Method Article

تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

DOI:

10.3791/58298

⸱

January 23rd, 2019

 ,  ,  , 
1RNA Biology Laboratory, RIKEN, 2RNA Systems Biochemistry Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research, 3Laboratory for Phyloinformatics, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 4RNA Biology Laboratory, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 5Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة للترادف الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (تشيب-Seq) التي تمكن من تحليل الخلية-نوع معين على نطاق الجينوم هستون تعديل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنظيم جينية يلعب الأدوار المركزية في التعبير الجيني. منذ اكتشفت هستون تعديل في الستينات، بوظائفها الفسيولوجية والمرضية وقد درست على نطاق واسع. والواقع أن ثورة ظهور الجيل التالي تسلسل العميق وإيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) عن طريق محددة هستون تعديل الأجسام المضادة رأينا التنظيم جينية عبر الجينوم. على العكس من ذلك، الأنسجة وعادة ما تتألف من أنواع الخلايا المختلفة، وعن خليط معقد تحديات تحليلية للتحقيق في ابيجينومي في نوع خلية معينة. لمعالجة حالة الكروماتين الخاصة بنوع الخلية في طريقة على نطاق الجينوم، وضعنا مؤخرا جنبا إلى جنب الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (تشيب-Seq)، الذي يرتكز على تنقية انتقائية من الكروماتين بالبروتينات هستون المعلمة الأساسية من الخلية أنواع المصالح، متبوعاً بما يليها رقاقة والهدف من هذا البروتوكول هو الأخذ بممارسات أفضل لما يليها تشيب هذا الأسلوب يوفر أداة متعددة الاستخدامات للتحقيق ابيجينومي الخاصة بالانسجة في التعديلات هيستون المتنوعة ونموذج الكائنات الحية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون أنسجة حيوانات من أنواع مختلفة من الخلايا. تنظيم الجينات في كل خلية يعرف نوع الخلية. التعديلات الكروماتين-الحمض النووي مثلايشن وهستون تعديل-تكمن وراء خصوصية خلية من نوع التعبير الجيني. وهكذا، قد تم المطلوب قياس التنظيم جينية في كل نوع من أنواع الخلايا، ولكن كان تحديا تقنيا.

للتحقيق في التخلق في نوع خلية معينة، كان جنبا إلى جنب الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (تشيب-Seq) وضعت مؤخرا (رقم 1)1. في تشيب، يعبر عن معلم حانمه الأساسية هيستون البروتين H2B من مروج الخلية-نوع معين. تسمح هذه الميزة لعزل تشروماتينس من الخلايا ذات الاهتمام، على الرغم من أن المواد يبدأ من خليط أنواع مختلفة من الخلايا. رقاقة-Seq التالية — تنقية الكروماتين عبر مارك هستون تعديل والجيل التالي تسلسل العميق لعزل الحمض النووي – يمكننا رصد حالة جينية من نوع الخلية المستهدفة بطريقة المجين على نطاق المنظومة.

باستخدام هذا الأسلوب، ونحن مؤخرا التحقيق تريميثيليشن الخاصة بالخلايا العصبية من هستون البروتين H3 على يسين 4 (H3K4me3) علامات. في تلك الدراسة، قمنا بتطوير تدق بماوس في أي ج-الميؤوس من شفائهم H2B معلم العلم وأعرب البروتين عند اقترانها بوساطة لجنة المساواة العرقية (Rosa26كاج فلوكسيد-السلطة الفلسطينية H2B العلم). بالعبور بماوس حيازة الجينات الشبكة (ER) Cre اندوبلاسميك تحت سيطرة المروج CamK2a، المستحث السطر الماوس التي يتم الحصول عليها العلم H2B في الخلايا العصبية نشطة على تاموكسيفن حقن (Camk2aالعلم H2B)1. بدءاً من دماغ السطر الماوس ثابتة، أجرينا Seq تشيب مع الأجسام المضادة H3K4me3. إذ كثيرا ما تتوافق مع علامات H3K4me3 إلى مناطق المروج، يمكن أن نكتشف مئات مرناس أعرب على وجه التحديد في الخلايا العصبية1.

هنا، يمكننا وصف أسلوب Seq تشيب نموذجية التي تغطي الخطوات من تشريح الأنسجة لبناء مكتبة (رقم 1). والهدف النهائي من هذا البروتوكول حصة لدينا أفضل الممارسات من أجل أداء Seq تشيب وتطبيق هذا الأسلوب مستقبلا للتعديلات هيستون وأنواع الخلايا الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافقت عليه شعبة السلامة بتبريد (H27-EP071) جميع الأساليب الموضحة هنا وأجريت مع اللوائح والمبادئ التوجيهية ذات الصلة.

1. تشريح الأنسجة

  1. تشريح أنسجة المصلحة إلى قطع صغيرة (تقريبا < 3 مم2) استخدام مقص الربيع الجميلة.
    ملاحظة: أكبر الأنسجة شظايا يستغرق وقتاً أطول لتجميد، وسيحمل قطع صغيرة على كميات أكبر من المخزن المؤقت، والتي قد تؤثر على النتائج.
  2. إضافة أجزاء تشريح الأنسجة إلى حاوية نظيفة مليئة بسائل النيتروجين وجمعها في أنابيب 2 مل (1 قطعة كل أنبوب) مملوءة بالنتروجين السائل.
    ملاحظة: ينصح أنابيب مع سطح ماء لهذه الخطوة.
  3. ضع الأنابيب في-80 درجة مئوية > 5 دقائق مع سقف مفتوح يتبخر النيتروجين السائل المتبقية.
    ملاحظة: بعد إغلاق الغطاء، شظايا الأنسجة يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية لمدة شهر واحد قبل الاستخدام.

2. تثبيت الخلية

ملاحظة: نحن نستخدم طاحونة مبردة مفيد لهذه الخطوة. ويمكن استخدام جهاز بديل.

  1. أنابيب المكان 2 مل من البروتين المنخفض ملزمة تحتوي على عينات الأنسجة على رف معدني جليد مبردة في نيتروجين سائل.
  2. ضع عيار 1.5 مل-الأنبوبة والبرد مع النتروجين السائل. وضعه على رفوف معدنية الجليد.
  3. فتح مل 2-الأنبوب ووضع رصاصة معدنية بريشيليد في الأنبوب. إغلاق الغطاء وتعيين مل 2-الأنابيب في حامل أنبوب من طاحونة المبردة مفيد وتراجع فورا صاحب الأنبوبة المجمعة في النتروجين السائل لمدة 1 دقيقة.
  4. إدراج حامل أنبوب المجمدة في الكاسيت الخارجي من طاحونة المبردة مفيد واهتز بشدة 60 مرة لمدة 30 ثانية.
  5. تفكيك حامل الأنبوب وإزالة رصاصة معدنية بريشيليد مكان 2 مل-الأنبوبة على عينة أكثر برودة في-20 درجة مئوية.
  6. ضع العينة برودة في-20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لمنع تجميد مثبت في الخطوة التالية.
  7. إحضار العينة برودة على مقاعد البدلاء وفتح غطاء الأنبوب التنقيط ميليلتر 900 من 1% فورمالدهايد فورا في ذلك. وبعد بيبيتينج عدة مرات، نقل التعليق إلى جديد 2 مل-الأنبوب الذي يحتوي على 900 ميليلتر من 1% فورمالدهايد والإصلاح لمدة 10 دقيقة مع تناوب لطيف في حاضنة في 23 درجة مئوية.
    تنبيه: الفورمالدهيد السامة والضارة.
  8. للتوقف عن رد فعل التثبيت، إضافة 100 ميليلتر من 2.5 م جليكاين إلى كل أنبوب وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3,000 ز x عند 4 درجة مئوية. تجاهل المادة طافية.
  9. أضف 1 مل من المثلج مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3,000 ز x عند 4 درجة مئوية، وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرتين (يغسل 3 في المجموع).
    ملاحظة: يمكن عينات ثابتة فلاش المجمدة بالنتروجين السائل والمخزنة في-80 درجة مئوية.
  10. إضافة 500 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت 1 (حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك 50 ملم 4 (حبيس)-كوه (درجة الحموضة 7.5)، 140 ملم كلوريد الصوديوم، 1 مم الإيثيلين حمض (يدتا) (pH 8.0)، 10% w/v والغليسيرول، 0.5% w/v NP-40، 0.25% w/v تريتون X-100، و 0.1 x مثبط البروتياز كوكتيل) لبيليه، بيبيت عدة مرات، واستدارة لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: ينبغي تصفيتها تحلل المخزن المؤقت 1 والمخزنة في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
  11. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3,000 ز x عند 4 درجة مئوية وتجاهل المادة طافية.
  12. أضف 1 مل من تحلل المخزن المؤقت 2 (10 ملم تريس-HCl (pH 8.0)، 200 ملم كلوريد الصوديوم، 1 مم يدتا (pH 8.0)، 0.5 مم عطا، و 0.1 × مثبطات البروتياز كوكتيل) لبيليه، دوامة، واستدارة لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: ينبغي تصفيتها تحلل العازلة 2 والمخزنة في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
  13. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3,000 ز x عند 4 درجة مئوية وتجاهل المادة طافية.
  14. إضافة 800 ميليلتر راديويمونوبريسيبيتيشن المقايسة (ريبا) المخزن المؤقت مع مثبط البروتياز 1 x كوكتيل لبيليه وريسوسبيند بيليه بيبيتينج.
  15. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3,000 ز x عند 4 درجة مئوية وتجاهل المادة طافية.
  16. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت ريبا مع مثبط البروتياز x 1 كوكتيل.
  17. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3,000 ز x عند 4 درجة مئوية وتجاهل المادة طافية.
  18. أضف 1 مل من المخزن المؤقت ريبا مع مثبط البروتياز x 1 كوكتيل. فورا للانتقال إلى الخطوة التالية.

3-الكروماتين القص

  1. نقل إلى أنبوب سونيكاتور وثم ضع الأنبوبة في أولتراسونيكاتور.
  2. إمالة الكروماتين بالإعدادات التالية: درجة الحرارة: 4 درجة مئوية؛ ذروة السلطة الحادث: 175 ث؛ عامل واجب: 10%؛ دورات/انفجار: 200؛ والوقت: 2,400 s.
  3. نقل العينة إلى 1.5 مل من البروتين ملزمة منخفضة أنبوب وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية.
  4. جمع المادة طافية في أنبوب ملزمة منخفضة بروتين جديد.
    ملاحظة: العينة يمكن تجميد فلاش في النتروجين السائل وتخزينها في-80 درجة مئوية.

4-نوعية فحص للحمض النووي (عكس Crosslinking)

  1. ميكس 20 ميليلتر من وميليلتر 180 شرائح شطف المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl (pH 8.0)، 300 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم يدتا (pH 8.0)، و 1% w/v دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)) في أنبوب بوليميريز سلسلة من ردود فعل (PCR). احتضان العينة عند 65 درجة مئوية في cycler حرارية ح 6 مع غطاء cycler الحرارية مفتوحة. الحفاظ على غطاء فتح cycler الحرارية لتجنب الإفراط تمسخ.
    ملاحظة: يجب تصفية المخزن المؤقت شطف رقاقة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال. ويمكن تمديد هذه الحضانة بين عشية وضحاها.
  2. أضف 1 ميليلتر من 10 ملغ/مل رناسي، دوامة، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. إضافة ميليلتر 6.5 من 15 ملغ/مل بروتيناز ك، ودوامه، واحتضان في 55 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  4. نقل رد فعل على أنبوب ربط منخفضا الحمض النووي، وإضافة 4 ميليلتر من الجليكوجين 5 ملغ/مل، ودوامه. ثم إضافة 200 ميليلتر من الكحول الفينول/كلوروفورم/إيسواميل (25:24:1) وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 18,000 س ز في درجة حرارة الغرفة.
  5. نقل المادة طافية إلى أنبوب ملزمة منخفضا الحمض النووي جديد. إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت تريس-يدتا-كلوريد الصوديوم (10 ملم تريس-HCl (pH 8.0)، 1 يدتا (pH 8.0)، و 200 ملم كلوريد الصوديوم) المتبقية الكحول الفينول/كلوروفورم/إيسواميل الحل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 18,000 س ز في درجة حرارة الغرفة. جمع المادة طافية وخلط مع المادة الأولى طافية.
  6. إضافة 900 ميليلتر من الإيثانول المثلج واحتضانها ح 1 في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تمديد هذه الحضانة إلى 4-6 ح.
  7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 18,000 س ز في 4 درجات مئوية.
  8. تجاهل المادة طافية. أضف 1 مل من المثلج 75% إيثانول بيليه والطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 18,000 س ز في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة (يغسل اثنين في المجموع).
  9. تجاهل المادة طافية دقة وأيردري لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. إضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) ويحل الحمض النووي بحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، أو عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تجنب فورتيكسينج أو بيبيتينج. إبقاء هذا الحمض النووي "المدخلات" واستخدامه لإعداد مكتبة إذا لزم الأمر.
  11. قياس تركيز الحمض النووي مع فلوروميتير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر الجدول المواد)، والتحقق من توزيع حجم مع جهاز التفريد موائع جزيئية (انظر بيانات تمثيلية هو مبين في الشكل 2A)-10 استخدام الحرس الوطني أو أقل الحمض النووي لهذا التحليل.
    ملاحظة: ينبغي أن تشكل أجزاء من 100 – 500 زوج قاعدي (bp) في 50% أو أكثر من الحمض النووي.

5-انجذاب تطهير بالأجسام المضادة العلم

ملاحظة: للعصبية تشيب-Seq، أنسجة المخ من الفئران 8 يتم استخدامها عادة عينة واحدة من تشيب Seq لإعداد 2 نانوغرام لتنقية الحمض النووي بتنقية المناعي جنبا إلى جنب (راجع الخطوة 7، 1). في أيدينا، 0.1 نانوغرام من الحمض النووي لا تزال تقدم عالية الجودة مكتبات الحمض النووي لرقاقة-Seq (كادوتا، غير منشورة). وهكذا، من الناحية النظرية، ماوس واحدة قد تكون كافية لأداء الخلايا العصبية تشيب--ما يليها المبلغ المطلوب ينبغي أن يكون الأمثل لنوع الأنسجة والخلايا للفائدة. لمراقبة إيمومونو-تنقية التجربة السلبية، ينبغي إعداد أنسجة المخ ليساتي من الفئران دون أي تعبير H2B-العلم واستخدامها.

  1. "الماصة؛" 200 ميليلتر من الخرز المغناطيسي مترافق للأغنام الماوس المضادة غلوبيولين مناعي G (IgG) في أنبوب ملزمة منخفضة بروتين.
  2. ضع الأنبوب على موقف مغناطيسية والانتظار لمدة 1 دقيقة للمادة طافية لتصبح واضحة. تجاهل المادة طافية، وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني المثلج، ودوامه. كرر هذه الخطوة (يغسل اثنين في المجموع).
  3. إضافة 20 ميليلتر من الأجسام المضادة العلم 1 ملغ/مل وتدوير ح 5 في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن تمديد هذه الحضانة بين عشية وضحاها.
  4. أغسل حبات بعد "الخطوة 5، 2". ضع الخرز في أنبوب 15 مل.
  5. ريسوسبيند الخرز في ميليلتر 1110 ريبا المخزن المؤقت ثم قم بإضافة ميليلتر 900 10 × حجب الكاشف، 180 ميليلتر من 50 × الحل دينهارت، 10 ميليلتر من 100 × مثبطات البروتياز كوكتيل و 6.8 مل من إعدادها في الخطوة 3. تقسيم هذا الخليط في أنابيب ملزمة منخفضة البروتين 5. تدوير ح 6 في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن تمديد هذه الحضانة بين عشية وضحاها.
  6. ضع الأنبوب على موقف المغناطيسية والانتظار لمدة 1 دقيقة للمادة طافية لتصبح واضحة. تجاهل المادة طافية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمعهد الملكي، وتخلط برفق. كرر هذه الخطوة 5 مرات (6 يغسل في المجموع). تجمع جميع الخرز في أنبوب ملزمة منخفضة بروتين وحيد.
  7. إضافة 200 ميليلتر من "الرقائق العازلة شطف" وتدوير لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. التحقق من جودة الحمض النووي كما هو موضح في الخطوة 4، 11 (انظر بيانات تمثيلية هو مبين في الشكل 2 وج). فورا للانتقال إلى الخطوة التالية.

6-انجذاب تطهير الأجسام المضادة H3K4me3 وعكس كروسلينكينج

ملاحظة: التالي حبة إعداد الخطوات (6، 1 – 6، 4) ينبغي أن يقوم قبل 5.7 خطوة.

  1. "الماصة؛" ميليلتر 40 من حبات مغناطيسية مترافق للأغنام الماوس المضادة مفتش في أنبوب 2 مل-بروتين ملزمة منخفضة.
  2. ضع الأنبوب على موقف المغناطيسية والانتظار لمدة 1 دقيقة للمادة طافية لتصبح واضحة. تجاهل المادة طافية وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني المثلج وتخلط برفق. كرر هذه الخطوة (يغسل اثنين في المجموع).
  3. إضافة 4 ميليلتر من الأجسام المضادة-H3K4me3 1 ملغ/مل وتدوير ح 6 في 4 درجات مئوية.
  4. أغسل حبات بعد "الخطوة 6، 2". ضع الخرز في أنبوب 2 مل من بروتين ملزمة منخفضة.
  5. ريسوسبيند الخرز في ميليلتر 1558 ريبا المخزن المؤقت ثم قم بإضافة 200 ميليلتر من 10 × حجب كاشف ميليلتر 40 50 × الحل دينهارت، 2 ميليلتر من 100 × مثبطات البروتياز كوكتيل و 200 ميليلتر من النذرة إعدادها في "الخطوة 5، 7". تدوير بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: الحزب الديمقراطي الصربي في المخزن المؤقت شطف رقاقة قد تضعف أكثر من 10 مرات في هذه الحضانة.
  6. ضع الأنبوب على موقف المغناطيسية والانتظار لمدة 1 دقيقة للمادة طافية لتصبح واضحة. تجاهل المادة طافية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمعهد الملكي، وتخلط برفق. كرر هذه الخطوة 4 مرات (يغسل 5 في المجموع). بعد يغسل الماضي، نقل الخرز في أنبوب ملزمة منخفضا الحمض النووي، وتجاهل المادة طافية.
  7. إضافة 200 ميليلتر من "الرقائق العازلة شطف" وتدوير لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل النذرة بيندينجتوبي منخفضا الحمض النووي جديد.
    ملاحظة: يمكن تخزين النذرة في-80 درجة مئوية.
  8. اتبع الخطوة 4 ديكروسلينكينج من الحمض النووي. ريسوسبيند الحمض النووي المنقاة في 20 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات.
  9. التحقق من جودة الحمض النووي كما هو موضح في الخطوة 4.11 (انظر بيانات تمثيلية هو موضح في الشكل 2D). (اختياري) إجراء تحليل لتخصيب اليورانيوم قبل PCR كمي كما هو موضح سابقا2. عشرة إضعاف أو ينبغي التقيد بتخصيب أكبر.

7-مكتبة البناء

  1. لكل المدخلات وعينه "رقاقة الحمض النووي"، بحساب نسبة الحمض النووي في المنطقة 100 – 500-بي بي باستخدام وظيفة البرنامج تحليل لطاخة للجهاز الكهربي موائع جزيئية. تقدير حجم العينة المطلوبة للحصول على 2 نانوغرام من 100 – 500 bp الحمض النووي. استخدام 20 نانوغرام الدنا في نطاق 100-500-بي بي كالعينة "الإدخال".
  2. "الماصة؛" عينات من الحمض النووي في أنابيب PCR 8-قطاع وإضافة ح2س لتحقيق الحجم الإجمالي إلى 10 ميليلتر. (اختياري) إذا كان حجم الحمض النووي يتجاوز 10 ميليلتر، الارتقاء بشكل متناسب رد فعل الإصلاح نهاية التالية واختيار حجم.
  3. إعداد الإصلاح نهاية ميكس الرئيسية (انظر الجدول للمواد). إضافة 4 ميليلتر من مزيج الرئيسي الإصلاح نهاية للحمض النووي، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية.
  4. إضافة 36 ميليلتر من 10 ملم تريس-Cl، الأس الهيدروجيني 8.5 و 0.6 x حجم (30 ميليلتر) الصلبة المرحلة تجميد عكسها (سبري) المغناطيسي الخرز واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. ضع الأنبوب على الوقوف مغناطيسية والانتظار حتى يصبح من الواضح المادة طافية.
  6. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وإضافة 1.2 x أحجام (60 ميليلتر) سبري المغناطيسي الخرز، واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. ضع الأنبوب على الوقوف مغناطيسية والانتظار حتى يصبح من الواضح المادة طافية.
  8. أغسل حبات مرتين مع 200 ميليلتر من 80% EtOH، عقد الأنبوب لا يزال على المغناطيس.
  9. باختصار الطرد المركزي على أنبوب لجمع EtOH المتبقية في الجزء السفلي ووضعه مرة أخرى على المغناطيس. إزالة EtOH المتبقية دقة.
  10. اترك غطاء أنبوب مفتوحة لمدة 1-2 دقيقة للسماح EtOH تتبخر.
  11. إغلاق الغطاء وإبقاء الأنبوب على الجليد.
    ملاحظة: الآن كنت قد حصلت على اختيار حجم الحمض النووي من 100 – 500 bp في الخرز. يمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل حول تحديد حجم مزدوج على موقع الويب الخاص بالشركة المصنعة (www.beckman.com).
  12. إعداد ماجستير أ-تراجع مزيج (انظر الجدول للمواد).
  13. ريسوسبيند الخرز (من الخطوة 7.10) مع 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي A-تراجع واحتضان لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية.
  14. إضافة إلى 1.8 x حجم (18 ميليلتر) من البولي إيثيلين غليكول (شماعة)/محلول كلوريد الصوديوم واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  15. اتبع الخطوات 7.7 7.11 لتنقية الحمض النووي.
  16. إعداد مزيج ربط المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد).
  17. "الماصة؛" 8 ميليلتر من ربط المخزن المؤقت ميكس على الخرز (من 7.14 خطوة) وإضافة 1 ميليلتر من 1 ميكرومتر محول ريسوسبيند الخرز. استخدم 1 ميليلتر من 5 ميكرومتر المحول للحصول على نموذج الإدخال. النظر في استخدام محولات مختلفة لكل عينة للإرسال المتعدد.
  18. أضف 1 ميليلتر من "ليجاسى الحمض النووي" واحتضان لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية.
  19. إضافة المجلد x 1.0 (10 ميليلتر) حل الوتد/كلوريد الصوديوم، ريسوسبيند الخرز، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  20. اتبع الخطوات 7.7 7.10 لتنقية الحمض النووي.
  21. "الماصة؛" 25 ميليلتر من 10 ملم تريس-Cl، الأس الهيدروجيني 8.5 في الأنبوب والخرز ريسوسبيند.
  22. إضافة إلى حجم x 1.0 (25 ميليلتر) حل الوتد/كلوريد الصوديوم، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  23. اتبع الخطوات 7.7 7.10 لتنقية الحمض النووي.
  24. "الماصة؛" ميليلتر 11 مم 10 تريس-Cl، الأس الهيدروجيني 8.5 في الأنبوب والخرز ريسوسبيند.
  25. ضع الأنبوب على الوقوف مغناطيسية والانتظار حتى يصبح من الواضح المادة طافية.
  26. جمع المادة طافية في أنبوب بكر 8-قطاع جديد.
  27. إعداد مزيج الرئيسي PCR الوقت الحقيقي (انظر المواد للحصول على التفاصيل).
  28. "الماصة؛" ميليلتر 8.5 في الوقت الحقيقي PCR مزيج الرئيسي في صفيحة بكر (qPCR) كمية 384-جيدا وإضافة 1.5 ميليلتر محول متصلة الحمض النووي (من 7.26 الخطوة).
  29. "الماصة؛" 10 ميليلتر لكل معيار الفلورسنت في الآبار فارغة.
  30. إجراء PCR الوقت الحقيقي مع البرنامج التالي: (98 درجة مئوية ل 45 s) × 1 دورة، (98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 s، 72 درجة مئوية لمدة 30 s) × 20 دورات، و (72 درجة مئوية مقابل 60 s) × 1 دورة.
  31. تحديد عدد دورات PCR اللازمة للوصول إلى كثافة الأسفار 2 القياسية الفلورسنت.
  32. إعداد سيد بكر مزيج (انظر الجدول للمواد).
  33. "الماصة؛" 11.5 ميليلتر من مزيج PCR الرئيسي في الدنا متصلة محول المتبقية (من الخطوة 7.26) وأداء بكر كما هو مبين في "الخطوة 7، 30" مع دورات بكر مصممة في 7.31 خطوة.
  34. إضافة إلى حجم x 1.0 (20 ميليلتر) حل الوتد/كلوريد الصوديوم واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  35. اتبع الخطوات 7.7 7.10 لتنقية الحمض النووي.
  36. "الماصة؛" 20 ميليلتر من 10 ملم تريس-Cl، الأس الهيدروجيني 8.5 في الأنبوب والخرز ريسوسبيند.
  37. ضع الأنبوب على الوقوف مغناطيسية والانتظار حتى يصبح من الواضح المادة طافية.
  38. جمع المادة طافية في أنبوب 1.5 مل-الحمض النووي منخفض ملزمة جديدة.
  39. التحقق من جودة المكتبة كما هو موضح في الخطوة 4، 11 (انظر بيانات تمثيلية هو مبين في الشكل 2 هاء وواو). استخدم 1 ميليلتر من عينات الحمض النووي مكتبة. (اختياري) إجراء تحليل لتخصيب اليورانيوم قبل قبكر كما هو موضح سابقا 2. عشرة إضعاف أو ينبغي التقيد بتخصيب أكبر.

8-تسلسل

  1. تسلسل المكتبات في التسلسل الجيل التالي (انظر بيانات تمثيلية هو موضح في الشكل 3).
    ملاحظة: تسلسل عمق كاف لتحليل البيانات سوف تختلف تبعاً لحجم جينوم الكائن الحي3. لحقوق الإنسان، والماوس، نوصي بالحصول على مالا يقل عن 20 مليون واحد في نهاية القراءة. وفقا لحصيلة ما يلي، الإرسال المتعدد قد تكون فعالة من حيث التكلفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن تصف تشريح الأنسجة، تثبيت، وتحلل الخلية، تنقية جنبا إلى جنب من الكروماتين، وإعداد مكتبة الحمض النووي للتعاقب الجيل القادم. أثناء الإجراءات، يمكن اختبار واحد نوعية الحمض النووي، الذي هو مفتاح لتسلسل النجاح، في خطوات متعددة (الشكل 2). منذ نوكليوسومي واحد عادة محاط ب الحمض النووي bp 147 4، يجب أن لا أقصر من أن الحجم الحمض النووي المنفصمة. فور ultrasonication، عزل الحمض النووي وتشغيلها على جهاز التفريد موائع جزيئية (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان لدينا بروتوكول الأمثل للخلايا العصبية للدماغ الماوس، وفيه التعبير عن معلم العلم H2B هو الناجم عن الحقن بعقار تاموكسيفين. المروجين المستخدمة للتعبير H2B وانطلاق مواد الأنسجة وكمية الأنسجة معلمات محورية لنجاح تشيب--ما يليها وبالتالي، ينبغي النظر في الاستفادة المثلى من هذه العوامل لكل خلية نوع من الفائدة.

خطوة حاسمة بين الإجراءات المستخدمة في هذا البروتوكول هو الحمض النووي القص لتحقيق طول الكروماتين من 100-500 bp5. بشكل عام، هو التحدي بتوحيد هذه الخطوة ultrasonication...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر جميع أعضاء المختبر ايواساكي لقراءة نقدية من المخطوطة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا معونات "البحث العلمي" في "مجالات مبتكرة" (26113005 # للتعطيل و JP17H05679 للصك القانوني)؛ معونات للعلماء الشباب (أ) (JP17H04998 للصك القانوني) من وزارة التربية والتعليم والعلوم، والرياضة، والثقافة من اليابان (يأمرون)؛ والمشاريع بيونيرينج "تطور الهاتف الخلوي"، وجميع المشاريع بتبريد "المرض وابيجينومي" من بتبريد (للتعطيل والصك القانوني).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أنبوب بروتين LoBind ، 2 ملEppendorfNo.  ؛ 0030108132لتحلل الخلايا
أنبوب بروتين LoBind ، 1.5 ملEppendorfNo.  ؛ 0030108116لإعداد ChIP والمكتبة
DNA LoBind ، 1.5 ملEppendorfNo.  ؛ 0030108051لإعداد ChIP والمكتبة
PCR 8 شرائطBIO-BIK3247-00لإعداد ChIP والمكتبة
مطحنة SKTOKKENSK-200طاحونة مبردة يدوية لصنع مسحوق الخلية للتثبيت
رصاصة معدنيةTOKKENSK-100-DLC10ملحق مطحنة SK
2 مل أنبوب من الفولاذ المقاوم للصدأTOKKENTK-AM5-SUSخيار للخلية تحلل
2 مل حامل أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأTOKKENSK-100-TLخيار لتحلل الخلايا
16٪ فورمالديهايد (وزن / حجم) ، خالي من الميثانولبيرس28906لإصلاح الخلايا. تحضير محلول 1٪ قبل الاستخدام.
GlycineNacalai Tesque17109-35قم بإعداد 2.5 M مخزون
D-PBS (-) (1x)Nacalai Tesque14249-24لغسل المحلل والحمض النووي المنقى
HEPESNacalai Tesque02443-05للمخزن المؤقت للتحلل 1. تحضير 1 م ، درجة الحموضة 7.5 مخزون.
5 M كلوريد الصوديوم ، درجة البيولوجيا الجزيئيةNacalai Tesque06900-14لمخزن التحلل 1 ، المخزن المؤقت للتحلل 2 ، المخزن المؤقت للشطف ChIP ، و Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA ، درجة البيولوجيا الجزيئيةWako Pure Chemical Industries، Ltd.311-90075للمخزن المؤقت للتحلل 1 ، ومحلول التحلل 2 ، والمخزن المؤقت للشطف ChIP ، و Tris-EDTA-NaCl
Buffer GlycerolWako Pure Chemical Industries، Ltd.072-04945للمخزن المؤقت للتحلل 1
NP-40Nacalai Tesque25223-75للمخزن المؤقت للتحلل 1
Triton X-100 ، درجة البيولوجيا الجزيئيةNacalai Tesque12967-32للمخزن المؤقت للتحلل 1
TrisNacalai Tesque35406-91لمخزن التحلل 2 ، ومخزن Elution ChIP ، و Tris-EDTA-NaCl Buffer. تحضير 1 م ، مرق الرقم الهيدروجيني 8.0.
0.1 M EGTA درجة الحموضة المحايدةNacalai Tesque08947-35ل Lysis Buffer 2
كوكتيل مثبط البروتياز (100x)Nacalai Tesque25955-24لمنع تدهور البروتين
RIPA BufferThermo Fisher Scientific89900لتحلل الخلايا وغسلها
milliTUBE 1 مل AFA الأليافCovaris520130أنبوب Sonicator. ملحق من الموجات فوق الصوتية المركزة
الموجات فوق الصوتية التركيز على الموجات فوق الصوتيةCovarisS220 أو E220لهضم الحمض النووي إلى حجم مناسب ل ChIP-Seq
UltraPure 10٪ SDSThermo Fisher Scientific15553-027ل ChIP Elution Buffer
RNase ANacalai Tesque30141-14لتنقية الحمض النووي من محللة
Proteinase K ، المؤتلف ، PCR GradeSigma-Aldrich3115887001لتنقية الحمض النووي من الإيثانول
واكو للصناعات الكيميائية النقية المحدودة.054-07225اصنع 70٪ محلول
أحادي النسيلة المضاد ل FLAG M2 الأجسام المضادة المنتجة في الفأرSigma-AldrichF1804لتنقية الكروماتين المعبر عنه في الخلايا ذات الأهمية
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgGThermo Fisher Scientific11201Dيمكن استخدام هذا في مكافحة FLAG IP ومكافحة H3K4me3 IP
المضادة ثلاثي الميثيل هيستون H3 (K4) ، الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأرWako Pure Chemical Industries، Ltd.301-34811أي جسم مضاد آخر يعمل لتحليل ChIP سيعمل
10x كاشف الحجبSigma-Aldrich11096176001للحظر أثناء تنقية
التقارب Denhardt ' s solutionNacalai Tesque10727-74للحجب أثناء تنقية التقارب
الجليكوجين (5 مجم / مل)Thermo Fisher ScientificAM9510لتنقية الحمض النووي من محللة
كيوبيت 2.0 مقياسالفلور الحراري فيشر العلميQ32866لتقدير كمية الحمض النووي المعزول
Qubit dsDNA HSالفحص Thermo Fisher ScientificQ32851لقياس الحمض النووي المعزول
أنبوب 0.5 ملAxygen10011-830للقياس الكمي بواسطة Qubit
Phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1)Nacalai Tesque25970-56لتنقية الحمض النووي من
حبات AMPure XPBeckman CoulterA63881SPRI الخرز المغناطيسي لإعداد المكتبة
رف ثلج معدنيFunakoshiIR-1للحفاظ على محللة الخلية المجمدة
يساعد مبرد العينةNew England BiolabsT7771Sفي إصلاح الخلايا بأقل قدر من الضرر
2100 BioanalyzerAgilentTechnologies G2939BAللتحقق من جودة شظايا الحمض النووي المعزولة. يمكن استخدام محلل شظايا آخر.
Bioanalyzer 2100 Expert SoftwareAgilentTechnologies G2946CAالحساسية للمحلل الحيوي
Agilent Technologies5067-4626للتحقق من جودة شظايا الحمض النووي المعزولة ،
مكتبة KAPA LTPRoche07961898001مزود بمخزن مؤقت لإصلاح نهاية KAPA 10x ، ومزيج إنزيم الإصلاح النهائي KAPA ، ومخزن KAPA A-Tailing Buffer ، وإنزيم KAPA A-Tailing ، و KAPA Ligation Buffer ، و KAPA DNA Ligase ، ومحلول PEG / NaCl
NEXTflex DNA BarcodesBIOO ScientificNOVA-514101Adapter لإعداد المكتبة. مزود بمحولات الباركود DNA ومزيج التمهيدي.
KAPA Real-Time Library Amplification KitRoche07959028001مزودة ب 2x KAPA HiFi HS Real-time PCR Master Mix و PCR Primer Mix و
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKM2602لإعداد المكتبة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون هذا الإنزيم مطلوبا لمجموعة تضخيم مكتبة KAPA في الوقت الفعلي
Buffer EBQiagen1908610 mM Tris-Cl ، درجة الحموضة 8.5 لشطف لوحة الحمض النووي
386 جيدا qPCRThermo Fisher Scientific4309849ل PCR في الوقت الفعلي
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific4485701لتحديد كمية فيلم لاصق بصري MicroAmp للحمض النووي
4311971 Thermo Fisher Scientificل PCR
MicroAmp في الوقت الحقيقي فيلم لاصق شفافThermo Fisher Scientific4306311لختم الألواح
مزيج رئيسيللإصلاح النهائي يجمع بين 1.4 وميكرو ؛ L من 10x KAPA نهاية إصلاح المخزن المؤقت ، 1 & micro ؛ L من مزيج إنزيم إصلاح نهاية KAPA ، و 1.6 & L من H2< / sub>O
A-taling مزيجيجمع بين 1 & micro; L من KAPA A-Tailing Buffer ، 0.6 & micro ؛ L من KAPA A-Tailing Enzyme ، و 8.4 & micro ؛ L من H2< / sub>O
عازلة ربطالجمع بين 2 & micro ؛ L من KAPA ربط المخزن المؤقت و 6 & micro ؛ L من H2< / sub>O
في الوقت الحقيقي PCR مزيجيجمع بين 5 وميكرو ؛ L من 2x KAPA HiFi HS في الوقت الحقيقي PCR Master Mix ، 0.35 & L من مزيج التمهيدي PCR (10 وميكرو ؛ M كل من التمهيدي الأمامي AATGATACGGCGACCACCGAG والتمهيدي العكسي CAAGCAGAAGACGGCATACGAG) ، و 3.15 & micro ؛ L من H2< / sub>O
PCR مزيجيجمع بين 10 & micro; L من 2x KAPA HiFi Ready Mix ، 0.9 & micro ؛ L من PCR Primer Mix ، و 0.6 & micro ؛ L من H2O
عارض الجينومالتكاملي Broad InstituteIGV_2.3.88متصفح الجينوم لتصور بيانات
تسلسل الحمض النووي olgionucleotide: 5 & prime ؛ -GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3 & prime;Eurofins Genomicsتمهيدي لتضخيم منطقة المحفز ل GAPDH
DNA olgionucleotide: 5 & -CGAGCCTGACCTTGAGGTC-3 & prime;Eurofins Genomicsبرايمر لتضخيم منطقة المروج ل GAPDH
SYBR Premix Ex TaqTakaraRR420Lلتحديد الحمض النووي المقابل لمنطقة محفز GADPH
النردTakaraTP870لتحديد الحمض النووي المقابل لمنطقة محفز GADPH
أنبوب أنبوب مجموعة مزودة بمجموعة أدوات الحمض النووي عالية مجموعة تحضير رئيسي مزيج رئيسي رئيسي الحراري

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).
  2. Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).
  3. Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
  4. Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).
  5. Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
  6. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  7. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149(2016).
  10. Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).
  11. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TChIP SeqChromatin ImmunoprecipitationHistone ModificationCell Type SpecificEpigenome ProfilingTissue DissectionCryogenic GrindingFormaldehyde FixationSonication ChromatinAffinity Purification

Related Articles