Method Article

استراتيجية فعالة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بتحرير الجينوم

DOI:

10.3791/58268

⸱

September 19th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، وسيلة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بالاستعاضة عن إكسون الترميز الأول من الجينات مع برامج النسخ. الأسلوب كريسبر/Cas9-تعتمد يضع تسلسل ترانساكتيفاتور تحت تنظيم الجين حل محل الذاتية، ويسهل التعبير ترانسكتيفاتور حصرا في أنماط الزمانية المكانية الخاصة بالجينات وبالتالي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظم النسخ ثنائي أدوات قوية الوراثية المستخدمة على نطاق واسع لتصور، والتلاعب بالخلية التعبير مصير والجينات في مجموعات محددة من الخلايا أو الأنسجة في الكائنات نموذج. هذه النظم تحتوي على عنصرين هما كخطوط منفصلة وراثيا. سطر برنامج تشغيل يعرب منشط النسخي تحت السيطرة من الأنسجة على حدة المروجين/القدرة على، ومرافئ خط مراسل/المستجيب جين المستهدف وضع مجرى النهر إلى موقع ربط المنشط النسخ. حمل الحيوانات التي تأوي كل من مكونات ترانساكتيفيشن الخاصة بالانسجة لتعبير الجينات المستهدفة. دقة التعبير الزمانية المكانية للجينات في الأنسجة المستهدفة حاسمة بالنسبة لتفسير غير متحيز لنشاط الخلية/الجينات. ولذلك، وضع أسلوب لتوليد خطوط الحصرية الخاصة بخلية/الأنسجة سائق ضروري. هنا نقدم طريقة لإنشاء نظام التعبير العالية الخاصة بالانسجة المستهدفة باستخدام "متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب تكرار/كريسبر-المرتبطة" (كريسبر/Cas)-على أساس الجينوم تحرير الأسلوب. في هذا الأسلوب، دليل اندونوكليسي ويستهدف Cas9 اثنين تشيميريك الكشف (جرنة) إلى مواقع محددة في إكسون الترميز الأول للجينات في الجينوم المورفولوجية لإنشاء فواصل مزدوجة-ستراند (جهاز تسوية المنازعات). فيما بعد، باستخدام بلازميد مانحة خارجية تحتوي على تسلسل ترانساكتيفاتور، آلات إصلاح الخلية ذاتية تمكن الإصلاح الموجه من التماثل (HDR) من جهاز تسوية المنازعات، مما يؤدي إلى الحذف الدقيق واستبدال إكسون مع ترانساكتيفاتور التسلسل. وأعرب عن ترانساكتيفاتور طرقت في حصرا في الخلايا حيث رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية لاستبدال الجينات الوظيفية. البروتوكول خطوة بخطوة مفصلة تقدم هنا لتوليد سائق النسخي ثنائي المعرب عنها في صندوق الأجيال القادمة المورفولوجية/فروعها-إنتاج الخلايا الظهارية/العصبية يمكن اعتمادها لأي تعبير الجينات أو أنسجة محددة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأدوات الجينية للجينات المستهدفة قد وضعت أيضا في المورفولوجية، يجعلها واحدة من أفضل أنظمة نموذجية للتحقيق في وظيفة الجينات المشاركة في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية. نظم ثنائية التعبير، مثل الخميرة Gal4/UAS (التسلسل التنشيط المنبع)، اعتمد أولاً للأنسجة على حدة محسن ميسيكسبريشن الملائمة والجينات في نموذج الجينية المورفولوجية 1 (الشكل 1). هذا النظام على تيسير تطوير عدد كبير من تقنيات مثل تنظيم الزمانية المكانية overexpression الجينات، ميسيكسبريشن، وخروج المغلوب في مجموعات محددة من الخلايا، وكذلك كما هو الحال في خلية التذرية، ووسم الخلية، واقتفاء أثر مباشر الخلوية والجزيئية العمليات في ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-تصميم وتشييد جرنة "ناقلات التعبير"

  1. لتحل محل منطقة محددة بفترة طويلة من إكسون دقة، استخدم جرنة مزدوج نهج6، التي تستهدف كل جرنة يمكن على وجه التحديد طرفي المنطقة المحددة التي تهم. للحصول على تعبير الزمانية المكانية الخاصة بالجينات دقيقة من برنامج التشغيل، حدد اثنين من المواقع المستهدفة جرنة داخل إكسون الترميز الأول من الجينات.
  2. melanogaster المورفولوجية، تحديد المواقع المستهدفة جرنة باستخدام أداة "الباحث عن الهدف الأمثل" فليكريسبر (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). يمكن استخدام أدوات التصميم كريسبر المتاحة الأخرى أيضا، بما في ذلك أداة "التصميم الأمثل كريسبر" (http://crispr.mit.edu)، FlyC....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول استخدمت بنجاح لإنشاء تعبير ثنائي المستهدف مراسل نظام محدد ل bnl معربا عن الخلايا5. رابطة الدول المستقلة-لا تتسم العناصر التنظيمية (CREs) التي تتحكم في التعبير الزمانية المكانية المعقدة bnl . ولذلك، صمم إكسون الترميز الأول فقط من bnl تحقيق التعبير الزمانية المكانية تحت سيطرة الذاتية bnl التسلسل التنظيمي، للاستعاضة بتسلسل ترانساكتيفاتور ليزا البكتيرية. واختير كاسيت تحسين nls LexA::p65 المعر.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقليديا، تم إنشاؤها المورفولوجية محسن الفخاخ بطريقتين مختلفتين. واحدة من الطرق تشمل الإدراج عشوائي من برنامج التشغيل (على سبيل المثال.، Gal4) تسلسل جينوم بتبديل (مثلاً.، تبديل عنصر P)1 . بدلاً من ذلك، يمكن وضع تسلسل سائق تحت سيطرة منطقة محسن/المروج المفترضة في بناء بلازميد، التي ستدمج في موقع خارج الرحم من3،الجينوم11ثم النسخي. على الرغم من أن هذه الأساليب قد ولدت مجموعة كبيرة من Gal4 أو الفخاخ محسن ل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور ف. منفذ والدكتور ك. أوكونور-جايلز الدكتور س. فنغ للمناقشات بشأن الاستراتيجية كريسبر؛ الدكتور يد كورنبرغ، ومركز الأسهم بلومينغتون الكواشف؛ الخفة في التصوير المرافق الأساسية؛ وتمويل من المعاهد الوطنية للصحة: R00HL114867 و R35GM124878 بريال.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
X-Gal / IPTGGentrox (Genesee Scientific)18-218استنساخ
LB-AgarBD DifcoBD & nbsp ؛ 244520استنساخ
Tris-HClSigma AldrichT3253البيولوجيا الجزيئية
EDTASigma AldrichE1161البيولوجيا الجزيئية
NaClSigma AldrichS7653البيولوجيا الجزيئية
النقاء خالية من DNase / RNase المياهThermoFisher Scientific10977-023البيولوجيا الجزيئية
10٪ SDSSigma Aldrich71736البيولوجيا الجزيئية
KOAcFisher-ScientificP1190البيولوجيا الجزيئية
EtOHFisher-Scientific04-355-451جين البيولوجيا الجزيئيةJET
MiniprepThermoFisher ScientificK0503Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep مجموعاتThermoFisher ScientificK210006Maxiprep
BbsINEBR0539Sإنزيم التقييد
بادئاتIDT-DNAPCR
pCFD4لمختبروناقل ل gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)أنظمة Kapa الحيويةKK2601PCR
Q5 عالية الدقة TaqNEBNEB #M0491PCR
جيبسون الجمعية ماستر ميكسNEB NEB#E2611تجميع الحمض النووي
pBPnlsLexA: p65Uwقالب الحمض النووي الإضافي
Proteinase KThermoFisher Scientific25530049Molecular Biology
2x PCR PreMix ، مع صبغة (أحمر)SydlabMB067-EQ2Rهلام البيولوجيا الجزيئية
Zymo Research (Genesee Scientific)11-300TRI للبيولوجيا الجزيئية
مجموعات تنقيةللبيولوجيا الجزيئية
Zymo Research (Genesee Scientific)11-330البيولوجيا الجزيئية
OneTaq< / em> طقم RT-PCR بخطوة واحدةNEBE5315Sالبيولوجيا الجزيئية
lexO-< / em>CherryCAAXKornberg LabFly line
UAS-CD8: GFPKornberg labخط الطيران
btl-Gal4< / em>مختبريطير خط
MKRS / TB6BKornberg مختبريطير خط
المجهر متحد البؤر SP5XLeicaالتصوير نمط
التعبير CO2< / sub> محطةجينيسي العلمي59-122WCUيطير دفع
مجهر ستيريوأوليمبوسSZ-61يطير الدفع
مدقات متجانسة Microtubeفيشر Scientific03-421-217عزل الحمض النووي
الجيني مقياس الطيف الضوئيNanoDrop ThermoFisher ScientificND-1000الحمض النووي
فائقة قالب الحمض النووي Kornberg لتضخيم LexA مجموعة شطف كاشف الحمض النووي الريبي المباشر Sigma-Aldrich lab Kornberg قياس

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophil....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Cas9Binary Transcription SystemTissue specific ExpressionDrosophila Genome EditingHomology directed RepairGuide RNA DesignTransactivator Knock inExon ReplacementSpatiotemporal RegulationGAL4 LexA System

Related Articles