سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) هو سرطان الدم الأكثر شيوعاً في العالم الغربي. هي عوامل النسخ نفات المنظمين هامة للتنمية والتنشيط في العديد من أنواع الخلايا. نقدم هنا، بروتوكول لاستخدام لونين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) في الخلايا البشرية CLL لتحديد الجينات المستهدفة رواية من NFAT2.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الإنزيم إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين لتحديد الجينات المستهدفة NFAT2 الرواية في سرطان الدم الليمفاوي المزمن
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) تتسم بالتوسع في استنساخ الخبيثة بالخليه، ويمثل سرطان الدم الأكثر شيوعاً في البلدان الغربية. وتظهر غالبية المرضى CLL مساراً كسول للمرض وكذلك النمط الظاهري أنيرجيك على خلايا سرطان الدم، مشيراً إلى مستقبلات خلية بلا تستجيب للمؤثر الخارجي. وقد أظهرنا مؤخرا أن عامل النسخ NFAT2 منظم حاسمة من استعطال في CLL. تحديا كبيرا في تحليل دور عامل النسخ في أمراض مختلفة هي تحديد الجينات المستهدفة المحددة لها. وهذا له أهمية كبيرة لتوضيح آليات pathogenetic والتدخلات العلاجية المحتملة. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) هو أسلوب كلاسيكي لإظهار تفاعلات البروتين-الحمض النووي ويمكن، لذلك، تحديد الجينات هدفا مباشرا لعوامل النسخ في خلايا الثدييات. هنا، استخدمت شريحة لتحديد لك كجينات مستهدفة مباشرة من NFAT2 في الخلايا CLL البشرية. الحمض النووي والبروتينات المرتبطة كروسلينكيد استخدام فورمالدهايد والمنفصمة فيما بعد من سونيكيشن إلى شظايا من الحمض النووي من حوالي 200-500 قاعدة أزواج (bp). Cross-linked شظايا من الحمض النووي المرتبطة NFAT2، ثم بشكل انتقائي إيمونوبريسيبيتاتيد من الحطام الخلية باستخدام جسم مضاد αNFAT2. بعد تنقية، يتم الكشف عن شظايا من الحمض النووي المرتبطة بها عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي (قرة-PCR). تسلسل الحمض النووي بتخصيب واضحا تمثل مناطق الجينوم التي تستهدفها NFAT2 في فيفو. القص المناسب للحمض النووي، واختيار جسم المطلوبة أهمية حاسمة لنجاح تطبيق هذا الأسلوب. هذا البروتوكول مثالي لمظاهرة التفاعلات المباشرة من NFAT2 مع الجينات المستهدفة. قصره الرئيسي هو صعوبة توظيف الرقائق في فحوصات واسعة النطاق تحليل الجينات المستهدفة لعدة عوامل النسخ في الكائنات الحية سليمة.
المقدمة
سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) يمثل سرطان الدم الأكثر شيوعاً في البالغين في البلدان الغربية، نستعرض تراكم متميزة CD19 و CD23 CD5 معربا عن ب نضجاً الخلايا1. معظم المرضى يحمل بالطبع مرض كسول، الذي ليس بالضرورة معاملة محددة لسنوات عديدة. وفي المقابل، تظهر بعض المرضى التقدم السريع التي تتطلب التدخلات العلاجية الفورية مع العلاج الكيميائي المناعي أو غيرها العلاجات المستهدفة2،3. العامل النووي لتنشيط خلايا تي (نفات) عائلة من عوامل النسخ التحكم المختلفة الإنمائية وعمليات التنشيط في الخلية العديد أنواع4،،من5
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع التجارب التي أجريت مع المواد البشرية أقرتها "لجنة الأخلاقيات" التابعة لجامعة توبنغن، وتم الحصول على الموافقة الخطية من جميع المرضى الذين ساهموا بعينات لهذه الدراسة.
1-العزلة والتحفيز جوركات الخلايا
ملاحظة: لتحسين البروتوكول، استخدام خط الخلية جوركات المعروف بالتعبير عن مستويات عالية من NFAT2. يتم تنفيذ كافة الخطوات تحت غطاء الاندفاق الصفحي.
- إعداد 50 مل من 1640 RPMI تستكمل مع 10 ٪ السفح و 1% البنسلين/ستربتوميسين الاحترار إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- الثقافة الخلايا جوركات لمد 1-2 في قارورة ثقافة الخليوي في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في 20 مل من RPMI 1640 تستكمل مع 10 ٪ السفح و 1%....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1 تحليل الخلوي تدفق مثالي للمريض CLL المنجزة بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة CD19 فيتك و CD5-PE. ويبين الشكل 1a النابضة الخلايا الليمفاوية، يمثلون غالبية الخلايا في الدم لدى المرضى CLL. ويبين الشكل 1 باء نسبة CD19+/CD5+ CLL الخلايا، التي تمثل 89.03% من الخلايا الليمفاوية في هذا المثال. نسبة CD19+/CD5– ب الخلايا هو 3.72% في كل منها المريض.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الحاسمة القيام مقايسة رقاقة ناجحة هي اختيار جسم المناسبة والاستفادة المثلى من الكروماتين القص عملية25. اختيار جسم αNFAT2 ثبت أن يشكل تحديا كبيرا أثناء وضع هذا البروتوكول. بينما توجد العديد من الأجسام المضادة αNFAT2 المتاحة تجارياً وغالبية هذه يعمل بشكل جيد النشاف الغربية والتطبيقات الأخرى، تم استنساخ 7A6 الأجسام المضادة الوحيدة التي يمكن أن تستخدم بنجاح لرقاقة7. حتى يفترض أن الأجسام المضادة 7A6 متطابقة من مصنعي مختلفة أظهرت اختلافات كبيرة فيما يتعلق بأدائها في رقاقة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
هذا العمل كان يدعمها DFG منح مو 3340/1-1 وكريبشيلفي الألمانية منح 111134 (سواء منحت إلى M.R.M.). ونحن نشكر ملنك الكه للمساعدة التقنية الممتازة).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 × PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 مل أنبوب شاكر Themomixer الراحة | Eppendorf | 5355 000.011 | يمكن استبداله بأدوات مماثلة |
| 10X Bolt Sample | Agent Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS تشغيل العازلة | الحرارية العلمية | B0002 | |
| 37٪ الفورمالديهايد PA ، ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS عينة عازلة | حرارية علمية | B0007 | |
| الأجسام المضادة ل NFAT2 | اليكسيس | 1008505 | استنساخ 7A6 |
| الأجسام المضادة للجسم المضاد NFAT2 | إشارات خلية | 8032S | استنساخ D15F1 |
| الأجسام المضادة المضادة ل NFAT2 ChIP الصف | Abcam | ab2796 | استنساخ 7A6 |
| جهاز طرد مركزي كبير | Eppendorf | 5804R | يمكن استبدالها بأدوات مماثلة |
| CD19-FITC ماوس مضاد للإنسان | BD Biosciences | 555412 | استنساخ ماوس HIB19 |
| CD5-PE ماوس مضاد للإنسان CD5 | BD Biosciences | 555353 | استنساخ UCHT2 |
| كثافة تدرج متوسط Biocoll (الكثافة 1،077 جم / مل) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 مل | eppendorf | 22431021 | |
| FBS متفوقة | Merck | S0615 | |
| مقياس التدفق | BD Biosciences | FACSCalibur | يمكن استبداله بأدوات مماثلة |
| هلت كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز (100X) | جهاز نقل الجل الحراري العلمي | 78440 | |
| iBlot 2 | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 مداخن نقل ، نيتروسليلوز ، الحجم العادي | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit ل Histones | Diagenode | C01010059 | |
| ملح الكالسيوم Ionomycin | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT الحمير المضاد للأرانب IgG (H + L) ، 0.5 مجم | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) ، 0.1 مجم | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء LI-COR Odyssey | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96 ، 4729692001 Roche الأبيض | يمكن استبداله بلوحات أخرى في أدوات PCR مختلفة في الوقت الفعلي | ||
| Lysing OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA من الدرجة | المائية Covaris | 520101 | |
| M220 الرف المغناطيسي 500295 | Covaris | ||
| ، DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | يمكن استبداله بأدوات مماثلة |
| MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية 100X | 11140050 | علمي حراري | |
| Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | استبداله بأدوات مماثلة |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer غرفة العد المحسنة | Karl Hecht GmbH & amp يمكن استبدال Co KG | 40442012 | بأدوات مماثلة |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| ماء خال من Nuclease | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12٪ جل بروتين Bis-Tris ، 1.0 مم ، 15 بئر | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey & reg ؛ حجب المخزن المؤقت (TBS) 500 مل | ليثيوم كور بيوساينس | 927-50000 | |
| البنسلين / الستربتومايسين 100X | ميرك | A2213 | |
| بيرفيكتا سيبر جرين فاست ميكس | كوانتا بيو | 95072-012 | |
| PMA | سيجما ألدريتش | P1585 | |
| التمهيدي CD40L< / em> منطقة الترويج إلى الأمام | سيجما ألدريتش | 5'- ACTCGGTGTTAGCCAGG-3 ' | |
| التمهيدي CD40L< em> منطقة الترويج العكسي | Sigma Aldrich | 5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3' | |
| التمهيدي <م > IL-2< / م > منطقة الترويج للأمام | سيجما ألدريتش | 5 '-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3' | |
| التمهيدي IL-2< / em> منطقة الترويج العكسي | Sigma Aldrich | 5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3' | |
| التمهيدي LCK< / em> المنطقة الترويجية للأمام | Sigma Aldrich | 5'-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3' | |
| التمهيدي LCK< / em> عكس المنطقة الترويجية | Sigma Aldrich | 5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3' | |
| أرنب mAb IgG XP إشارات | خلية | المتنظير # 3900S | استنساخ DA1E |
| أداة PCR في الوقت الحقيقي | Roche | LightCycler 480 | يمكن استبدالها بأدوات مماثلة |
| خلاطات الأسطوانة | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 متوسطة ، مكمل GlutaMAX | 61870010 | علمي | |
| حراري إبرة متعددة الذبابة 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 البروتين الملون مسبقا القياسي | الحراري العلمي | LC5925 | |
| شاكر Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | يمكن استبداله بأدوات مماثلة |
| جهاز طرد مركزي صغير | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | يمكن استبداله بأدوات مماثلة |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | إشارات الخلية | # 12498 | |
| محلول تريبان الأزرق | سيجما ألدريتش | 93595-50 مل |
المراجع
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
