينيك أهميتها علمياً وعملياً على حد سواء.

ميلانوجينيسيس هو عملية معقدة تخليق الميلانين الحيوي من خلال سلسلة من التفاعلات الكيميائية الانزيمية وعفوية في الخلايا الصباغية. الصباغية واحد محاط بحوالي 36 الكيراتينيه والصباغية الميلانين التوليف المصانع التي تقوم بتوزيع منتجاتها إلى الكيراتينيه المجاورة. في الجلد، ويتم نقل الميلانين تنتج وتخزن في حجرة ميلانوسومال الخلايا الصباغية إلى الكيراتينيه المجاورة في البشرة عبر dendrites.

لام-التيروزين بمثابة الركيزة الأولى ميلانوجينيسيس والتيروزينات إنزيم يحفز اثنين من ردود فعل متتالية تحويل لتيروزين في 3 و 4-ديهيدروكسيفينيلالانيني (دوبا) ومن ثم إلى دوباكوينوني. ردود الفعل هذه هي الخطوة الحد من معدل في ميلانوجينيسيس^5،6. وبناء على ذلك، يمكن قياس النشاط نقص التصبغ أولاً بتقييم النشاط التيروزينات الخلوية مباشرة. للقيام بذلك، يتم المحتضنة مقتطفات الصباغية التي تحتوي على التيروزينات مع دوبا ويمكن قياس دوباكوينوني المنتجة في العينات التي كانت في 475 نيوتن متر. القيم التي يتم تطبيع بتركيزات بروتين العينات، والمواد مع نقص التصبغ نتيجة النشاط في تشكيل دوباكوينوني أقل مقارنة مع عناصر التحكم.

ثانيا، يمكن قياس النشاط نقص التصبغ بقياس الميلانين في الخلايا الصباغية مثقف مباشرة. بعد علاج الخلايا بمادة الاختبار، يتم استخراج الميلانين تحت ظروف قلوية ومحتوى الميلانين هو الكمية التي كانت في 400 نانومتر. سيؤدي إلى انخفاض محتوى الميلانين من ضوابط⁷عامل نقص التصبغ.

وأخيراً، يمكن قياسها كمياً النشاط نقص التصبغ بصبغة الميلانين فونتانا-ماسون وتحليل الصور اللاحقة. في تلطيخ فونتانا-ماسون، حبيبات الميلانين خفض نترات الأمونيا والفضة لدولة معدني أسود مرئية والمناطق السوداء من الخلايا الموجودة في الصور المجهرية تمثل كمية الميلانين.

عادة ما يعطي عامل نقص التصبغ نتائج متسقة وقابلة للمقارنة مع هذه الأساليب الثلاثة، مما يؤكد أن نشاط المضمون صالحة. وبدلاً من ذلك، قد يكون من المفيد لقياس التعبير عن الجينات الرئيسية والبروتينات في ميلانوجينيسيس استجابة لمادة اختبار لدراسة النشاط نقص التصبغ. البروتينات ذات الصلة التيروزينات (الحزب-1) ودوباتشرومي توتوميراسي (الحزب-2) بالإضافة إلى التيروزينات، الإنزيمات الحيوية في ميلانوجينيسيس⁸. عامل النسخ مرتبطة بتشوهات عامل النسخ (ميتف) منظم رئيسي في ميلانوجينيسيس والتحديد الكمي لمستويات التعبير الجيني/البروتين أو تحليل نشاط مروج يمكن استخدامها أيضا لتقييم النشاط نقص التصبغ.

1-إعداد المتوسطة والمركبات والمواد الكاشفة

1. إعداد B16F10 المتوسطة كاملة النمو. تعديل الملحق دولبيكو المتوسطة النسر (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1% البنسلين/ستربتوميسين (مكافحة الآفات).
   1. لجعل 500 مل متوسطة كاملة، مزيج مل 445 من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) مع 50 مل من FBS و 5 مل من الآفات في زجاجة زجاج معقمة 1 لتر. وبعد الاختلاط بلطف، تصفية المتوسطة من خلال عامل تصفية أعلى زجاجة 0.2 ميكرون إلى قارورة زجاجية معقمة جديدة والمتجر ثم في 4 درجات مئوية.
      تنبيه: ينبغي إجراء جميع تقنيات استزراع خلية في مجلس الوزراء باستخدام تقنية معقمة لضمان العقم الميكروبيولوجية السلامة.
2. إعداد المخزن المؤقت لتحلل: 20 مم أمينوميثاني تريس (هيدروكسيميثيل) الذي يحتوي على المخزن Triton X-100 (v/v) 0.1% في درجة الحموضة 7.5 (pH تعديلها مع HCl). يمكن استخدام هذا المخزن المؤقت لمدة 3 أشهر عند تخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT). إضافة مثبطات البروتياز إلى المخزن المؤقت تحلل الحق قبل الاستخدام.
3. إعداد التيروزينات مثبط الإنزيم المخزن المؤقت. تحضير 1 م نة₂بو₄ (مونوباسيك) و 1 م غ₂هبو₄ (مائي) الأسهم الحلول. مزيج من 46.3 مل نا₂هبو₄ ومل 53.7 نة₂بو₄ إعداد وحدة تخزين نهائي من 0.1 متر فوسفات الصوديوم العازلة (6.8 درجة الحموضة).
   1. تمييع الخليط الناتج إلى 1 لتر (الحجم النهائي) مع ضبط O. H₂الرقم الهيدروجيني للحل النهائي إلى 6.8. يمكن استخدام هذا المخزن المؤقت لمدة شهر واحد عند تخزينها في 4 درجات مئوية.
4. إعداد التيروزينات الركازة الحل: 0.1% 3 و 4-ديهيدروكسي-L-فينيلالاناين (دوبا، w/v) حلت في التيروزينات مثبط الإنزيم المخزن المؤقت (راجع الخطوة 1، 3).
   تنبيه: الحفاظ على الجليد بينما في الاستخدام.
5. بشكل اختياري، إعداد 100 التيروزينات فطر يو/مليلتر. حل التيروزينات الفطر المجففة بالتبريد في التيروزينات مثبط الإنزيم المخزن المؤقت. يمكن استخدام هذا الحل لمدة شهرين عند تخزينها في –20 درجة مئوية. يتم حساب نشاط فطر التيروزينات، فضلا عن النشاط الخلوي التيروزينات حضور مواد الخلية.
   تنبيه: أن الحل اليكووتيد قبل التجميد ومن ثم تكرار التجميد والذوبان يمكن تجنبها. يبقى الحل على الجليد بينما في الاستخدام.
6. إعداد 1 هيدروكسيد الصوديوم ن الحل. تزن 4 جم من هيدروكسيد الصوديوم في دورق حجمي وحله في الماء المقطر لجعل 100 مل.
7. إعداد تثبيت الحل (الفورمالين 10%). تمييع مل 27 من 37% فورمالدهيد مع 73 مل ماء المقطر. إعداد يومية جديدة.
8. إعداد أمونياكال حل الأسهم الفضية. إعداد 5 مل محلول نترات الفضة 10% في دورق حجمي. إضافة حل هيدروكسيد الأمونيوم دروبويسي، حتى يذوب في ترسبات تماما. إضافة 200 ميكروليتر من محلول نترات الفضة (10%). وسوف يصبح الحل غائم قليلاً.
   تحذير: تجنب الاتصال واستنشاق. استخدام غطاء دخان.
9. إعداد حل العامل الفضة أمونياكال. تمييع 2.5 مل من أمونياكال حل الأسهم الفضية مع 7.5 مل ماء المقطر. تستخدم مرة واحدة وثم تجاهل.
   تحذير: تجنب الاتصال واستنشاق. استخدام غطاء دخان.
10. يعد كلوريد الذهب 0.1%. إعداد 1 مل كلوريد الذهب 10% وإضافة 99 مل ماء المقطر في دورق حجمي. إعداد يومية جديدة.
11. تحضير المحلول الملحي العازلة الفوسفات (PBS). أضف 8 جم من كلوريد الصوديوم، غ 0.2 من بوكل، 1.44 غ غ₂هبو₄ و 0.24 ز خ₂ص₄ في 800 مل ماء المقطر. قم بضبط ال pH إلى 7.4 مع HCl. ديلوت الخليط الناتج إلى 1 لتر (الحجم النهائي) بالماء المقطر.
12. تحضير محلول ثيوكبريتات الصوديوم 5% (w/v) الذائبة في الماء المقطر.

2-الخلية الثقافة والعلاج

1. استخدام خلايا B16F10 المتاحة تجارياً. الحفاظ على الخلايا B16F10 في المتوسط كاملة. الاحتفاظ بقارورة ثقافة الخليوي في هوميديفيد، 5% CO₂ الغلاف الجوي حاضنة في 37 درجة مئوية.
2. إعداد المركبات اختبار ومراقبة إيجابية المانع وعينات المراقبة السلبية.
   1. حل اختبار المركبات في المذيبات المناسبة. حل مجمعات المياه القابلة للذوبان في الماء المقطر مزدوجة. يحل الماء مركبات غير قابلة للذوبان في المذيبات العضوية المناسبة، على سبيل المثال., [دمس].
   2. هنا، استخدم اربوتين المذابة في الماء المقطر مزدوج (125 ميكروغرام/مل) كعنصر إيجابي لتقييم النشاط نقص التصبغ بالمقارنة مع المركبات الاختبار أو عنصر تحكم سلبية. كعنصر تحكم سلبية (التحكم بالمعالجة بالمركبات)، استخدم الحلول أو المخازن المؤقتة المستخدمة في عينة الاختبار، مثلاً، الماء المقطر مزدوجة [دمس]، الإيثانول.
3. خلية البذر والعلاج
   1. الخلايا B16F10 البذور في 5 × 10⁴ خلايا/بئر في لوحات الثقافة 24-جيدا باستخدام متوسط كاملة واحتضان في CO₂ حاضنة ح 24. وبعد الحضانة، نضح المتوسطة كاملة.
   2. احتضان الخلايا مع المتوسطة دميم (بدون FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين) التي تحتوي على المركبات الاختبار، عنصر تحكم مثبط، أو عنصر تحكم سلبية في حاضنة CO₂ حاء 72 الاختيار خلايا كل 24 ساعة تحت المجهر. بعد هذه الخطوة، انتقل إلى الخطوات من 3-5 لإجراء مزيد من التجارب.
      تنبيه: يجب تصفية الخليط من مادة الاختبار والمتوسطة دميم من خلال عامل تصفية 0.2 ميكرومتر.

3-قياس النشاط التيروزينات الخلوية

1. باستخدام الطريقة الموضحة في الخطوة 2، قم بإزالة الوسائط وشطف الخلايا مرتين مع 300 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
2. ضع لوحة الثقافة الخلية على الجليد. إضافة 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل واحتضان لمدة 5 دقائق. ثم جمع استخدام مكشطة خلية الخلية ونقل الخلية ليستي إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي.
3. مجانسة الخلية ليساتي مع الخالطون خلية 14,500 لفة في الدقيقة ل 2 ق، 3 مرات على الجليد للحصول على التيروزينات داخل الخلايا. الاستخدام الأمثل شرط محدد الخالطون.
4. الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في × 12,000 ز في 4 درجات مئوية ونقل الخلية طافية إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي. الحفاظ على الجليد بينما في الاستخدام.
5. نقل 70 ميكروليتر من المادة طافية إلى ميكروسكوبية البوليستيرين 96-جيدا واضحة.
6. إضافة 140 ميكروليتر من محلول يحتوي على الركازة التيروزينات (دوبا) إلى ميكروسكوبية البوليستيرين 96-جيدا واضحة وهزه برفق واحتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية.
7. اختياري، إضافة ميكروليتر 70 حل الفطر التيروزينات U/mL 100 لكل بئر واحتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية.
8. قياس النشاط التيروزينات في موجه 475 نيوتن متر باستخدام قارئ الميكروسكوبية.
9. تطبيع النشاط التيروزينات في تركيز البروتين من كل عينة. قياس تركيز البروتين من كل عينة بمقايسة برادفورد.

4-قياس محتوى الميلانين

1. باستخدام الطريقة الموضحة في الخطوة 2، قم بإزالة الوسائط وشطف الخلايا مرتين مع 300 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
2. ضع لوحة الثقافة الخلية على الجليد. إضافة 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل واحتضان لمدة 5 دقائق. ثم جمع استخدام مكشطة خلية الخلية ونقل الخلية ليستي إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي.
3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في × 12,000 ز في 4 درجات مئوية.
4. نقل المادة طافية على تركيز بروتين الكلي أنبوب وتدبير جديد للتطبيع. قياس تركيز البروتين من كل عينة بمقايسة برادفورد.
5. إضافة 300 ميكروليتر من هيدروكسيد الصوديوم ن 1 إلى كل بيليه واحتضان عند 60 درجة مئوية ح 1.
6. الطرد المركزي الحل المنحل لمدة 10 دقائق في × 12,000 ز في 4 درجات مئوية.
7. نقل 200 ميكروليتر من المادة طافية إلى ميكروسكوبية 96-جيدا.
8. قياس محتويات الميلانين في طول جه 400 نانومتر.
9. تطبيع محتويات الميلانين إلى تركيز البروتين.

5-فونتانا-ماسون تلطيخ

1. تلوين فونتانا-ماسون
   1. تغسل الخلايا مرتين مع 300 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
   2. إضافة 200 ميكروليتر من الفورمالين 10% لكل بئر واحتضانها ح 1 في 4 درجات مئوية.
   3. شطف مع الماء المقطر.
   4. إضافة 200 ميكروليتر من الفضة أمونياكال المعالجون مسبقاً يعمل الحل واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية أو حتى تصبح الخلايا في اللون الأصفر/البنى.
      تنبيه: ضع الحل العامل الفضي أمونياكال طازجة مختلطة في حمام مائي 58 – 60 درجة مئوية وإتاحة وقت كاف لدرجة الحرارة إلى حجته.
   5. إزالة الفضة أممونياكال يعمل الحل والشطف بماء مقطر.
   6. إزالة الماء المقطر. إضافة 200 ميكروليتر من كلوريد الذهب 0.1% واحتضان لمدة 2 دقيقة في الرايت
   7. إزالة الحل 0.1% كلوريد الذهب والشطف بماء مقطر.
   8. إزالة الماء المقطر. إضافة 200 ميكروليتر من حل ثيوكبريتات الصوديوم (5%، w/v)، واحتضان لمدة 2 دقيقة.
   9. إزالة الحل ثيوكبريتات الصوديوم والشطف بماء مقطر.
   10. إزالة الماء المقطر. إضافة 200 ميكروليتر من "الأحمر سريع النووية" واحتضان لمدة 5 دقائق.
   11. إزالة "الأحمر سريع النووية" والشطف بماء الصنبور.
   12. إزالة ماء الصنبور ومراقبة الخلايا الملون تحت مجهر.
2. تلوين فونتانا-ماسون (عتبة التحليل باستخدام إيماجيج)
   ملاحظة: يظهر مثال إجراء تحليل الصورة باستخدام برنامج إيماجيج في "المواد التكميلية".
   1. افتح برنامج إيماجيج.
   2. حدد ملف | فتح | صورة مجهر.
   3. حدد صورة | ضبط | تلوين عتبة.
   4. لقياس المنطقة الملون مع فونتانا-ماسون، تعيين شريط المعلمة سطوع إلى الصفر وضبط شريط السطوع للبحث عن النقطة التي يتم تضمين كافة الخلايا الملون (البنى الداكن أو الأسود).
   5. تحليل حدد | تحليل الجزيئات. حدد المربع تلخيص في إطار تحليل الجزيئات واضغط موافق. الحصول على النتيجة الموجزة ولصقها في جدول بيانات.
      ملاحظة: وصف المعلمات مربع الناتجة كما يلي:
      الشريحة: اسم كل صورة
      Count: عدد الخلايا الملون
      المساحة الكلية: المساحة الإجمالية للخلايا التي تم جردها
      متوسط حجم: المنطقة/العدد الإجمالي
      المجال %: الملون إلى مجموع مساحة المنطقة × 100%؛ ويحسب إجمالي المساحة تلقائياً.
   6. حساب النسبية المنطقة الملون مع الميلانين باستخدام القيمة من "المساحة الإجمالية".
      النسبي الميلانين الملون المنطقة (%) = قيمة مجموع المنطقة الخلوية لاختبار عينة/متوسط المساحة الإجمالية لمراقبة × 100، أي،

مجمع نتائج تمثيلية للنشاط نقص التصبغ اربوتين، مكافحة--ميلانوجينيك، في B16F10 الصباغية موضحة أدناه. ويبين الشكل 1A أن اربوتين قمعها إلى حد كبير النشاط التيروزينات الخلوية مقارنة مع مراقبة المعالجة بالمركبات. وبالمثل، انخفضت محتوى الميلانين من خلايا حفز مع اربوتين انخفاضا كبيرا بالمقارنة مع عناصر التحكم (الشكل 1B). صور مجهرية لخلايا ملطخة بوصمة عار فونتانا-ماسون مبينة في الشكل 1. العلاج اربوتين تناقص مجال الصباغ الأسود مقارنة مع عنصر التحكم.

الشكل 1 : اربوتين قمعت ميلانوجينيسيس في الخلايا الصباغية. B16F10 الخلايا تعامل مع اربوتين (125 ميكروغرام/مل) ل h. 72 ألف النشاط التيروزينات الخلوية. ب-محتوى الميلانين. ج. كان تصور الميلانين مع ماسون فونتانا وصمة عار. تكون البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 4). أجريت المقارنات الإحصائية باستخدام اختبار t للطالب (قيمp < اعتبرت 0.05 إحصائيا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكتاب قد لا الكشف للتقرير.