تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

Summary

يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة للترادف الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (تشيب-Seq) التي تمكن من تحليل الخلية-نوع معين على نطاق الجينوم هستون تعديل.

Abstract

تنظيم جينية يلعب الأدوار المركزية في التعبير الجيني. منذ اكتشفت هستون تعديل في الستينات، بوظائفها الفسيولوجية والمرضية وقد درست على نطاق واسع. والواقع أن ثورة ظهور الجيل التالي تسلسل العميق وإيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) عن طريق محددة هستون تعديل الأجسام المضادة رأينا التنظيم جينية عبر الجينوم. على العكس من ذلك، الأنسجة وعادة ما تتألف من أنواع الخلايا المختلفة، وعن خليط معقد تحديات تحليلية للتحقيق في ابيجينومي في نوع خلية معينة. لمعالجة حالة الكروماتين الخاصة بنوع الخلية في طريقة على نطاق الجينوم، وضعنا مؤخرا جنبا إلى جنب الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (تشيب-Seq)، الذي يرتكز على تنقية انتقائية من الكروماتين بالبروتينات هستون المعلمة الأساسية من الخلية أنواع المصالح، متبوعاً بما يليها رقاقة والهدف من هذا البروتوكول هو الأخذ بممارسات أفضل لما يليها تشيب هذا الأسلوب يوفر أداة متعددة الاستخدامات للتحقيق ابيجينومي الخاصة بالانسجة في التعديلات هيستون المتنوعة ونموذج الكائنات الحية.

Introduction

تتكون أنسجة حيوانات من أنواع مختلفة من الخلايا. تنظيم الجينات في كل خلية يعرف نوع الخلية. التعديلات الكروماتين-الحمض النووي مثلايشن وهستون تعديل-تكمن وراء خصوصية خلية من نوع التعبير الجيني. وهكذا، قد تم المطلوب قياس التنظيم جينية في كل نوع من أنواع الخلايا، ولكن كان تحديا تقنيا.

للتحقيق في التخلق في نوع خلية معينة، كان جنبا إلى جنب الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (تشيب-Seq) وضعت مؤخرا (رقم 1)¹. في تشيب، يعبر عن معلم حانمه الأساسية هيستون البروتين H2B من مروج الخلية-نوع معين. تسمح هذه الميزة لعزل تشروماتينس من الخلايا ذات الاهتمام، على الرغم من أن ال....

Protocol

وقد وافقت عليه شعبة السلامة بتبريد (H27-EP071) جميع الأساليب الموضحة هنا وأجريت مع اللوائح والمبادئ التوجيهية ذات الصلة.

1. تشريح الأنسجة

1. تشريح أنسجة المصلحة إلى قطع صغيرة (تقريبا < 3 مم²) استخدام مقص الربيع الجميلة.
   ملاحظة: أكبر الأنسجة شظايا يستغرق وقتاً أطول لتجميد، وسيحمل قطع صغيرة على كميات أكبر من المخزن المؤقت، والتي قد تؤثر على النتائج.
2. إضافة أجزاء تشريح الأنسجة إلى حاوية نظيفة مليئة بسائل النيتروجين وجمعها في أنابيب 2 مل (1 قطعة كل أنبوب) مملوءة بالنتروجين السائل.
   ملاحظة: ينصح أنابيب مع سطح ماء لهذه الخطوة.
3. ضع الأنابيب في-80 درجة مئوية > 5 دقائق مع سقف مفتوح يتبخر النيتروجين السائل الم....

Results

هنا، نحن تصف تشريح الأنسجة، تثبيت، وتحلل الخلية، تنقية جنبا إلى جنب من الكروماتين، وإعداد مكتبة الحمض النووي للتعاقب الجيل القادم. أثناء الإجراءات، يمكن اختبار واحد نوعية الحمض النووي، الذي هو مفتاح لتسلسل النجاح، في خطوات متعددة (الشكل 2). منذ نوكليوسومي واحد عادة محاط ب الحمض النووي bp 147 ⁴، يجب أن لا أقصر من أن الحجم الحمض النووي المنفصمة. فور ultrasonication، عزل الحمض النووي وتشغيلها على جهاز التفريد موائع جزيئية (

Discussion

وكان لدينا بروتوكول الأمثل للخلايا العصبية للدماغ الماوس، وفيه التعبير عن معلم العلم H2B هو الناجم عن الحقن بعقار تاموكسيفين. المروجين المستخدمة للتعبير H2B وانطلاق مواد الأنسجة وكمية الأنسجة معلمات محورية لنجاح تشيب--ما يليها وبالتالي، ينبغي النظر في الاستفادة المثلى من هذه العوامل لكل خلية نوع من الفائدة.

خطوة حاسمة بين الإجراءات المستخدمة في هذا البروتوكول هو الحمض النووي القص لتحقيق طول الكروماتين من 100-500 bp⁵. بشكل عام، هو التحدي بتوحيد هذه الخطوة ultrasonication.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
أنبوب بروتين LoBind ، 2 مل	Eppendorf	No.  ؛ 0030108132	لتحلل الخلايا
أنبوب بروتين LoBind ، 1.5 مل	Eppendorf	No.  ؛ 0030108116	لإعداد ChIP والمكتبة
DNA LoBind ، 1.5 مل	Eppendorf	No.  ؛ 0030108051	لإعداد ChIP والمكتبة
PCR 8 شرائط	BIO-BIK	3247-00	لإعداد ChIP والمكتبة
مطحنة SK	TOKKEN	SK-200	طاحونة مبردة يدوية لصنع مسحوق الخلية للتثبيت
رصاصة معدنية	TOKKEN	SK-100-DLC10	ملحق مطحنة SK
2 مل أنبوب من الفولاذ المقاوم للصدأ	TOKKEN	TK-AM5-SUS	خيار للخلية تحلل
2 مل حامل أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ	TOKKEN	SK-100-TL	خيار لتحلل الخلايا
16٪ فورمالديهايد (وزن / حجم) ، خالي من الميثانول	بيرس	28906	لإصلاح الخلايا. تحضير محلول 1٪ قبل الاستخدام.
Glycine	Nacalai Tesque	17109-35	قم بإعداد 2.5 M مخزون
D-PBS (-) (1x)	Nacalai Tesque	14249-24	لغسل المحلل والحمض النووي المنقى
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	للمخزن المؤقت للتحلل 1. تحضير 1 م ، درجة الحموضة 7.5 مخزون.
5 M كلوريد الصوديوم ، درجة البيولوجيا الجزيئية	Nacalai Tesque	06900-14	لمخزن التحلل 1 ، المخزن المؤقت للتحلل 2 ، المخزن المؤقت للشطف ChIP ، و Tris-EDTA-NaCl Buffer
0.5 M EDTA ، درجة البيولوجيا الجزيئية	Wako Pure Chemical Industries، Ltd.	311-90075	للمخزن المؤقت للتحلل 1 ، ومحلول التحلل 2 ، والمخزن المؤقت للشطف ChIP ، و Tris-EDTA-NaCl
Buffer Glycerol	Wako Pure Chemical Industries، Ltd.	072-04945	للمخزن المؤقت للتحلل 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	للمخزن المؤقت للتحلل 1
Triton X-100 ، درجة البيولوجيا الجزيئية	Nacalai Tesque	12967-32	للمخزن المؤقت للتحلل 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	لمخزن التحلل 2 ، ومخزن Elution ChIP ، و Tris-EDTA-NaCl Buffer. تحضير 1 م ، مرق الرقم الهيدروجيني 8.0.
0.1 M EGTA درجة الحموضة المحايدة	Nacalai Tesque	08947-35	ل Lysis Buffer 2
كوكتيل مثبط البروتياز (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	لمنع تدهور البروتين
RIPA Buffer	Thermo Fisher Scientific	89900	لتحلل الخلايا وغسلها
milliTUBE 1 مل AFA الألياف	Covaris	520130	أنبوب Sonicator. ملحق من الموجات فوق الصوتية المركزة
الموجات فوق الصوتية التركيز على الموجات فوق الصوتية	Covaris	S220 أو E220	لهضم الحمض النووي إلى حجم مناسب ل ChIP-Seq
UltraPure 10٪ SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	ل ChIP Elution Buffer
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	لتنقية الحمض النووي من محللة
Proteinase K ، المؤتلف ، PCR Grade	Sigma-Aldrich	3115887001	لتنقية الحمض النووي من الإيثانول
	واكو للصناعات الكيميائية النقية المحدودة.	054-07225	اصنع 70٪ محلول
أحادي النسيلة المضاد ل FLAG M2 الأجسام المضادة المنتجة في الفأر	Sigma-Aldrich	F1804	لتنقية الكروماتين المعبر عنه في الخلايا ذات الأهمية
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	يمكن استخدام هذا في مكافحة FLAG IP ومكافحة H3K4me3 IP
المضادة ثلاثي الميثيل هيستون H3 (K4) ، الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر	Wako Pure Chemical Industries، Ltd.	301-34811	أي جسم مضاد آخر يعمل لتحليل ChIP سيعمل
10x كاشف الحجب	Sigma-Aldrich	11096176001	للحظر أثناء تنقية
التقارب Denhardt ' s solution	Nacalai Tesque	10727-74	للحجب أثناء تنقية التقارب
الجليكوجين (5 مجم / مل)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	لتنقية الحمض النووي من محللة
كيوبيت 2.0 مقياس	الفلور الحراري فيشر العلمي	Q32866	لتقدير كمية الحمض النووي المعزول
Qubit dsDNA HS	الفحص Thermo Fisher Scientific	Q32851	لقياس الحمض النووي المعزول
أنبوب 0.5 مل	Axygen	10011-830	للقياس الكمي بواسطة Qubit
Phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	لتنقية الحمض النووي من
حبات AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	SPRI الخرز المغناطيسي لإعداد المكتبة
رف ثلج معدني	Funakoshi	IR-1	للحفاظ على محللة الخلية المجمدة
يساعد مبرد العينة	New England Biolabs	T7771S	في إصلاح الخلايا بأقل قدر من الضرر
2100 Bioanalyzer	Agilent	Technologies G2939BA	للتحقق من جودة شظايا الحمض النووي المعزولة. يمكن استخدام محلل شظايا آخر.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent	Technologies G2946CA	الحساسية للمحلل الحيوي
	Agilent Technologies	5067-4626	للتحقق من جودة شظايا الحمض النووي المعزولة ،
مكتبة KAPA LTP	Roche	07961898001	مزود بمخزن مؤقت لإصلاح نهاية KAPA 10x ، ومزيج إنزيم الإصلاح النهائي KAPA ، ومخزن KAPA A-Tailing Buffer ، وإنزيم KAPA A-Tailing ، و KAPA Ligation Buffer ، و KAPA DNA Ligase ، ومحلول PEG / NaCl
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter لإعداد المكتبة. مزود بمحولات الباركود DNA ومزيج التمهيدي.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit	Roche	07959028001	مزودة ب 2x KAPA HiFi HS Real-time PCR Master Mix و PCR Primer Mix و
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	لإعداد المكتبة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون هذا الإنزيم مطلوبا لمجموعة تضخيم مكتبة KAPA في الوقت الفعلي
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl ، درجة الحموضة 8.5 لشطف لوحة الحمض النووي
386 جيدا qPCR	Thermo Fisher Scientific	4309849	ل PCR في الوقت الفعلي
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4485701	لتحديد كمية فيلم لاصق بصري MicroAmp للحمض النووي
	4311971 Thermo Fisher Scientific		ل PCR
MicroAmp في الوقت الحقيقي فيلم لاصق شفاف	Thermo Fisher Scientific	4306311	لختم الألواح
مزيج رئيسي			للإصلاح النهائي يجمع بين 1.4 وميكرو ؛ L من 10x KAPA نهاية إصلاح المخزن المؤقت ، 1 & micro ؛ L من مزيج إنزيم إصلاح نهاية KAPA ، و 1.6 & L من H2< / sub>O
A-taling مزيج			يجمع بين 1 & micro; L من KAPA A-Tailing Buffer ، 0.6 & micro ؛ L من KAPA A-Tailing Enzyme ، و 8.4 & micro ؛ L من H2< / sub>O
		عازلة ربط	الجمع بين 2 & micro ؛ L من KAPA ربط المخزن المؤقت و 6 & micro ؛ L من H2< / sub>O
في الوقت الحقيقي PCR مزيج			يجمع بين 5 وميكرو ؛ L من 2x KAPA HiFi HS في الوقت الحقيقي PCR Master Mix ، 0.35 & L من مزيج التمهيدي PCR (10 وميكرو ؛ M كل من التمهيدي الأمامي AATGATACGGCGACCACCGAG والتمهيدي العكسي CAAGCAGAAGACGGCATACGAG) ، و 3.15 & micro ؛ L من H2< / sub>O
PCR مزيج			يجمع بين 10 & micro; L من 2x KAPA HiFi Ready Mix ، 0.9 & micro ؛ L من PCR Primer Mix ، و 0.6 & micro ؛ L من H2O
عارض الجينوم	التكاملي Broad Institute	IGV_2.3.88	متصفح الجينوم لتصور بيانات
تسلسل الحمض النووي olgionucleotide: 5 & prime ؛ -GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3 & prime;	Eurofins Genomics		تمهيدي لتضخيم منطقة المحفز ل GAPDH
DNA olgionucleotide: 5 & -CGAGCCTGACCTTGAGGTC-3 & prime;	Eurofins Genomics		برايمر لتضخيم منطقة المروج ل GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	لتحديد الحمض النووي المقابل لمنطقة محفز GADPH
النرد	Takara	TP870	لتحديد الحمض النووي المقابل لمنطقة محفز GADPH