جيل من البشرية البدائية الخلية الجرثومية مثل الخلايا على سطح الهيئات امبريويد من بلوريبوتينسي جاهزة للانفجار الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

Shino Mitsunaga; Keiko Shioda; Kurt J. Isselbacher; Jacob H. Hanna; Toshi Shioda

doi:10.3791/58297

مقالة منهجية

جيل من البشرية البدائية الخلية الجرثومية مثل الخلايا على سطح الهيئات امبريويد من بلوريبوتينسي جاهزة للانفجار الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

DOI:

10.3791/58297

⸱

يناير 11, 2019

Shino Mitsunaga¹ , Keiko Shioda¹ , Kurt J. Isselbacher¹ , Jacob H. Hanna² , Toshi Shioda¹

¹Center for Cancer Research, Massachusetts General Hospital, ²Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) هي السلائف الشائعة للحيوانات المنوية والبيض على حد سواء. بجكس الجنينية البشرية المحددة من الخلايا pluripotent epiblast من خلال التفاعلات السيتوكينات. هنا، نحن وصف بروتوكول 13 يوما لحمل ترانسكريبتومالي الخلايا البشرية تشبه بجكس على سطح الهيئات امبريويد من الخلايا الجذعية pluripotent معبي-بلوريبوتينسي التي يسببها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) هي السلائف الشائعة لكافة germline الخلايا. في الأجنة الماوس، عدد سكانها المؤسسين بجكس ~ 40 هي الناجمة من الخلايا epiblast pluripotent مدبرة من التعرض إلى السيتوكينات، بما في ذلك البروتين العظام morphogenetic 4 (Bmp4). في الأجنة البشرية، تم تحديد بجكس أقرب على الجدار اندوديرمال من كيس الصفار حوالي نهاية الأسبوع 3^rd للحمل، ولكن يعرف الكثير عن عملية مواصفات PGC البشرية وتنميتها في وقت مبكر. للالتفاف حول الحواجز التقنية والأخلاقية لدراسة بجكس الجنينية البشرية، تولدت نماذج ثقافة الخلية مركب مؤخرا من الخلايا الجذعية pluripotent. هنا، يمكننا وصف بروتوكول 13 يوما لقوى الإنتاج من "الخلايا بجكليكي" البشرية (هبجكلكس). الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس) في الدولة بلوريبوتينسي معبي المحتضنة في السذاجة 4i إعادة برمجة المتوسطة لمدة 48 ساعة، وفصلها إلى الخلايا المفردة، ومعبأة في ميكروويلس. صيانة طويلة من هيبسكس في ولاية بلوريبوتينسي ساذجة الأسباب الكروموزومي كبيرة وينبغي تجنبها. هيبسكس في ميكروويلس يتم الاحتفاظ لمدة 24 ساعة في المتوسط 4i إلى هيئات النموذج امبريويد (EBs)، التي ثم إضافية المستزرعة في بلاستيكواري المنخفضة-التقيد بشرط هزاز في الأجلين المتوسط والاستقراء هبجكلك التي تحتوي على تركيزات عالية من BMP4 البشري المؤتلف. كذلك تستزرع الحديدية لمدة 8 أيام في حالة هزاز، غير المنتسب للحصول على الحد الأقصى من الغلة من هبجكلكس. طريق إيمونوهيستوتشيميستري، سهولة اكتشاف هبجكلكس كخلايا بقوة الإعراب عن OCT4 في تقريبا جميع الحديدية حصرا على سطحها. عند فصل انزيماتيكالي الحديدية وتعرض لإثراء نظام مراقبة الأصول الميدانية، يمكن جمعها هبجكلكس ك CD38 + الخلايا بنسبة تصل إلى 40-45% العائد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) هي السلائف الشائعة لكافة الخلايا germline في كلا الجنسين. قد تم الحصول على معظم معارفنا حول التنمية بجكس في أجنة الثدييات من خلال دراسة المختبر الفئران¹^،². في يوم الجنينية 6.0-6.5 أجنة الفأر، تقع إعداد صغيرة 6 أو ما شابه ذلك من السلائف PGC في ابيبلاست، وعدد سكانها المؤسسين ~ 40 هي التي يسببها بجكس منها بطريقة تعتمد على البروتينات مورفوجينيتيك العظام Bmp2 و Bmp4 ويفرز من المتاخمة الخلايا. وكانت بجكس البشرية أقرب المحددة حتى الآن في الأجنة على الجدار اندوديرمال من كيس الصفار في حوالي نهاية الأسبوع الثالث من الحمل³. لأن هذا هو نفس المكان كما لوحظت بجكس المهاجرة في الأجنة الماوس، فمن المحتمل أن بجكس البشرية الملحوظة في طريق الهجرة ولكن لا السكان المؤسسين. غير أن دراسات تتبع المراحل السابقة العودة بجكس أو PGC السلائف في الأجنة البشرية كانوا في عداد المفقودين.

الوصول إلى بجكس الجنينية البشرية يمثل تحديا بسبب العقبات التقنية والأخلاقية على حد سواء. للتغلب على هذه العقبات، تولدت مؤخرا نماذج الثقافة PGC تشبه خلية من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية (PSCs). بلوريبوتينسي هو القدرة على الهاتف الخلوي للتفريق في germline والطبقات الجرثومية الجنينية الثلاث⁴. في حين يحتفظ PSCs البشرية في المتوسط mTeSR1 (متوسط جاهزة للاستخدام، والمتاحة تجارياً المعدة لصيانة PSCs البشرية في الدولة بلوريبوتينسي معبي) على أطباق مغطاة بطبقة البروتين المصفوفة خارج الخلية لها بلوريبوتينسي الدولة أعدادا ⁴وفي عام 2013 ومختبر يعقوب حنا أظهرت أن الخلايا معبي بلوريبوتينسي يمكن أن تتحول إلى دولة بلوريبوتينسي ساذجة بتعريض للسذاجة الخلايا الجذعية البشرية المتوسطة (نهسم) التي تحتوي على مثبطات الكيميائي للبروتين مؤنزم ERK1/2، GSK3، جنك، روك، PKC، و p38 MAPK، فضلا عن عوامل النمو ليف، TGF، بفجف⁵. من PSCs البشرية السذاجة-بلوريبوتينسي، في عام 2015 إنجاز مجموعة بحوث يقودها حنا والصوراني العظيم أول إنتاج قوية من "الخلايا" البشرية بجكليكي (هبجكلكس) من PSCs⁶. في وقت لاحق، أفادت عدة مختبرات أخرى، بما في ذلك بلدنا، جيل هبجكلكس من شركات الأمن الخاصة التي تستخدم بروتوكولات مختلفة قليلاً⁷^،^،من⁸⁹^،¹⁰. دراستنا تقدم دليلاً على أن هبجكلكس التي تم إنشاؤها باستخدام بروتوكولات مختلفة (التي يرد موجز لها في الجدول S1 لدينا دراسة منشورة سابقا¹⁰) مماثلة لبعضها البعض¹⁰ترانسكريبتومالي. وتؤيد الأدلة المتاحة شبه بجكلكس البشرية إلى بجكس الجنينية البشرية في مرحلة مبكرة قبل المحو جينية العالمية⁷ و/أو الهجرة تشيموتاكتيك¹⁰.

دراسات للماوس بجكس الجنينية والماوس بجكلكس بجكلكس البشرية (مع فقط ولكن وصول محدود جداً إلى بجكس البشرية) قد كشفت عن أن الآليات الجزيئية لمواصفات PGC تختلف اختلافاً كبيرا بين الفأر و الإنسان¹^،⁶^، ⁷^،^،من⁸⁹^،¹⁰^،¹¹^،^،من¹²¹³^،¹⁴^،¹⁵^،¹⁶ ^،¹⁷. على سبيل المثال، Prdm14 تلعب أدواراً حاسمة في مواصفات PGC في الأجنة الماوس، ولكن دورها في مواصفات PGC البشرية يبدو محدودة¹^،¹⁵. وفي المقابل، تحريض SOX17 من اوميسوديرمين ضروري ل PGC مواصفات⁶^،^،من¹¹¹⁴، بينما تبدو هذه عوامل النسخ يمكن الاستغناء عنها للماوس PGC مواصفات¹⁵. دعم هذه الإنجازات الأولية للدراسات باستخدام هبجكلكس بشدة أهمية هذا النموذج ثقافة الخلية كبديل بجكس الجنينية البشرية.

وأظهرت دراسات نشرت مؤخرا، التي تنطوي على تقييم تسلسل عميق لدينا مختبر لتحليل عدد نسخ الحمض النووي الجينوم، أن صيانة طويلة الأمنية في الدولة بلوريبوتينسي السذاجة يزيد بشكل ملحوظ مخاطر عدم استقرار الكروموسومات و التشوهات الهيكلية. ولوحظ هذه الظاهرة مع الماوس¹⁸ و البشرية¹⁹ الأمنية الخاصة. بوضع بروتوكول هبجكلك الإنتاج الأصلي عنها حنا/الصوراني PSCs البشرية في متوسطة بلوريبوتينسي 4i ساذجة لمدة أسبوعين على الأقل⁶. للحفاظ على تناذر ضعفاني الطبيعي للبشرية PSCs وبجكلكس، قمنا بتطوير بروتوكول معدلة التي يتعرض فيها PSCs البشرية إلى متوسطة 4i لمدة 72 ساعة فقط¹⁰، التي ترد في هذه المادة. يتم الاحتفاظ إيبسكس البشرية (هيبسكس) في ظل حالة بلوريبوتينسي معبي. مباشرة قبل تشكيل المجلس التنفيذي، هي الخلايا المحتضنة في 4i السذاجة إعادة برمجة المتوسطة (متوسطة نهسم معدلة) لمدة 48 ساعة. ثم فصل الخلايا ومعبأة في ميكروويلس للنموذج الحديدية ل 24 ساعة إضافية في المتوسط 4i. يتم الاحتفاظ الحديدية في هبجكلك التعريفي المتوسطة التي تحتوي على تركيزات عالية من BMP4 البشري الماشوب تحت شرط هزاز للثقافة لا مرفق لمدة 8 أيام للحصول على أقصى عائد هبجكلكس. بعد 8 أيام EB الثقافة، هبجكلكس يمكن أن تكون معزولة عن ينتابها EB الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية CD38 + الخلايا مع ~ 40% العائد في نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز تعليق خلية مفردة. حين الأخرى نشر أساليب⁷^،^،من⁸⁹، بما في ذلك البروتوكول الأصلي قبل أن التعديلات⁶، تولد عادة هبجكلكس في الخلية تلقائياً شكلت المجاميع دون محددة التعريب، يلاحظ هبجكلك التي تنتجها لدينا بروتوكول على سطح الهيئات امبريويد (EBs).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-خلية ثقافة من هيبسكس في ولاية بلوريبوتينسي بدايته

إعداد أطباق المغلفة بالبروتين المصفوفة خارج الخلية
1. ذوبان الجليد ماتريجيل (بروتين المصفوفة خارج الخلية) على الجليد في ثلاجة أو غرفة باردة بين عشية وضحاها (ذوبان الجليد ليس في درجة حرارة الغرفة أو استخدام حمام ماء دافئ). مصفوفة الكوة البروتين (~ 200 ميكروليتر؛ حجم قاسمة تحددها الشركة المصنعة لكل دفعة والمبين على تسمية القنينة) في أنابيب معقمة منخفضة-ربط أجهزة الطرد المركزي أو أنابيب للواسمات خلية على الجليد. من المهم أن تبقى البروتين المصفوفة خارج الخلية المثلج أثناء الاستغناء عن تجنب التجميد. تخزين مختبرين في-80 درجة مئوية.
2. معطف خلية ثقافة الأطباق البلاستيك مع البروتين المصفوفة خارج الخلية، تمييع قاسمة واحد مع 25 مل المثلج DMEM/F12 وامتدت إلى ثلاثة أطباق 10 سم (~ 8 مل/طبق). احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد طلاء، يمكن أن تكون مختومة الأطباق باستخدام بارافيلم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
3. نضح المتوسطة من الأطباق مباشرة قبل تطعيم هيبسكس معبي بلوريبوتينسي. فإنه ليس من الضروري غسل الصحون المغلفة مع المتوسطة أو معزولة خالية من الكالسيوم/المغنيزيوم الفوسفات المالحة [PBS(-)].
الشروع في الثقافة هيبسك في الدولة بلوريبوتينسي معبي
1. إضافة 2 ميليلتر من 50 مم Y27632 [مثبط للبروتينات المرتبطة رو كيناز (روك)] إلى 10 مل متوسطة mTeSR1 في أنبوب الطرد 15 مل. إعداد أنبوبين روك تستكمل المانع 10 مل المتوسطة والشروع في ثقافة الخلية في صحن واحد 10 سم من 1 مل تجميد الأسهم الخلية. استخدام المتوسطة استكملت Y27632 في نفس اليوم. بريوارم يكمل Y27632 المتوسطة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  ملاحظة: هذا البروتوكول يعمل جيدا مع هيبسكس في mTeSR1. عندما يتم الاحتفاظ هيبسكس في وسائل الإعلام الأخرى دعم النمو PSC البشرية مع اختلاف درجات جاهزة أو السذاجة بلوريبوتينسي، عائد هبجكلكس تختلف إلى حد كبير.
  ملاحظة: صلاحية كاملة mTeSR1 هو 2 أسابيع عند 4 درجة مئوية و 6 أشهر في-20 درجة مئوية، ولكن إعادة تجميد أسباب ضعف الأداء. نحن تجميد مختبرين 40 مل من mTeSR1 في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. ذوبان الجليد قنينة هيبسك بلوريبوتينسي معبي تجميد الأسهم (1.0-3.0 x 10⁶ خلايا في 1 مل للواسمات المتوسطة) باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية. فور الانتهاء من ذوبان الجليد، نقل المحتوى بالكامل لقنينة في أنبوب واحد (10 مل) المتوسطة يكمل Y27632 بريوارميد.
3. تعليق خلية أجهزة الطرد المركزي عند درجة حرارة الغرفة، 300 x ز الدقيقة 8 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية مع 10 مل بريوارميد يكمل Y27632 من أنبوب آخر.
4. موزعة بالتساوي تعليق خلية في صحن 10 سم المغلفة بالبروتين مصفوفة خارج الخلية. ضع الطبق في حاضنة₂ شركة تراي-غاز (37 درجة مئوية، 6.5% O₂، 5% CO₂). الحفاظ على الثقافة هيبسك تحت ضغط أكسجين منخفض.
5. تغيير المتوسطة (mTeSR1 دون Y27632) كل يوم. مثبط روك (Y27632) أمر حاسم لبقاء هيبسك فورا بعد الانفصال للخلايا المفردة. بمجرد الالتزام هيبسكس على سطح معدني مغلف بالبروتين المصفوفة خارج الخلية كمجاميع صغيرة موزعة بالتساوي مع > كونفلوينسي 10% (والذي هو عادة أنجزت خلال 16 ساعة بعد التلقيح)، Y27632 يمكن الاستغناء عنها. التغيير المتوسطة مبكرا جداً بعد تلقيح هيبسكس منفصلان دون Y27632 قد يسبب موت الخلية كاملة تقريبا.
باساجينج معبي بلوريبوتينسي هيبسكس
ملاحظة: مرور معبي هيبسكس بلوريبوتينسي عندما تشغل المستعمرات ~ 80% منطقة النمو الفعال. إجراءات باساجينج الصحيح وكثافات مهم لإمكانية تكرار نتائج تجريبية. لقد رأينا أن الكفاءة الاستقراء هبجكلك لا تختلف اختلافاً كبيرا بين الثقافات هيبسك 6 أيام بعد بدء من أسهم مجمدة (التي تنطوي على واحد أو اثنين من الممرات) أو شهر واحد (التي تشمل > 10 فقرات). وأجرى بنجاح تحريض هبجكلك من هيبسكس المحافظة لأكثر من شهرين، على الرغم من أن لم يتم تقييم الكفاءة كمياً.
1. تأخذ 4 مل من تفكك خلية إنزيم الخليط في أنبوب الطرد 15 مل وحجته في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
2. بريوارم 10 مل PBS(-) في الطرد مركزي 15 مل أنبوب > 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
3. إضافة 2 ميليلتر من 50 مم Y27632 (مثبط روك) إلى 10 مل mTeSR1 المتوسطة في أنبوب الطرد 15 مل. تحضير أنبوبين متوسطة المانع استكمال 10 مل الصخور واستخدامها في نفس اليوم. في آخر 15 مل الطرد المركزي الأنبوبة، تأخذ 5 مل mTeSR1 دون إضافة Y27632. بريوارم متوسطة +/--Y27632 في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  ملاحظة: قد تحتوي على مختبرين المتوسطة جميع إعدادها في الخطوة 1.3.3 Y27632.
4. نضح المتوسطة القديمة من خلايا طبق وشطف 10 سم مرة واحدة مع 10 مل بريوارميد PBS(-). تجاهل PBS(-) وإضافة 4 مل إنزيم الانفصال إلى الطبق. ضع الطبق في حاضنة₂ CO (حاضنة ثلاثي-الغاز يعمل ولكن ليس من الضروري) ل ~ 4 دقيقة حتى فصل خلايا من القاعدة إلى القمة. بلطف بيبيت خلايا صعودا وهبوطاً لجعل تعليق خلية واحدة.
5. نقل تعليق خلية واحدة هيبسك إلى أنبوب بريوارميد التي تحتوي على 5 مل المتوسطة دون Y27632 (الحجم الإجمالي في أنبوب 15 مل حوالي 9 مل). أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في درجة حرارة الغرفة، 300 غرام x لمدة 8 دقائق.
6. تجاهل المادة طافية وبيليه الخلية مع 10 مل المتوسطة المتوسطة بريوارميد التي تحتوي على Y27632 ريسوسبيند.
7. إزالة المجاميع الخلية باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر وتحديد كثافة الخلية باستخدام عداد كولتر.
8. تمييع تعليق خلية مع بريوارميد المتوسطة يكمل Y27632 لتحقيق 3.0 x 10⁶ خلايا في 10 مل لتطعيم طبق 10 سم المغلفة بالبروتين مصفوفة خارج الخلية. ضع الطبق الملقحين في حاضنة₂ شركة تراي-غاز (37 درجة مئوية، 6.5% O₂، 5% CO₂).
9. تغيير المتوسطة (mTeSR1 دون Y27632) كل يوم.

2-جيل هبجكلكس

ملاحظة: بدء الخطوات التالية عندما يصل إلى الخلايا هيبسك في صحن 10 سم (mTeSR1 المتوسطة والمصفوفة خارج الخلية المغلفة بالبروتين) إلى كونفلوينسي ~ 80% (حوالي 10 خلايا⁷ ).

إعداد أطباق المغلفة بالبروتين المصفوفة خارج الخلية (1 يوم)
1. ذوبان الجليد قاسمة واحد من البروتين المصفوفة خارج الخلية على الجليد وتمييع في 25 مل من المثلج DMEM/F12.
2. الاستغناء عن البروتين المصفوفة خارج الخلية المخففة للبئر 6 لوحات (1 مل/جيد). قاسمة واحدة غير كافية لمعطف الآبار 24 (4 لوحات). احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. يمكن مختومة لوحات المغلفة غير المستخدمة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
3. نضح المتوسطة من لوحات فورا قبل تطعيم هيبسكس معبي بلوريبوتينسي. فإنه ليس من الضروري غسل الصحون المغلفة مع المتوسطة أو PBS(-).
تلقيح هيبسكس بلوريبوتينسي معبي في لوحات المغلفة بالبروتين المصفوفة خارج الخلية (1 يوم)
1. تأخذ 4 مل إنزيم تفكك الخلية في أنبوب الطرد 15 مل وحجته في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
2. بريوارم 10 مل PBS(-) في الطرد مركزي 15 مل أنبوب > 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
3. إضافة ميليلتر 7 من 50 مم Y27632 (مثبط روك) إلى 35 مل mTeSR1 المتوسطة في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي. استخدام المتوسطة استكملت Y27632 في نفس اليوم. جعل أنبوبين لمجموع 70 مل المتوسطة يكمل Y27632 وبريوارم المتوسطة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
4. نضح المتوسطة القديمة من خلايا طبق وشطف 10 سم مرة واحدة مع 10 مل بريوارميد PBS(-). تجاهل PBS(-) وإضافة 4 مل إنزيم تفكك خلية للطبق. ضع الطبق في حاضنة₂ CO (حاضنة ثلاثي-الغاز يعمل ولكن ليس من الضروري) ل ~ 4 دقيقة حتى فصل خلايا من القاعدة إلى القمة. بلطف بيبيت خلايا صعودا وهبوطاً لجعل تعليق خلية واحدة.
5. نقل تعليق خلية واحدة هيبسك إلى أنبوب بريوارميد التي تحتوي على 10 مل Y27632 تكمل المتوسطة. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في درجة حرارة الغرفة، 300 غرام x لمدة 8 دقائق.
6. تجاهل المادة طافية وبيليه الخلية مع 10 مل المتوسطة يكمل Y27632 بريوارميد ريسوسبيند.
7. تصفية تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية (40 حجم المسام ميكرومتر) إزالة الركام الخلية وحساب عدد الخلايا باستخدام عداد كولتر.
8. تمييع هيبسك تعليق خلية مفردة إلى 5.0 × 10⁶ خلايا في المتوسط 50 مل تكمل Y27632 بريوارميد.
9. تطعيم تعليق خلية 2 مل (2.0 × 10⁵ خلايا) في كل بئر من ألواح 6-جيدا المغلفة (4 لوحات، الآبار 24). تأكد من أن الخلايا وتوزع بالتساوي في كل بئر. وضع لوحات ثقافة الخلية في حاضنة₂ شركة تراي-غاز (37 درجة مئوية، 6.5% O₂، 5% CO₂).
  ملاحظة: كثافة الخلايا العدوى والتوزيع حتى في كل جيدا أمرا حاسما. لأنه قد يسبب التطعيم هيبسكس في أطباق 10 سم كثافة الخلية أعلى بكثير منه في المناطق الأخرى. حتى الخلية كثافة هيبسكس خلية واحدة يمكن بسهولة أكبر مع لوحات 6-جيدا.
10. تغيير متوسطة مع 2 مل/بئر mTeSR1 (بدون Y27632) في 24 ساعة بعد التطعيم.
تحويل هيبسكس الدولة بلوريبوتينسي معبي إلى الخلايا pluripotent 4i-السذاجة (إيرك مستقلة) (يوم 3 و 4 اليوم)
1. إعداد 4i السذاجة كاملة بلوريبوتينسي المتوسطة في أنبوب 50 مل الطرد مركزي كما يلي (يوم 3 و 4 اليوم): 50 مل من 4i متوسطة القاعدية، 5 ميليلتر من 30 مم CHIR99021، 5 ميليلتر من 10 مم PD0325901، 5 ميليلتر من عيار 20 ملم BIRB796، 5 ميليلتر من 50 مم SP600125 ، و 5 ميليلتر من 50 مم Y27632.
  ملاحظة: تخزين 4i متوسطة القاعدية في-80 درجة مئوية وذوبان الجليد في ثلاجة بين عشية وضحاها. إعداد 4i الطازجة المتوسطة كاملة فورا قبل الاستخدام. تجنب التعرض للمواد الكيميائية 4i (شير و PD، بيرب و SP) إلى ضوء قوي. لا تقم بتخزين 4i كاملة متوسطة في 4 درجات مئوية أو المجمدة بين عشية وضحاها أو أطول.
2. بريوارميد الحارة 50 مل 4i المتوسطة كاملة في دفعة الماء 37 درجة مئوية لمتوسط التغير 15 دقيقة مع 4i المتوسطة كاملة (2 مل في البئر) في 48 و 72 ساعة بعد التطعيم. التوقيت الدقيق للتغير المتوسط مهم لتحقيق هبجكلك عالية الغلة وإمكانية تكرار نتائج تجريبية.
  ملاحظة: الكثافة لثقافة هيبسك 4i عالية تحت هذا الشرط وأصبح المتلاقية في 48-72 ساعة بعد التطعيم، ولكن هذا أمر طبيعي.
تشكيل المجلس التنفيذي باستخدام لوحات ميكروويل (5 يوم)
1. إعداد 50 مل من 4i المتوسطة كاملة في أنبوب 50 مل الطرد مركزي وبريوارم أنه في حمام مائي 37 درجة مئوية ~ 15 دقيقة قبل الاستخدام.
2. بريوارم 35 مل DMEM/F12 في أنبوب 50 مل الطرد مركزي في حمام مائي 37 درجة مئوية ~ 15 دقيقة قبل الاستخدام.
3. إعداد لوحة ميكروويل
  1. إضافة 5% (w/v) تصفية تعقيم Pluronic F-127 المنظفات في 8 آبار النشطة من لوحة ميكروويل (انظر الجدول للمواد؛ 0.5 مل/جيد).
  2. الطرد المركزي لوحة ميكروويل في درجة حرارة الغرفة، 1,000 س ز، لأدنى 5 ميكروويلس فحص مع مجهر مقلوب للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء. اترك لوحة ميكروويل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة معطف ميكروويلس مع المنظفات.
  3. تجاهل حل المنظفات من الآبار لصفيحة ميكروويل بابار بيبيتينج وشطف مع بريوارميد DMEM/F12 (2 مل في البئر).
  4. الطرد المركزي لوحة ميكروويل في درجة حرارة الغرفة، 1,000 ز x للحد الأدنى 5 ميكروويلس فحص مع مجهر مقلوب للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء.
    ملاحظة: عند ملاحظة فقاعات الهواء لا تزال في ميكروويلس، دراسة إذا ما زال راسخا التصاق الورقة ميكروويل إلى أسفل البئر.
  5. تجاهل DMEM/F12 من الآبار لصفيحة ميكروويل بابار بيبيتينج وشطف مع بريوارميد DMEM/F12 (2 مل في البئر).
  6. كرر الخطوات 2.4.3.3-2.4.3.4.
  7. إضافة 4i المتوسطة كاملة في الآبار مشطوف من لوحة ميكروويل (1 مل/جيد). تبقى متوسطة كاملة 4i المتبقية في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  8. الطرد المركزي لوحة ميكروويل في درجة حرارة الغرفة، 1,000 ز x للحد الأدنى 5 ميكروويلس فحص مع مجهر مقلوب للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء.
  9. ضع لوحة ميكروويل في حاضنة ثلاثي-غاز (37 درجة مئوية، س 6.5%₂، 5% CO₂) حتى تلقيح هيبسكس 4i.
4. تطعيم إيبسكس 4i في لوحة ميكروويل
  1. تأخذ 13 مل إنزيم تفكك الخلية في أنبوب الطرد 15 مل وحجته في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  2. بريوارم 50 مل PBS(-) في الطرد مركزي 50 مل أنبوب > 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  3. نضح المتوسطة القديمة من الآبار 24 من السذاجة هيبسك خلية الثقافة وشطف خلايا مرة واحدة مع بريوارميد 2 مل/جيدا PBS(-). تجاهل PBS(-) وإضافة 0.5 مل/كذلك تفكك الإنزيم. وضع لوحات ثقافة الخلية في حاضنة₂ CO (37 درجة مئوية) لمدة دقيقة ~ 4 حتى فصل خلايا من القاعدة إلى القمة. بلطف بيبيت خلايا صعودا وهبوطاً لجعل تعليق خلية واحدة.
  4. نقل تعليق خلية واحدة هيبسك إلى بريوارميد 20 مل 4i المتوسطة كاملة. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في درجة حرارة الغرفة، 300 غرام x لمدة 8 دقائق.
  5. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية مع 5 مل 4i بريوارميد المتوسطة كاملة.
  6. تصفية تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية (40 حجم المسام ميكرومتر) لإزالة الركام الخلية. خلية يغسل مصفاة 3 مرات مع 1 مل 4i بريوارميد المتوسطة كاملة. حساب عدد الخلايا باستخدام عداد كولتر.
  7. تمييع تعليق خلية مفردة من 4i هيبسكس السذاجة إلى 32.4 27.0 x 10⁶ خلايا في 9 مل 4i بريوارميد المتوسطة كاملة. نلاحظ أن المتوسط كاملة 4i يحتوي بالفعل على Y27632.
  8. أن لوحة ميكروويل التي تحتوي على 1 مل من 4i المتوسطة كاملة في 8 جيدا من حاضنة ثلاثي لغاز (2.4.3.9). تطعيم 1 مل 4i السذاجة هيبسك تعليق (3.0-3.6 × 10⁶ خلايا/جيد) في كل بئر. هذا كثافة الخلية أمر بالغ الأهمية. تأكد من أن الخلايا وتوزع بالتساوي في كل بئر بلطف بيبيتينج.
  9. الطرد المركزي لوحة ميكروويل في درجة حرارة الغرفة، 100 غ س لمدة 3 دقائق.
  10. ضع لوحة ميكروويل في حاضنة₂ شركة تراي-غاز (37 درجة مئوية، 6.5% O₂، 5% CO₂). عدم الإزعاج الخلايا القريبون في ميكروويلس. احتضان خلايا 24-30 ساعة. حضانة بين عشية وضحاها (~ 16 ساعة) غير كافية عادة لتشكيل الحديدية الضيقة.
نقل الحديدية إلى لوحات مرفق منخفضة لهزاز الثقافة (اليوم 6)
1. إعداد متوسطة هبجكلك كاملة في أنبوب الطرد مركزي 50 مل على النحو التالي (يوم 6-13 يوم):
  20 مل هبجكلك متوسطة القاعدية، ميكروليتر 4 مم 500 2-Mercaptoethanol، 50 ميكروليتر من 20 ملغ/مل حمض الأسكوربيك L، ميكروليتر 4 من 50 مم Y27632، 50 ميكروليتر من 100 ميكروغرام/مل BMP4 البشري المؤتلف، ميكروليتر 4 500 ميكروغرام/مل البشرية SCF، 4 ميكروليتر من 250 ميكروغرام/مل البشرية لو ، و 8 ميكروليتر من 250 ميكروغرام/مل ليف البشرية.
  ملاحظة: إعداد هبجكلك الطازجة المتوسطة كاملة قبل الاستخدام مباشرة، وتجنب التعرض للضوء. لا تقم بتخزين هبجكلك كاملة متوسطة في 4 درجات مئوية أو المجمدة بين عشية وضحاها أو أطول.
  ملاحظة: أن تركيز BMP4 مرتفع جداً. وقد تختلف تركيز BMP4 الأمثل بين دفعات BMP4. الفرق الكثير للكثير من BMP4 تؤثر بشدة على الإنتاج هبجكلك. في غياب BMP4 في المتوسط هبجكلك كاملة، هو عائد هبجكلكس منخفض جداً⁶. ووصف الصوراني حنا/⁶أهمية أخرى سيتوكين في المتوسط هبجكلك كاملة.
  ملاحظة: في هذا البروتوكول، تركيز ليف البشرية في المتوسط هبجكلك الكامل النهائي هو 100 نانوغرام/مل⁶^،¹⁰. وكان تركيز ليف النهائية المستخدمة في الدراسات المنشورة سابقا، بما في ذلك بلدنا، 1 ميكروغرام/مل. عندما يكون النشاط المحدد للبشرية ليف الكاشف > وحدات 10,000/ميكروغرام (₅₀ اد < 0.1 نانوغرام/ملليلتر)، 100 نانوغرام/مليلتر ليف كافية لدعم جيل هبجكلك من EBs.
2. نقل الحديدية
  1. بريوارم متوسطة القاعدية هبجكلك 5 مل و 20 مل هبجكلك المتوسطة كاملة > 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. بعناية بوضع مصفاة خلية رأسا على عقب فوق أنبوب 50 مل مخروطية البوليبروبيلين.
  3. بيبيت كل بئر ميكروويل بلطف جداً لوحة لوحة لفصل الحديدية من ميكروويلس. تصفية كافة المحتويات لكل بئر من خلال مصفاة خلية لإزالة الخلايا التي لم تدرج في الحديدية.
  4. أغسل الحديدية الإبقاء على مصفاة الخلية مع 1 مل متوسطة القاعدية هبجكلك بريوارميد. كرر بلطف الغسيل 5 مرات.
  5. الآن يتم الاحتفاظ الحديدية غسلها في الغشاء لمصفاة، الذي في أنبوب 50 مل مخروطية رأسا. وضع أنبوب مخروطي 50 مل جديدة على مصفاة خلية حيث يتم عادة وضع مصفاة الخلية في الأنبوب الجديد. ثم بسرعة عكس مصفاة الخلية مع أنبوب جديد. مصفاة الخلية والانبوب الآن في مواقف طبيعية، والحديدية أسفل الغشاء لمصفاة الخلية.
  6. جمع الحديدية في أنبوب مخروطي بإضافة 18 مل هبجكلك بريوارميد المتوسطة كاملة من فوق غشاء الخلية مصفاة. وهكذا، المتوسطة سوف تذهب من خلال الغشاء وجمع الحديدية التي تعلق على الجانب السفلي للغشاء وصولاً إلى الجزء السفلي من الأنبوب الطرد المركزي.
  7. لوحة تعليق الحديدية في آبار لصفيحة 6-جيدا منخفض-مرفق (3 مل/جيد).
  8. ضع لوحة منخفضة-مرفق على الروك متأرجحة-الانتقال في حاضنة ثلاثي-غاز (37 درجة مئوية، 6.5% O₂، 5% CO₂). تعيين سرعة هزاز في المنعطفات ~ 20 في الدقيقة.
    ملاحظة: لا يتم تطبيق حركة دوامات لتجميع الحديدية في وسط الآبار والصمامات. عناية ضبط سرعة هزاز حيث أن عدم تجميع الحديدية. هزاز قوي جداً جسديا سيضر الحديدية.
    ملاحظة: ينصح بشدة ضغط الأكسجين المنخفض للثقافة EB.
جيل هبجكلكس على سطح الحديدية (يوم 7-13 يوم)
إعداد 20 مل هبجكلك المتوسطة كاملة طازجة كل يوم. دون هزاز، ستغرق الحديدية على الجزء السفلي من الآبار في ~ 1 دقيقة إزالة المتوسطة القديمة دون تجفيف الحديدية (قد تبقى ~0.2 مل/البئر متوسطة القديمة) وإضافة المتوسطة كاملة هبجكلك جديدة كل يوم (3 مل/جيد).

3-المناعي تلطيخ من EBs (يوم 10-13 يوم)

تضمين الحديدية في كتل البروتين المصفوفة خارج الخلية لثابت فورمالدهايد، وجزءاً لا يتجزأ من البارافين إيمونوستينينج (فب)
1. لتحديد هبجكلكس ك OCT4⁺ الخلايا، وحصاد الحديدية في أنبوب منخفض--ربط ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. واسمحوا الحديدية تنزل إلى القاع أو بإيجاز الطرد المركزي (ثانيتين) عند درجة حرارة الغرفة وتجاهل المتوسطة. شطف الحديدية مع PBS(-) المثلج.
2. إزالة PBS(-) واحتضان الحديدية في 1 مل أزيد الصوديوم 1%(w/v) المثلج في PBS(-) لمدة 5 دقائق على الجليد. واسمحوا الحديدية تنزل إلى القاع أو بإيجاز الطرد المركزي (ثانيتين) عند درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية، وشطف الحديدية مع PBS(-) المثلج.
  ملاحظة: إضافة أزيد الصوديوم يبطئ تدهور البروتينات داخل الخلايا والنصوص الجيش الملكي النيبالي.
3. ذوبان الجليد 200 ميليلتر من البروتين المصفوفة خارج الخلية على الجليد، وإضافة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي التي تتضمن الحديدية. ترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة ~ 10 حتى هو توطد الهلام.
4. أضف 1 مل من 4% فورمالدهايد في PBS(-) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع هزاز لطيف.
  ملاحظة: كلاهما الحديدية والبروتين المصفوفة خارج الخلية يتم إصلاحها أثناء هذه الخطوة. دون التثبيت، قد تتحلل كتل هلام أثناء عملية الجفاف. إذا الحديدية الثابتة مسبقاً المضمنة في كتلة هلام، الحديدية يتم إصلاحها مرة أخرى مع كتلة هلام ويمكن أن تكون ثابتة الإفراط.
5. تجاهل فورمالدهايد، وشطف الحديدية مرة واحدة مع PBS(-) المثلج. أضف 1 مل إيثانول 70%. ويمكن تخزين الحديدية جزءا لا يتجزأ من جل في الإيثانول 70% في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد.
6. عملية الحديدية جزءا لا يتجزأ من جل مع بروتوكول FFPE قياسي. إعداد 5 ميكرومترات سمك FFPE الشرائح. واسمحوا الشرائح الجافة بين عشية وضحاها وتخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى إيمونوستينينج.
  ملاحظة: لدينا بروتوكول FFPE الروتينية على النحو التالي: 70% إيثانول، واثنين من التغييرات، 1 ساعة لكل منهما؛ الإيثانول 80%، تغيير واحد، 1 ساعة؛ إيثانول 95%، تغيير واحد، 1 ساعة؛ 100 ٪ الإيثانول، ثلاثة تغييرات، 1.5 ساعة لكل منهما؛ زيلين نفط، ثلاثة تغييرات، 1.5 ساعة لكل منهما؛ شمع البارافين (58-60 درجة مئوية) واثنين من التغييرات، 2 ساعة. مضمن في كتل البارافين الأنسجة المجففة وقطع في 3-10 ميكرومتر (عادة 5 ميكرومترات).
7. لتلوين، تماما الجاف للشرائح في الفرن 56 درجة مئوية على الأقل 30 دقيقة ديبارافينيزي وهيدرات الشرائح مع والزيلين وسلسلة متدرجة من الكحول. ثم يغسل الشرائح في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق.
8. لإلغاء تنشيط بيروكسيداسيس الذاتية، احتضان الشرائح امهاء مع "بلوكسال عرقلة الحل" في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم يغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
9. كتلة الشرائح مع "مصل الحصان العادي" (أو الأمصال العادية من سائر الأنواع التي تم إنشاؤها بالأجسام المضادة الثانوية) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
10. احتضان الشرائح مع جسم ماعز مكافحة--أكتوبر--3/4 الابتدائي المخفف مع جيش صرب البوسنة 0.1% في PBS(-) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (تحسين ظروف التخفيف وحضانة لكل جسم الأولية). ثم تغسل شرائح مع PBS(-) ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة، كل 5 دقائق.
11. احتضان الشرائح مع الماعز المضادة "مفتش" (الفجل البيروكسيديز مترافق جسم الثانوية التي تم إنشاؤها بواسطة الحصان؛ انظر الجدول للمواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم تغسل شرائح مع PBS(-) ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة، كل 5 دقائق.
12. مزيج المبالغ اللازمة الدأب تلطيخ ركائز (انظر الجدول للمواد) مباشرة قبل الاستخدام واحتضان الشرائح في الدأب كاملة تلطيخ الحل في درجة حرارة الغرفة "رصد البث الإذاعي الرقمي" تلطيخ 5 كحد أدنى باستخدام مجهر مقلوب التوقف عن رد فعل عندما OCT4⁺ الخلايا هي تصور بدهن الشرائح بسرعة في المياه المتدفقة من الصنبور.
13. يذوي الشرائح مع سلسلة متدرجة الكحول ووالزيلين. الشرائح جاهزة لالتقاط الليزر ميكروديسيكشن. إعداد الدائمة FFPE الشرائح باستخدام المتوسط التركيب (انظر الجدول للمواد) للملاحظات المجهرية ذات الدقة العالية.

4-نظام مراقبة الأصول الميدانية إثراء هبجكلكس من EBs (يوم 10-13 يوم)

إعداد إنزيم مزيج من "طقم تفارق الجسم امبريويد"
1. إعداد 1 ميكس الإنزيم بإضافة 50 ميليلتر "ف الإنزيم" إلى ميليلتر 1,900 X المخزن المؤقت ودوامه. 1 ميكس إنزيم بريوارم في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
2. إعداد 2 إنزيم المزيج بإضافة 10 ميليلتر إنزيم A إلى 20 ميليلتر Y المخزن المؤقت.
3. مزيج يمزج إنزيم 1 و 2 لإعداد "كاملة EB تفارق إنزيم ميكس".
الناي الحديدية
1. الحديدية الحصاد من لوحات مرفق منخفضة وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في أنبوب الطرد 15 مل، 300 س ز 2 كحد أدنى لتجاهل المادة طافية وريسوسبيند الحديدية مع 10 مل PBS(-). أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
2. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الحديدية مع "مزيج إنزيم تفارق EB كاملة" (4.1.3). احتضان تعليق اجتماع المجلس التنفيذي في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة حتى يتم فصلها الحديدية. أثناء الحضانة، بلطف بيبيت الحديدية في كل 3-5 دقائق لتسهيل الانفصال. بدلاً من ذلك، استخدام ديسوسياتور الآلي مع "برنامج تفارق الجسم امبريويد".
3. إضافة مل 8 المثلج PBS(-) إلى تعليق خلية EB منفصلان. تصفية تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية 40 ميكرومتر. مصفاة خلية يغسل مع 1 مل PBS(-) المثلج ثلاث مرات.
4. حساب عدد الخلايا في تعليق الخلية التي تمت تصفيتها باستخدام عداد كولتر.
5. الطرد المركزي من تعليق خلية في الساعة 4 درجات مئوية، 300 غرام x لمدة 8 دقائق وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية مع المثلج 10 مل PBS(-).
6. تقسيم الخلية تعليق أنابيب اثنين، واحد لتلطيخ لا تحكم (الخلايا⁵ ~ 10) وأخرى لمكافحة--CD38 تلطيخ (كافة الخلايا المتبقية).
7. الطرد المركزي اثنان أنابيب عند 4 درجة مئوية، 300 غرام x لمدة 8 دقائق.
تلوين CD38 المضادة ونظام مراقبة الأصول الميدانية إثراء هبجكلكس
1. ريسوسبيند بيليه خلية لتلطيخ لا تحكم مع 200 ميليلتر المثلج 3% (w/v) جيش صرب البوسنة وأزيد الصوديوم 1% (w/v) في PBS(-). ضع على الجليد حتى التدفق الخلوي.
  ملاحظة: إضافة أزيد الصوديوم يبطئ تدخيل CD38 من سطح الخلية.
2. ريسوسبيند بيليه خلية لمكافحة--CD38 تلطيخ المثلج 3% (w/v) جيش صرب البوسنة وأزيد الصوديوم 1% (w/v) في PBS(-) إلى 1 × 10⁶ خلايا للواحد 100 ميليلتر.
3. إضافة 10 ميليلتر الواحدة 1 × 10⁶ خلايا من نظام مراقبة الأصول الميدانية الصف، جسم CD38 المضادة مترافق APC. تغطية الأنبوب مع رقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع هزاز لطيف.
4. إضافة 5 مل المثلج PBS(-) وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 300 × ز للدقيقة 8 تجاهل المادة طافية وخلية ريسوسبيند بيليه مع 5 مل PBS(-) المثلج. تكرار الغسيل مع PBS(-) ثلاث مرات في المجموع.
5. ريسوسبيند بيليه الخلية مع أزيد الصوديوم ميكروليتر المثلج 3% (w/v) جيش صرب البوسنة و 1% (w/v) 500 في PBS(-) بكثافة خلية ملائمة لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
6. إثراء هبجكلكس ك CD38⁺ الخلايا، التي عادة ما تشكل خلية التمييز بوضوح بين السكان. استخدام عنصر التحكم لا تلطيخ لضمان تحديد هوية CD38⁺ الخلايا. هي الغلة نموذجية من هبجكلكس 1-5% من جميع خلايا مفردة دراسة نظام مراقبة الأصول الميدانية من "يوم 10 الحديدية" و 20-40 ٪ من "يوم 13 الحديدية".

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لوحة ميكروويل المستخدمة هنا في تنسيق 24-جيدا وقد 8 آبار عقد الأوراق ميكروويل، كل منها يدعم تشكيل يصل إلى 1200 الحديدية. من حوالي 24 مليون من 4i السذاجة بلوريبوتينسي الخلايا، تولد هذه اللوحة ميكروويل عادة ~ 8,000 الحديدية تتكون من خلايا ~ 3,000 الواحدة EB. خلال ثقافة غير ملتصقة الحديدية مع التأرجح المستمر، يتناقص عدد الحديدية سليمة تدريجيا بسبب تفكيك ذاتية عفوية، و 000 3 ~ الحديدية البقاء على قيد الحياة حتى اليوم 13 من البروتوكول. أن معظم هؤلاء الباقين على قيد الحياة الحديدية هبجكلكس 50-200 على سطحها (المقدر بالكشف المناعي OCT4 + الخلايا في مسلسل أبواب الحديدية؛ انظر الشكل 8)، الغلة ~ 100,000 OCT4 + هبجكلكس في المجموع. الهضم الأنزيمي للحديدية إلى الخلايا المفردة عملية غير فعالة نسبيا، خفض محصول CD38 أثري نظام مراقبة الأصول الميدانية + هبجكلكس للخلايا 9,000-47,000. في أيدينا، كان في متوسط ستة دفعات مستقلة لكن متتالية من تجارب ± 14,038 5,731 (يعني ± ووزارة شؤون المرأة). لأن الخلايا خلايا EB CD38 سالب التعبير مرناً OCT4 (qPCR) أو البروتين (إيمونوهيستوتشيميستري) فقط ضعيفة جداً، أن لم يكن تماما غائبة، جميع EB خلايا بقوة معربا عن البروتين OCT4 عمليا أي ما يعادل مجموع سكان CD38 + هبجكلكس.

تتضمن المعلمة الحاسمة لهذا البروتوكول كثافة الخلية. عندما يتم تلقيح 2.0 × 10⁵ إيبسكس البشرية في مصفوفة خارج الخلية البروتين المغلفة جيدا للخلية 6-بئر الثقافة لوحة (منطقة النمو² سم 9.60 كل بئر) مع 2 مل Y27632 تكمل المتوسطة (2.2.9)، الخلايا ستصل إلى حوالي 20-30% كونفلوينسي في 24 ساعة بعد التلقيح (الشكل 1). بعد ثقافة 24 ساعة إضافية في المتوسط mTeSR1 في غياب Y7632 وخلايا الكلي وشكل المستعمرات، الاحتلال ~ 30% منطقة النمو (الشكل 2). ثم تستزرع خلايا في الأجل المتوسط إعادة برمجة 4i (2.3.2). وبعد 24 ساعة ثقافة في روافد 4i الخلايا تصبح متوسطة، (الشكل 3). ثقافة 24 ساعة إضافية في المتوسط 4i يجعل الخلايا المزدحمة (الشكل 4). التوقيت الدقيق لكثافة الخلية وتغير متوسط (كل 24 ساعة +/-4 ساعات) ذات أهمية حاسمة لنجاح تشكيل الحديدية وهبجكلكس.

بعد 48 ساعة الثقافة في المتوسط 4i، فصل الخلايا وتلقيح للوحة ميكروويل، التي لديها آبار 400 ميكرومتر في الحجم (2.4). على الرغم من أن هذه اللوحة ميكروويل المتاحة تجارياً هي مغلفة ليوصي بالتصاق منخفضة السطح حسب الشركة المصنعة، الطازجة إعادة طلاء مع المنظفات (2.4.3) الحد من خطر التصاق الخلايا غير المرغوب فيها. 800 ميكرون ميكروويلس أدى إلى انخفاض العائد من هبجكلكس، مما يشير إلى أهمية حجم المجلس التنفيذي للتمايز موجهة بشكل صحيح. وسوف تشكل خلايا تلقيح في المتوسط 4i الحديدية في ميكروويلس في ساعات 24-30، والتي يمكن ملاحظتها باستخدام المعيار، مقلوب مجهر تباين المرحلة (الشكل 5). كفاف دائرية من الحديدية أصبحت واضحة للعيان وبعد 24 ساعة من الحضانة. حصاد الحديدية في وقت سابق (مثلاً 16 ساعة بعد التطعيم) غير مستحسن قبل على المنحنى الدائري مرئية بوضوح لهذه الحديدية معرضة جداً للأضرار الميكانيكية وتفكيكها بسهولة. علما بأن كميات كبيرة من السذاجة هيبسكس ليست مدرجة في الحديدية، التي طبيعية. هذه الخلايا الفردية سوف تكون جرفت قبل الشروع في هزاز ثقافة الحديدية على سطح منخفض-تمسكا (2.5.2). لاحظ أيضا أنه لدينا بروتوكول، تتشكل الحديدية في المتوسط بلوريبوتينسي السذاجة 4i-ليس في المتوسط هبجكلك. ما قبل تشكيل الحديدية الصلبة في المتوسط 4i قبل التعرض إلى متوسط هبجكلك مهم لتوزيع هبجكلكس على سطح الحديدية.

تحتفظ الحديدية في المتوسط هبجكلك تحت هزاز، شرط الثقافة غير ملتصقة ستحافظ على شكلها كروي دون التجميع أو الانصهار(الرقم 6 و الرقم 7). جداً سوف يسبب ضعف هزاز شرط EB التجميع والانصهار، ولكن ظروف قاسية جداً سيتم تفكيك الحديدية. لا تظهر بجكلكس البشرية كخلايا معربا عن OCT4 على سطح الحديدية بعد أقرب ثقافة 5 أيام في المتوسط هبجكلك، وعلى زيادة عدد حتى الثقافة 8 أيام (الشكل 8). قد يسبب احتضان المزيد من الحديدية تفكيك الحديدية وفقدان هبجكلكس. يمكن إثراء البشرية بجكلكس من انزيماتيكالي منفصلان EB الخلايا بعد 5-8 أيام ثقافة في المتوسط هبجكلك بنظام مراقبة الأصول الميدانية ك CD38 + الخلايا (الشكل 9).

figure-results-1
رقم 1: اللجنة التوجيهية البشرية خلية ثقافة في تكملة Y27632 المتوسطة 24 ساعة بعد التطعيم. كثافة الخلية هو حوالي 20-30% المتلاقية. حضور مثبط روك Y27632، تميل الخلايا ينتشر جيدا مع استطالة طويلة، مثل ارتفاع. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-2
رقم 2: زراعة الخلايا البشرية [ايبسك] 48 ساعة بعد التطعيم. خلايا الكلي للمستعمرات النموذج، الاحتلال ~ 30% ناحية النمو. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-3
الشكل 3: زراعة الخلايا البشرية اللجنة التوجيهية المحتضنة في المتوسط 4i إعادة برمجة لمدة 24 ساعة. الخلايا تصل إلى كونفلوينسي. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-4
الشكل 4: اللجنة التوجيهية البشرية خلية ثقافة المحتضنة في المتوسط 4i إعادة برمجة لمدة 48 ساعة. هي خلايا المتلاقية المزدحمة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-5
الرقم 5: اللجنة التوجيهية البشرية شكلت الحديدية في ميكروويلس بعد حضانة 24 ساعة في 4i إعادة برمجة المتوسطة- كفاف دائرية من الحديدية تصبح مرئية في 24-30 ساعة بعد التطعيم. عندما يتم تأكيد الكفاف تحت مجهر تباين المرحلة، على استعداد لنقل إلى حالة ثقافة هزاز الحديدية. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-6
رقم 6: اللجنة التوجيهية البشرية الحديدية المحتضنة لمدة 24 ساعة في المتوسط هبجكلك. الحديدية الحفاظ إلى حد كبير على شكلها كروي. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-7
رقم 7: اللجنة التوجيهية البشرية المحتضنة الحديدية 192 ساعة في المتوسط هبجكلك. يتم توسيع الحديدية مقارنة بمظهرها في الثقافة 24 ساعة، ولكن أنها لا تزال إلى حد كبير الحفاظ على الأشكال الكروية مع لا التجميع أو الانصهار. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-8
الشكل 8: يتم ترجمة بجكلكس البشرية معربا عن OCT4 على سطح هيبسك الحديدية المحتضنة 192 ساعة في المتوسط هبجكلك. الحديدية كانت جزءا لا يتجزأ من البروتين المصفوفة خارج الخلية وتجهيزها للشريحة فب المناعي تلطيخ من OCT4 (الركيزة الدأب). مقياس بار = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-9
الشكل 9: بجكلكس البشرية هي إثراء من انزيماتيكالي منفصلان EB الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية ك CD38⁺ الخلايا. بعد الحضانة في المتوسط هبجكلك لمدة 5-8 أيام، يمكن أن تنفصل الحديدية بالهضم الأنزيمي لإعداد تعليق خلية مفردة. يمكن إثراء هبجكلكس ك CD38⁺ الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية (النقاط الحمراء). EB الخلايا التي لا تعبر عن CD38 (تكون هذه النقاط زرقاء) ينبغي أن تجمع أيضا كمراقبة سلبية. يجب فصل نظام مراقبة الأصول الميدانية بوابات الخلايا CD38-الإيجابية والسلبية CD38 مع هامش واسع لتفادي التلوث من كل نوع من الخلايا (النقاط الخضراء). لوحات العلوي والسفلي إظهار التشكيلات الجانبية لنظام مراقبة الأصول الميدانية دون أو مع الأجسام المضادة-CD38 تلطيخ، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إنتاج قوي من هبجكلكس استخدام بروتوكول الموصوفة هنا تأكدت باستنساخ المستقل ثلاثة من إيبسكس البشرية مع تناذر ضعفاني العادية¹⁰. استنساخ هذه اللجنة التوجيهية مستمدة من نفس جلد الإنسان عن طريق الجلد الولدان تنتجها الخلايا الليفية خلية الثقافة¹⁰. أنها ستقدم مؤلفين من هذه المادة إلى المحققين بناء على طلبها وفي إطار اتفاق نقل المواد الملائمة والشحن ترتيب الخلايا البشرية الحية المجمدة. من غير المعروف حاليا ما إذا كان تناذر العادية المطلوبة لإنتاج هبجكلك قوية باستخدام بروتوكول لدينا أو تلك التي أبلغ عنها بغيرها من المختبرات.

وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن إنتاج هبجكلكس من هيبسكس¹¹ أو بتوليدا¹⁴ استخدام بروتوكول وصف سيتو للفريق التابع لجامعة كيوتو⁸ مرهون بالتعبير عن اوميسوديرمين، تي-مربع عامل نسخ المطلوبة تحريض SOX17. ويبدو SOX17 تعمل كنسب رئيسية تحديد عامل النسخ في germline تمايز الخلايا الجذعية pluripotent البشرية⁶. يتم ترميز اوميسوديرمين بالجينات اومس ، وخروج المغلوب كريسبر/Cas9 من اومس تسبب غياب شبه كامل لتحريض SOX17 في هبجكلك المنتجة للشرط¹¹، والتعبير عن جينات أخرى تتبع نفس النمط من خلايا فارغة SOX17 بالضربة القاضية. أوفيريكسبريسيون اوميسوديرمين من متجه إيندوسيبلي في اوميس--إنقاذ خلايا فارغة بالضربة القاضية خلال الثقافة التعريفي هبجكلك كفاءة الإنتاج هبجكلك قوية فضلا عن تحريض الجينات الخط، بما في ذلك SOX17. وفي المقابل، أنقذ المستحث أوفيريكسبريشن SOX17 أيضا إنتاج بجكلك قوية ولكن دون حمل اومس. وهكذا، اوميسوديرمين محفز المراحل الأولى حرجة من SOX17، ويبدو أن هذا أهم دور واحد من اوميسوديرمين في تحريض هبجكلك من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية. لدينا بروتوكول يدفع SOX17 في هيبسكس¹⁰، ولكن اعتماده على الاستقراء اوميسوديرميني ينتظر أن يتحدد.

يحول هذا البروتوكول بلوريبوتينسي معبي إيبسكس البشرية الحفاظ على المتوسط mTeSR1 بلوريبوتينسي السذاجة إيرك مستقلة لمدة 96 ساعة في 4i إعادة برمجة متوسطة⁶، الذي هو بالسذاجة تعديل خلايا الجذعية بشرية متوسطة (نهسم)⁵. محاولاتنا لتوليد هبجكلكس بدءاً من استنساخ البشر اللجنة التوجيهية نفس ولكن الاحتفاظ بها في غيرها من وسائط النمو اللجنة التوجيهية البشرية المتاحة تجارياً قبل الثقافة في 4i إعادة برمجة المتوسطة أدى إلى تدني هبجكلك المحاصيل بدرجات متفاوتة. على الرغم من أن تحدد ما إذا كان يحسن إنتاج هبجكلك التكيف الأطول أجلاً في وسائل الإعلام الأخرى أو لا يبقى في الدراسات المستقبلية، وهذه الملاحظة تشير إلى أن الدولة الدقيق من بلوريبوتينسي معبي من إيبسكس البشرية قبل 4i إلى حد كبير في إعادة برمجة آثار تشكيل المجلس التنفيذي في المتوسط 4i والتمايز EB في المتوسط هبجكلك.

إنتاج هبجكلكس من هيبسكس بعد أن البروتوكول قوية وعالية استنساخه، جزئيا نتيجة لاستخدام لوحات ميكروويل التي تمكن الإنتاج الفعال لعدد كبير من EBs (~ 8,000 الحديدية كل دفعة) مع حجم موحد (هيبسكس 3,000 الواحدة EB). قد يكون عدد الحديدية سهولة إنتاجها في دفعة واحدة من التجربة باستخدام بروتوكول لدينا أكبر بكثير من أساليب استخدام الآبار ثقافة الخلية أسفل يو العادية. إنتاج عدد كبير من نفس القدر من الحجم الحديدية المرصعة موحد مع هبجكلكس قد توفر فرصاً فريدة للفحوص الكيميائية الفائق لتحديد وسائل تفعيل صغيرة الوزن الجزيئي أو الموانع التي تؤثر على مواصفات PGC أو بهم الخصائص البيولوجية مثل إعادة برمجة جينية. هذه الحديدية قد تكون مفيدة لتقييم السمية عدد كبير من germline سميات الخلية، بما في ذلك الملوثات البيئية بل والأدوية الموصوفة طبيا أيضا مثل وكلاء العلاج الكيميائي أيضا.

وتشمل العوامل الحاسمة لإنتاج قوية واستنساخه من هبجكلكس استخدام بروتوكول قدم (ط) استخدام هيبسكس صحية الاحتفاظ بها في mTeSR1 على البروتين المصفوفة خارج الخلية، (الثاني) لتطعيم العدد الدقيق للخلايا كما هو محدد وصارم اتبع أوقات التغير المتوسط وثقافة فرعية، (ثالثا) لتحديد الكثير جيدة BMP4 الماشوب البشري، و (رابعا) لتقليل الأضرار الجسدية للحديدية خلال ثقافة هزاز. فمن خلال تجربتنا التي عملت الكثير أفضل من كاشف BMP4 100 نانوغرام/مليلتر تركيز بينما الأخرى الكثير من الكواشف BMP4 المطلوب 2 X أو جرعات أكبر. العائد من هبجكلكس استخدام الإنتاج الكثير أفضل من BMP4 بدلاً من ذلك انخفضت في جرعات أعلى من BMP4 من ناحية أخرى (مثلاً 200 نانوغرام/ملليلتر). نوصي باختبار عدة الكثير مختلفة من المؤتلف الكواشف BMP4 البشرية التي تم الحصول عليها من بائعين متعددين لأدائها في دعم جيل هبجكلك وتأمين كمية كبيرة من الكثير أفضل.

ميزة فريدة من نوعها لدينا بروتوكول هبجكلك أن يتم ترجمة هبجكلكس على الطبقة السطحية الأبعد الحديدية¹⁰ (الشكل 8)، بينما يمكن أن تولد البروتوكولات الأخرى هبجكلكس في منتصف الخلية المجاميع⁶^،⁸. الهيئات امبريويد تميل إلى تكوين طبقات متميزة متعددة مثل السطح والغلاف الخارجي وشل الداخلية والأساسية، وغالباً ما تكون المناطق الأساسية المركزية نخرية نظراً لمحدودية العرض من المغذيات والأوكسجين، فضلا عن الباقين على قيد الحياة للمحترفين عوامل النمو قدمت نموذج ثقافة المتوسطة بنشر²⁰. قد يكون من المفيد للتعرض المباشر، تسيطر عليها الوقت والجرعة من هبجكلكس للأدوية أو المواد السامة لتعريب هبجكلكس على سطح الحديدية دون قيود ممكنة نظراً لمحدودية نشر نحو مركز الحديدية الدوائية أو الدراسات السمية.

بينما التحكم الماوس بجكلكس إظهار قوية على نطاق الجينوم الحمض النووي ديميثيلاتيون المتعلقة الطباعة المناطق جزئيا على الأقل⁷^،^،من¹⁹²⁰درجة demethylation جدنا العالمية في هبجكلكس يبدو أضعف من الماوس بجكلكس أو بجكس⁶^،⁷. ترانسكريبتومال الملامح تشير إلى أن هبجكلكس قد تتشابه في مرحلة مبكرة من بجكس الجنينية من الماوس بجكلكس¹⁰. وذكر أن ثقافة الحديدية تحت ظروف الإنتاج هبجكلك طويلة بسبب درجة زيادة من جدنا demethylation⁷؛ ومع ذلك، ما إذا كانت فترة ممتدة من ثقافة هبجكلكس الحديدية أو كخلايا معزولة يمكن تحقيق المراحل الأكثر تقدما من التمايز germline يحتاج إلى تحددها الدراسات المستقبلية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونعترف Yawata شيومي واللجنة Owa للمساعدة التقنية من خلال الدراسات الأولية. تم دعم هذه الدراسة نيس/المعاهد الوطنية للصحة منح R01 ES023316 و R21ES024861 للملخص، ومنحة مضيفات معهد البحوث الطبية (فامري) إلى جه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي> مهيأ متعدد القدرات hiPSC ثقافة< / قوي>
Matrigel	Corning	354277	Aliquot Matrigel بالحجم الذي أشارت إليه الشركة المصنعة (حوالي 200 مو ؛ ل). استخدم الأنابيب الباردة. يخزن في -80 درجة ؛ C
DMEM / F-12	Thermo Fisher Scientific	21041-025	يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
mTeSR1	STEMCELL Technologies	85850	إعادة التكوين عن طريق إضافة مكمل 5X إلى الوسط الأساسي. يمكن تخزين الوسط المعاد تكوينه عند 4 درجات. C لمدة تصل إلى 4 أسابيع دون التأثير على أداء زراعة الخلايا.
Y27632	محور عصبي	1683	تمييع 5 ملغ Y27632 (ميغاواط 320.26) مع 312.2 & لتر ماء لتحضير محلول مخزون 50 ملي مولار Y27632. تعقيم بالترشيح (0.22 مو ؛ م). Aliquot 20 & mu ؛ L / أنبوب × 15 أنبوب وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	07930	يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
الخلايا المبتكرة	Accutase	AT104-500	إنزيم تفكك الخلية ؛ aliquot 40 مل / أنبوب × 12 أنبوب وتخزينها في -20 درجة مئوية.
<قوي>الاسم	<قوي>الشركة	رقم الكتالوج	تعليقات
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1286101
KnockOut	Replacement Thermo Fisher Scientific	10828028	Aliquot 40 مل / أنبوب × 12 أنبوب وتخزينه في -20 درجة مئوية.
البنسلين - الستربتومايسين - الجلوتامين (100x)	10378016		ثيرمو فيشر العلمي
(100x)	11140050		الحراري
العلمي من البنكرياس البقري	Sigma-Aldrich	I1882-100MG	أضف 0.1 مل من حمض الخليك الجليدي إلى 10 مل من الماء. تعقيم بالترشيح (0.22 أم). تمييع 100 مجم مسحوق الأنسولين المجفف بالتجميد مع الماء المحمض البارد 10 مل لصنع محلول مخزون 10 مجم / مل. Aliquot 650 & L / أنبوب × 15 أنبوب وتخزينه في -80 درجة مئوية.
الإنسان LIF	PeproTech	300-05	إعادة تشكيل 250 & mu; ز LIF البشري مع 250 مو ؛ لتر ماء. أضف 750 مو ؛ L من 0.1٪ ألبومين مصل الأبقار في PBS (-) لصنع 250 مو ؛ جم / مل من محلول مخزون LIF البشري. النشاط المحدد لهذا المنتج هو >10,000 وحدة/&مو؛ غ. Aliquot 40 ul / أنبوب × 25 أنبوب وتخزينه في -80 درجة مئوية.
FGF2 R &	D Systems	4114-TC	إعادة تشكيل 1 ملغ FGF2 البشري مع 5 مل PBS (-) لصنع 200 مو ؛ جم / مل محلول مخزون FGF2 البشري. Aliquot 100 & mu L / أنبوب × 50 أنبوب وتخزينه في -80 درجة مئوية.
TGF البشري - بيتا ؛ 1	PeproTech	100-21	Reconstitite 50 & mu ؛ ز مع 50 مو ؛ L من 10 ملي مولار حامض الستريك (درجة الحموضة 3.0). أضف 150 مو ؛ L من 0.1٪ ألبومين مصل الأبقار في PBS (-) لصنع 250 مو ؛ جم / مل TGF البشري - بيتا ؛ 1 حل مخزون. Aliquot 4 & mu; L / أنبوب × 50 أنبوب وتخزينه في -80 درجة مئوية.
4i الوسط			امزج الكواشف التالية لعمل 4i الوسط القاعدي. 500 مل من KnockOut DMEM 100 مل من استبدال مصل خروج المغلوب 6 مل من البنسلين الستربتومايسين الجلوتامين (100x) 6 مل من محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100x) 650 & micro ؛ L من 10 ملغم/مل الأنسولين من البنكرياس البقري 40 & L من 250 & جم / مل LIF البشري 20 & micro ؛ ل من 200 & ميكرو; جم / مل FGF2 4 & micro ؛ ل من 250 & جم / مل TGF البشري - بيتا ؛ 1 Aliquots 40 مل / أنبوب وتخزينها في -80 درجة مئوية.
CHIR99021	محور عصبي	1386	إعادة تكوين 25 ملغ CHIR99021 (ميغاواط 465.34) مع 1791 & L DMSO لصنع 30 ملي مولار CHIR99021 محلول المخزون. Aliquot 50 & mu ؛ L / أنبوب × 35 أنبوب وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
PD0325901	محور عصبي	1408	إعادة تكوين 5 ملغ PD0325901 (ميغاواط 482.19) مع 1037 & L DMSO لصنع 10 ملي مولار PD0325901 محلول المخزون. Aliquot 50 & mu ؛ L / أنبوب × 20 أنبوب وتخزينه في -20 درجة مئوية.
BIRB796	محور عصبي	1358	إعادة تكوين 10 ملغ BIRB796 (ميغاواط 527.66) مع 948 & L DMSO لصنع 20 ملي مولار BIRB796 محلول المخزون. Aliquot 50 & mu ؛ L / أنبوب × 18 أنبوب وتخزينه في -20 درجة مئوية.
SP600125	Tocris	1496	إعادة تكوين 10 ملغ SP600125 (MW220.23) مع 908 & mu; L DMSO لصنع 50 ملي مولار SP600125 حل المخزون. Aliquot 50 & mu ؛ L / أنبوب × 18 أنبوب وتخزينه في -20 درجة مئوية.
AggreWell400	STEMCELL Technologies	27845	لوحة Microwell
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	إعادة تكوين 5 جم من Pluronic F-127 في 100 مل من الماء لصنع محلول مخزون Pluronic F127 بنسبة 5٪ (وزن / حجم). تعقيم بالترشيح (0.22 أم). عليقوت 50 مل / أنبوب × 2 أنبوب وتخزينه في r.t.
<قوي>الاسم	<قوي>الشركة	Catalog Number	Comments
hPGCLC culture
Glasgow' s MEM	Thermo Fisher Scientific	11710035
بيروفات الصوديوم (100 ملم)	Thermo Fisher Scientific	11360070
البنسلين ستربتومايسين (100x)	Corning	30-002-CI
hPGCLC الوسط			امزج الكواشف التالية لصنع hPGCLC الوسط القاعدي. 500 مل من غلاسكو ' s MEM 75 مل من مصل المغلوب البديل 6 مل من محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (100x) 6 مل من 100 مل بيروفات الصوديوم 6 مل من البنسلين الستربتومايسين (x100) Aliquots 40 مل / أنبوب وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	تمييع 350 مو ؛ L 2-Mercaptoethanol (14.3 M) في 9.65 مل PBS (-) لصنع محلول مخزون 500 ملي مولار 2-Mercaptoethanol. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
حمض الأسكوربيك	سيجما ألدريتش	A4544	يعيد تكوين 400 مجم من حمض الأسكوربيك مع 20 مل من الماء لصنع محلول مخزون حمض الأسكوربيك 20 مجم / مل. تعقيم بالترشيح (0.22 أم). Aliquot 500 & L / أنبوب × 40 أنبوب وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
BMP4 R والمؤتلف البشري	D Systems	314-BP	إعادة تكوين 1 مجم مؤتلف BMP4 البشري مع 10 مل من 4 ملي حمض الهيدروكلوريك aq. لصنع 100 مو ؛ جم / مل حل مخزون BMP4 البشري المؤتلف. Aliquot 250 & mu ؛ L / أنبوب × 40 أنبوب وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
الإنسان SCF	PeproTech	300-07	إعادة التكوين 250 & mu; ز SCF البشري مع 500 مو ؛ L من 0.1٪ ألبومين مصل الأبقار في PBS (-) لصنع 500 مو ؛ جم / مل من محلول مخزون SCF البشري. Aliquot 35 & mu; L / أنبوب × 14 أنبوب وتخزينه في -80 درجة مئوية.
EGF البشري	PeproTech	AF-100-15	إعادة تكوين 1 ملغ من EGF البشري مع 1 مل من 0.1٪ ألبومين مصل البقر في PBS (-) لصنع 1 مجم / مل من محلول مخزون EGF البشري. ألقوت 100 & L / أنبوب × 10 أنابيب. تمييع 100 مو ؛ L من 1 مجم / مل محلول مخزون EGF البشري مع 300 مو ؛ L من 0.1٪ ألبومين مصل الأبقار في PBS (-) لصنع 250 مو ؛ جم / مل حل مخزون إنسان EGF. Aliquot 20 & mu; L / أنبوب × 20 أنبوب. يخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
مصفاة الخلية	Corning	352340	حجم المسام = 40 مو ؛ م.
50 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلين	Corning	352070
لوحة مرفقة منخفضة	Corning	3471
Vari-Mix Platform Rocker	Thermofisher	M79735Q<
strong>Name< / strong>	Company< / strong>	Catalog Number< / strong>	Comments< / strong>
<قوي> تلطيخ كيميائي مناعي < / قوي>
BLOXALL حجب الحل	VECTOR	SP-6000
مصل الحصان العادي ImmPRESS كاشف مضاد للماعز IgG	ناقلات	MP-7405
أكتوبر -3/4 الجسم المضاد	سانتا كروز	SC-8629
ImmPACT DAB	VECTOR	SK-4105
Permount	Thermofisher	SP15-100	تصاعد متوسط
<قوي>الاسم	><قوي>الشركة	رقم الكتالوج	تعليقات
عزل hPGCLC
Geneped Dissociation	Miltenyi Biotec	130-096-348
الجسم المضاد المضاد ل CD38 مترافق مع APC	abcam	ab134399

تقنيات Sum محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية الأنسولين القاعدي القاعدي Embryoid Kit

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. How to make a primordial germ cell. Development. 141 (2), Cambridge, England. 245-252 (2014).
Saitou, M., Yamaji, M. Primordial germ cells in mice. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375(2012).
De Felici, M. Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells. Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).
Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).
Gafni, O., Weinberger, L., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).
von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification. Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).
Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).
Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).
Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).
Kojima, Y., Sasaki, K., et al. Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).
Irie, N., Surani, M. A. Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), Clifton, N.J. 217-226 (2017).
Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice. Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).
Chen, D., Liu, W., et al. Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin. Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).
Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146 (4), 519-532 (2011).
Kobayashi, T., Zhang, H., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).
Choi, J., Huebner, A. J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).
Shirane, K., Kurimoto, K., et al. Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells. Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BMP4 FACS CD38 OCT4 iPSC

جيل من البشرية البدائية الخلية الجرثومية مثل الخلايا على سطح الهيئات امبريويد من بلوريبوتينسي جاهزة للانفجار الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة