مقالة منهجية

الإنزيم لوسيفراس الفائق لتقييم بروتيوليسيس PCSK9 حوزتي واحدة--دوران

7.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58265

⸱

أغسطس 28, 2018

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Zuckerberg San Francisco General and University of California San Francisco, 2Department of Cellular and Molecular Pharmacology and Howard Hughes Medical Institute, University of California San Francisco

في هذه المقالة

ملخص

ويقدم هذا البروتوكول وسيلة لتقييم نشاط proteolytic حوزتي دوران جوهريا منخفضة النشاط، وواحدة في سياق خلوية. على وجه التحديد، يتم تطبيق هذا الأسلوب لتقييم نشاط بروتيوليتيك PCSK9، محرك رئيسي استقلاب الدهن نشاطها proteolytic مطلوب لوظيفتها هايبرتشوليستيروليميك في نهاية المطاف.

الملخص

كونفيرتاسي بروبروتين سوبتيليسين/كيكسن نوع 9 (PCSK9) هو حوزتي واحدة--دوران الذي ينظم مستويات المصل low-density lipoprotein (LDL)، ومن ثم أمراض القلب والأوعية الدموية. على الرغم من أن بروتيوليسيس PCSK9 مطلوب لأثره الكامل hypercholesterolemic، تقييم وظيفتها proteolytic التحدي: PCSK9 المعروف فقط تهزم نفسها، ويخضع لدوران واحد فقط، وبعد بروتيوليسيس، يحتفظ به الركيزة في موقعها النشط كسيارات-المانع. تصف الأساليب المعروضة هنا تحليل الذي يتغلب على هذه التحديات. التحليل يركز على proteolysis الجزيئات في إطار يستند إلى الخلية والانقسام الروابط الناجحة للنشاط يفرز لوسيفراس، والتي يمكن قراءتها بسهولة على المديين المتوسط ومكيفة. عبر خطوات متسلسلة من الطفرات وتعداء عابرة، وقراءات لوسيفراس، يمكن التحقيق المقايسة بروتيوليسيس PCSK9 تحت ظروف من اضطراب أو الوراثية الجزيئية في طريقة الفائق. هذا النظام أيضا مناسبة لكل تقييم البيوكيميائية مغلطه سريرياً اكتشفت واحد-النوكليوتيدات مجمع الأشكال المتعددة (بطانات)، كذلك فيما يتعلق بفحص مثبطات جزيء صغير من بروتيوليسيس PCSK9.

المقدمة

PCSK9 يستهدف مستقبلات LDL (LDL-R) لتدهور، ورفع مستوى الكولسترول الضار (LDL-C) والقيادة أمراض القلب تصلب الشرايين1،2. قوة PCSK9 علاجية تستهدف خفض LDL-C وتحسين نتائج القلب والأوعية الدموية للمرضى، حتى عند إضافة علاج خفض الدهن عدوانية مع statins3،4. بيد أن العلاجات المعتمدة حاليا تقتصر على النهج القائم على الأجسام المضادة، وتعاني من نقص في الفعالية من حيث التكلفة5،6. لحل هذه المشكلة، هناك حاجة إلى بدائل علاجية أقل تكلفة، ووسيلة لتحديد المرضى الذين يحتمل أن الحصول على قدر أكبر من الفوائد، أو كليهما،.

النهج جزيء صغير يمكن أن تستهدف PCSK9 داخل الخلايا وتقدم عن طريق تحسين الإدارة وتخفيض التكاليف، وجعلها "الكأس المقدسة" في هذا المجال7. ومع ذلك، أثبت PCSK9 صعبة للمخدرات بالجزيئات الصغيرة. كما حوزتي، استهداف الدالة بروتيوليتيك PCSK9 لاستراتيجية جذابة، كما proteolysis المتمتعة بالحكم الذاتي هي الخطوة الحد من معدل نضج PCSK98 ومطلوب لأثره القصوى على LDL-ص9. حتى الآن، إلا أن هذه الاستراتيجية لم تكن ناجحة، يرجح أن سبب الكيمياء الحيوية الفريدة في PCSK9: PCSK9 كليفس سوى نفسه10، القيام بفعل واحد--دوران، وبعد المتمتعة بالحكم الذاتي-الانقسام، PCSK9 برودومين تظل ملزمة في الموقع النشط مثبط للسيارات11، منع قراءات من أي نشاط آخر في حوزتي.

تقدم هذه المقالة طريقة لتقييم دالة PCSK9 proteolytic في أزياء الفائق8. من خلال موقع الموجه الطفرات، يمكن استخدام المحققين هذا الفحص للتحقيق في آثار الترميز بطانات وجدت في العيادة تقييم هذه الآثار في بروتيوليسيس، هذه الخطوة الحد من معدل نضج PCSK9. بالإضافة إلى ذلك، سوف تكون هذه الطريقة مفيدة في تصميم شاشات الفائق لتحديد المغيرون بروتيوليسيس PCSK9، التي يتوقع أن في نهاية المطاف تعطيل عرض PCSK9 إلى LDL-R (وتعدل تأثير hypercholesterolemic PCSK9 's) . وأخيراً، هذا البروتوكول يمكن تكييفه البروتياز الأخرى مع جوهرها قلة النشاط، شريطة أن ط) زوج حوزتي الركازة محددة ويمكن الاطلاع على، والثاني) رابط داخل الخلايا مناسبة يمكن أن تنشأ للركيزة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-موقع الموجه الطفرات حوزتي المتجهات

  1. تصميم وترتيب النوكليوتيد تجميع مخصص لتثبيت طفرة الاهتمام باستخدام تعديل البروتوكولات القياسية الطفرات الموجهة الموقع12. كبسولة تفجير ديسالتيد القياسية (بدون تنقية إضافية) مقبولة تماما.
    ملاحظة: نهج عام للتصاميم التمهيدي يتضمن إنشاء الإشعال متداخلة جزئيا كما هو مبين في الجدول 1، باستخدام آلة حاسبة درجة حرارة (Tm) ذوبان محددة إلى بوليميريز للفائدة.
  2. إعداد بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (تقارير إتمام المشروعات) للطفرات موقع الموجه على الجليد، كما هو مبين في الجدول 2.
  3. دورة تقارير إتمام المشروعات كما هو مبين في الجدول 3.
  4. تشغيل 2-5 ميليلتر من كل بكر على 1% [اغروس] هلام ووضع تصور للمنتجات لتأكيد تضخيم نجاح.
    ملاحظة: سوف تظهر PCR ناجح عصابة الحمض النووي واحد، بارزة في العلامة الحجم التقريبي للقالب (~7.8 كيلو بايت).
  5. إضافة 0.5 ميليلتر (لكل رد فعل 25-ميليلتر) من دبني واحتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية ح 1.
  6. تحويل 2 ميليلتر من رد الفعل إلى كيميائيا المختصة الإشريكيّة القولونية.
    ملاحظة: سلالة كولاي تنمو بسرعة سوف يقلل مرات الحضانة، ولكن أي سلالة الاستنساخ يكون مقبولاً.
  7. لوحة التحولات على أجار بيرتاني لوريا (رطل) الذي يحتوي على 50-100 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  8. حدد المستعمرات 2-4 أن ينمو في ظل ثقافة صغيرة (2-5 مل متوسطة رطل مع 50-100 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين). احتضان ثقافة عند 37 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة حتى أنه عكر.
  9. عزل بلازميد الحمض النووي من الخلايا باستخدام مجموعة أدوات تنقية (أي، "مينيبريب") الحمض النووي بلازميد وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. قياس تركيز الحمض النووي الوتيد استخدام جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي.
  10. التسلسل بلازميد الحمض النووي على نطاق واسع باستخدام خدمة تسلسل سانجر (مثل الأساسية أو منشأة تجارية). إعداد عينات الحمض النووي طبقاً للمواصفات الخاصة بالخدمة. تتم الإشارة إلى الإشعال المستخدمة بنجاح في ردود الفعل السابقة التسلسل في الجدول 4.
    ملاحظة: بسبب التضخيم بكر من بلازميد كامل، ينصح تسلسل المنطقة بأكملها PCSK9 الترميز لكل متحولة.

2-الفائق على أساس لوسيفراس بروتيوليسيس الإنزيم

  1. خلية الطلاء (يوم 0)
    1. استخدام خلايا HEK293T مرور منخفضة لتجارب وثقافة في دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS). أداء كل خلية العمل تحت ظروف معقمة في غطاء زراعة الأنسجة حتى جاهزة الاعتداء بنشاط لوسيفراس. ويقدر عدد الآبار والصفائح اللازمة للتجربة، توقع أن ترانسفيكشنز سوف تتم في ثلاث نسخ لكل حالة اختبار.
    2. ننأى بالخلايا HEK293T من قارورة أصل بمعاملتها مع كمية ضئيلة من 0.05% حمض التربسين-الإيثيلين (يدتا) لتغطية الخلايا. إلغاء تنشيط التربسين-يدتا مع وحدات التخزين 2 من دميم وتستكمل مع 10% FBS ونقل الخلايا إلى أنبوب عقيمة. عد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية (وتلطيخ مع تريبان الأزرق). الطرد المركزي الأنبوب في 500 x ز لمدة 5 دقائق لاستعادة الخلايا.
    3. نضح المتوسطة المحتوية على التربسين وتشكيل الخلايا في المتوسط الثقافة إلى تركيز من 2 × 105 خلايا/مل. استخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 100 ميليلتر من الخلايا لكل بئر من لوحة 96-بئر الأبيض (كامد-أسفل)، الذي يعطي تركيز بذر نهائي من 2 × 104 خلايا/جيدا.
      ملاحظة: لإجراء تجارب أولية، قد يكون من المفيد أن البذور بالإضافة إلى ذلك الأخت، واضحة-أسفل لوحة 96، حسنا، بغية رصد نمو الخلايا وتمسك خلال المراسم ودليل المستقبل استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
    4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة.
    5. إعداد لوحة رئيسية من البلازميدات في شكل 96-جيدا. تمييع كل بلازميد في شطف المخزن المؤقت (تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 8.5) إلى 50 نانوغرام/ميليلتر في بئر فردية من صفيحة 96-جيدا.
      1. إعداد كل 4 آبار ل بلازميد السيطرة الإيجابية (WT)8، بلازميد مراقبة سلبية (S386A)8، وخالية من بلازميد المخزن المؤقت (بالنسبة ترانسفيكشنز وهمية). إذا كانت المخدرات أو غيرها من العلاجات المستندة إلى الخلوي ويجري التخطيط، ثم إعداد اللوحة الرئيسية مع بلازميد السيطرة الإيجابية (WT) في كل بئر، جنبا إلى جنب مع 4 آبار كل بلازميد مراقبة سلبية (S386A) وخالية من بلازميد المخزن المؤقت.
  2. تعداء (1 يوم)
    1. إعداد الخليط تعداء في شكل لوحة 96-جيدا باستخدام لوحات 96-بئر من الآبار العميقة. تؤدي ترانسفيكشنز في ثلاث نسخ، ويجري التأكد من إعداد الكواشف ما يكفي لحساب الخسائر بيبيتينج ونقل.
      ملاحظة: إعداد الحسابات التالية كاشف ما يكفي لتشغيل لوحة 96-بئر واحدة في ثلاث نسخ (تقدير متحفظ لآبار 420).
      1. جعل مزيج رئيسي من كاشف تعداء الدهون المخفف، إضافة 50.4 ميليلتر من الكاشف إلى 2050 ميليلتر من المصل خفض المتوسطة. جعل مزيج رئيسي من كاشف بريكومبليكسيشن الحمض النووي، مشيراً إلى 33.6 ميليلتر من الكاشف في 1730 ميليلتر من المصل خفض المتوسطة.
      2. استخدام ماصة متعددة القنوات، الكوة ميليلتر 16.8 من خليط كاشف بريكومبليكسيشن الحمض المخفف في كل بئر من الآبار العميقة لوحة.
      3. استخدام ماصة متعددة القنوات، اليكووت 3.2 ميليلتر (160 ng) لكل بلازميد من اللوحة الرئيسية إلى كل بئر من الآبار العميقة لوحة.
      4. استخدام ماصة متعددة القنوات، الكوة ميليلتر 20 من خليط كاشف تعداء الدهون المخفف لكل جيد من اللوحة وتخلط محتويات كل جيدا باستخدام ماصة متعددة القنوات. تغطي اللوحات، والسماح لهم بالجلوس في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10-15 دقيقة لنموذج المجمعات الدهن: الحمض النووي.
        ملاحظة: عند تعداء، المكونات النهائية الواحدة وكذلك ستكون على النحو التالي: 40 نانوغرام من الحمض النووي و 0.12 ميليلتر من تعداء كاشف 0.08 ميليلتر من كاشف كومبليكساتيون قبل الحمض النووي، ومحتوى كل منها سيكون جيدا 10 ميليلتر في الحجم الإجمالي (المصل خفض متوسط).
    2. تبادل بلطف المتوسطة على الخلايا 293T في لوحات 96-كذلك استخدام ماصة متعددة القنوات، مع الحرص على عدم تعطيل الخلايا. استبدال المتوسطة يستنشق مع 95 ميليلتر من دميم وتستكمل مع 10% FBS.
      ملاحظة: هذا سيكون وقتاً مناسباً لعلاج الخلايا مع أي مخدر للفائدة.
    3. إضافة 10 ميليلتر من خليط تعداء لكل مناسبة جيدا عن طريق ماصة متعددة القنوات. بلطف دوامة لوحة لخلط المحتويات في الآبار. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ل 24 ساعة.
      ملاحظة: وحدة التخزين النهائي من الآبار يأتي إلى 105 ميليلتر، لحساب التبخر أكثر من 24 ساعة.
  3. الفحص (اليوم 2)
    1. تعد حلاً أسهم الكاشفات كولينتيرازيني: اسكوربات الصوديوم م 3 [حله في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، أعدت طازجة] وكلوريد الصوديوم م 5، 10 ملغ/مل ألبومين المصل البقري (جيش صرب البوسنة؛ وتم حله في برنامج تلفزيوني، أعدت طازجة) وكولينتيرازيني 2 مم (حله في والميثانول المحمضة تحتوي على 200 ميليلتر من 3 N HCl كل مل 10).
      ملاحظة: يمكن تخزين كولينتيرازيني 2 مم لمدة أسبوعين عندما يتم الاحتفاظ في-80 درجة مئوية، وفي غياب الضوء.
    2. إعداد 2 x coelenterazine الكواشف لقراءات لوسيفراس، مع كاشف منفصلة كل الخلايا والمتوسطة، وفقا الجدول 5. تخلط جميع الكواشف احفظ كولينتيرازيني أولاً، تصفية الخليط من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر ثم قم بإضافة كولينتيرازيني. حماية الكواشف من الضوء حتى أنهم على استعداد لإضافة إلى اللوحات.
      ملاحظة: بسبب فقدان الحل من الترشيح، جعل كاشف ما يكفي لحساب الخسائر في كلا من الترشيح، وكذلك من عمليات النقل. ويبين الجدول 5 تركيز النهائي من الكواشف 2 x (فضلا عن مقدار حل الأسهم إضافة إلى تلا لوح واحد 96-جيدا مع كاشف واحد).
    3. إزالة الخلايا من الحاضنة 24 ساعة بعد تعداء. استخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 50 ميليلتر من المتوسطة مكيفة من كل بئر لصفيحة 96-جيدا (معتم) الطازجة والقاع الأبيض.
      1. قم بتسمية لوحات فيما يتعلق بما إذا كانت تحتوي على المتوسط أو الخلايا. إذا كان ترانسفيكتيد أكثر من 96-جيدا لوحة، تسمية لوحات لضمان أن كل لوحة تحتوي على المتوسط هو يقترن به طبق الأصل من الخلايا.
    4. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميليلتر من 2 × كاشف كولينتيرازيني غير الحال إلى اللوحة التي تحتوي على فقط مكيفة المتوسطة. روك بلطف أو اهتزاز اللوحة في غياب الضوء لمدة 5-10 دقيقة في الرايت
    5. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميليلتر من كاشف كولينتيرازيني الحال x 2 إلى اللوحة التي تحتوي على الخلايا. روك بلطف أو اهتزاز اللوحة في غياب الضوء لمدة 5-10 دقيقة في الرايت
    6. بعد الحضانة، وقرأ التﻷلؤ لصفيحة متوسطة فقط في قارئ لوحة. بعد ذلك، تلا التﻷلؤ اللوحة التي تحتوي على خلايا في نفس القارئ لوحة.
    7. تجاهل اللوحات وحفظ الملفات لتحليل البيانات.

3-بيانات التحليل

  1. القيام بتحليل بيانات أولية استخدام برامج جداول البيانات. إنشاء جدول يحتوي على النتائج من الخلية ولوحات متوسطة الحجم.
  2. يدوياً فحص البيانات من لوحات الخلية لتحديد آبار transfected سيئة. الآبار التي تظهر < 5%-10% من قراءات بلازميد مراقبة سلبية (S386A) ينبغي النظر سيئة كما ترانسفيكتيد، مما يجعل تفسير تلك البيانات المشتبه فيه.
  3. حساب التﻷلؤ متوسط الخلفية لكل لوحة من آبار transfected وهمية. قم بطرح الخلفية لكل لوحة من قيم تلك اللوحة.
    ملاحظة: قد تكون هذه القيمة لا يعتد بها تبعاً للقارئ لوحة المستخدمة.
  4. عملية البيانات عن طريق حساب نسبة النشاط لوسيفراس في المتوسط مقارنة بالنشاط لوسيفراس الشاملة لكل بئر. لوحة الخلية يحتوي على كلا المتوسطة مكيفة بالإضافة إلى الخلايا، ولوحة المتوسطة فقط يحتوي على نفس الكمية من المتوسطة المكيفة كلوحة الخلية، فمن المناسب استخدام المعادلة التالية:
    figure-protocol-1
    هنا، رلو = وحدات التﻷلؤ النسبي، وقراءات مطروحاً على خلفية من قارئ لوحة.
  5. حساب لوسيفراس يفرز يعني سيطرة إيجابية (وزن)، وآبار مراقبة سلبية (S386A).
  6. تقييم الجودة الشاملة للتجربة عن طريق حساب معامل Z13:
    figure-protocol-2
    ملاحظة: القيم النشطة التي تأتي من عنصر التحكم الإيجابي (WT) والقيم غير النشطة التي تأتي من آبار المراقبة السلبية (S386A). تشير القيم أقرب إلى 1 إلى أعلى جودة تجريبية. النظر في تكرار التجربة أو تحسين سير العمل إذا كانت القيمة أقل من 0.
  7. نقل البيانات من برنامج جداول البيانات إلى برمجيات تحليل البيانات العلمية.
  8. تطبيع بالنشاط لوسيفراس يفرز القيم الوسطية في مراقبة إيجابية (WT) ومراقبة سلبية (S386A)، وضع عنصر التحكم الإيجابي 1 ومراقبة سلبية ك 0.
  9. تنظيف البيانات للقيم المتطرفة باستخدام الأسلوب إزالة (هزيمة) الانحدار والخارجة، تحديد معدل اكتشاف كاذبة كحد أقصى إلى 1%.
  10. تقييم لفروق معتد بها إحصائيا بمقارنة البيانات الخاصة بكل حالة المسخ (أو متحولة) يعني النشاط WT (تطبيع إلى قيمة 1). أداء متعددة مزاوج تي-الاختبارات، تصحيح لمقارنات متعددة باستخدام أسلوب هولم-سيداك و α = 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

والرزن proteolysis الفائق يعتمد على التغلب على التحديات الرئيسية الثلاثة. أولاً، للتغلب على إخراج متدنية ارتباطاً وثيقا حوزتي PCSK9 واحد--دوران، حوزتي PCSK9 تفتقر المثبطة برودوماين يستخدم، مع تسلسل الانقسام في ذيل برودوماين ترتبط لوسيفراس يمكن أن يفرز14. ثانيا، لتلبية الحاجة إلى حوزتي أمثال المعقدة مع به المثبطة برودومين، البروتينية اثنين كويكسبريسيد في ترانس في سياق خلوية15،16، عن طريق نا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الإجراءات التجريبية المذكورة أعلاه يقدم طريقة للتغلب على نشاط متدنية ارتباطاً وثيقا حوزتي واحدة--دوران PCSK9 وتقييم وظيفتها بروتيوليتيك بطريقة قوية. والمفهوم الرئيسي للمقايسة يعتمد على تحويل حدث واحد--دوران قراءات تضخيم انزيماتيكالي. وتشمل مواطن القوة المقايسة زمني قصير نسبيا وسهولة الاستخدام لمراسل لوسيفراس، فضلا عن قابلية للنهج الفائق. وبالإضافة إلى ذلك، يقيم المقايسة proteolysis في سياقها الأصلي، والهاتف الخلوي. وعلاوة على ذلك، مع هذا التحليل، يمكن تقييم بطانات سريرياً المحددة لآثارها على بروتيوليسيس PCSK9 دون الحاجة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون دعم التمويل السخي من نهلبي/المعاهد الوطنية للصحة (K08 HL124068 و LRP HMOT1243)، والمعاهد الوطنية للصحة/نكاتس عن طريق UCSF السريرية ومتعدية معهد محفز برنامج العلوم (UL1 TR000004)، UCSF الأكاديمي، مؤسسة هيلمان، جائزة الباحث بحوث العلوم جلعاد وجائزة فايزر اسباير القلب والأوعية الدموية (كل إلى جون س. كوربا) ومعهد هاوارد هيوز الطبي (لادري م. غالبان وكيفان م. شوكت).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب PCRالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1402-2900ل PCR
Q5 Hot StartNew England BiolabsM0493Lبوليميراز الحمض النووي عالي الدقة
نيو إنجلاند بيولابزN0447LdNTPs (ل PCR)
pPCSK9-NLucProtease-WTالمؤلفونغيرمتاح من المؤلفين
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386Aالمؤلفونغيرمن المؤلفين
Agarose LEGold BiotechnologyA-201-100لمواد هلامية الحمض النووي نظام
تصوير الهلام E-Gel مع قاعدة الضوء الأزرقThermoFisher Scientific4466612لتصوير المواد الهلامية للحمض النووي
SYBR Safe DNA Gel StainThermoFisher ScientificS33102للحمض النووي المواد الهلامية
Tris BaseThermoFisher ScientificBP152-1لتشغيل هلام الحمض النووي عازلة
حمض الخليك الجليديThermoFisher ScientificA38-500لتشغيل هلام الحمض النووي محلول
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكMillipore Sigma3690EDTA ، لتشغيل هلام الحمض النووي
1 كيلو بايت سلم الحمض النوويالتكنولوجيا الحيويةD010سلم الحمض النووي
DpnIنيو إنجلاند BiolabsR0176Sإنزيم التقييد
ألواح LB Agar مع 100 & micro ؛ جم / مل كاربينيسيلينTeknovaL1010ألواح LB-Carb طلقة
واحدة Mach1 T مقاومة للعاثيات المختصة كيميائيا E. القولوني< / em>ThermoFisher ScientificC862003الخلايا المختصة كيميائيا
LB المرق ، MillerThermoFisher ScientificBP1426-2LB
CarbenicillinGold BiotechnologyC-103-5مضاد
E.Z.N.A. طقم البلازميد الصغير Iأوميغا BioTekD6942-02تنقية الحمض النووي Miniprep
NanoDrop 2000 SpectrophotomerThermoFisher ScientificND-2000Cمقياس الطيف
الضوئي 293T الخلايامجموعة زراعة الأنسجة الأمريكية (ATCC)CRL-3216HEK 293T
خلايا DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، البيروفاتThermoFisher Scientific11995065DMEM ، خلية الثدييات وسائل الإعلام
الأمصال البقرية الجنينيةAxenia BiologixF001FBS
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمرThermoFisher Scientific25300062Trypsin ، لتفكك الخلايا
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ThermoFisher Scientific10010023PBS
عداد الخلايا الآليThermoFisher ScientificC10227العد الآلي للخلايا
شرائح غرفة عد خلايا الكونتيسةThermoFisher ScientificC10228شرائح لعد الخلايا
زراعة الأنسجة CELLSTAR ، أبيض ، أبيض ، مع غطاءGrenier Bio-One655083أبيض ، أبيض القاع 96 لوحة بئر
TempPlate غير محفوفة 96 بئر PCR ، الولاياتالمتحدة الأمريكية العلميةالطبيعية 1402-959696 لوحة بئر للوحة البلازميد الرئيسية
Nunc 2.0 مل DeepWell ألواحThermoFisher Scientific27874396 بئر عميق صفيحة
ليبوفيكتامين 3000كاشف تعداء الدهون L3000008 ThermoFisherScientific ، كاشف Lf3K
P3000كاشف ما قبل تعقيد الحمض النووي L3000008 ThermoFisher Scientific ، مزود ب Lf3K
OptiMEM I مصل مخفض متوسطThermoFisher Scientific31985062وسط مصل مخفض للتعداء
(+) - الصوديوم L-ascorbateMillipore SigmaA4034أسكوربات الصوديوم
كلوريد الصوديومMillipore SigmaS9888NaCl
Albumin ، مصل البقر ، الكسر V ، المعادن الثقيلة المنخفضةMillipore Sigma12659BSA
الميثانول (HPLC) ThermoFisherScientificA4524MeOH
حمض الهيدروكلوريكVWRJT9535-2HCl
CoelenterazineGold BiotechnologyCZ2.5Luciferase
مرشح حقنة الركيزة ، فلتر معقمThermoFisher Scientific09-720-3معقم ، PVDF ، 0.22 ومايكرو ؛ m ماصة مسام
Pipet-Lite متعددة الماصات L12-200XLS +ماصة Rainin17013810متعددة القنوات
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS +Rainin17013808ماصة متعددة القنوات
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS +Rainin17013807ماصة متعددة القنوات
كاشف خزانCorning4870Trough للكواشف
أنابيب الطرد المركزي ، 15 ملThermoFisher Scientific05-539-12أنابيب 15 مل أنابيب
الطرد المركزي ، 50 ملCorning 43082950 مل أنابيب
Spark MicroplateReader TecanN /A قارئ الألواح
ExcelMicrosoft2016 لنظام التشغيل Macجداول
البيانات PrismGraphPadSoftware v7برنامج تحليل البيانات العلمية
محلول مزيج متاح الذهب حيوي انتقائي مجموعة لوحات برنامج

المراجع

  1. Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
  2. Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
  3. Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
  4. Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
  5. Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
  6. Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
  7. Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
  8. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
  9. Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
  10. Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
  11. Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
  12. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91(2008).
  13. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
  16. Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
  17. Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
  18. Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PCSK9 HEK293 SNP

مقالات ذات صلة