مقالة منهجية

عزل حويصلات خارج الخلية من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل باستخدام أسلوب الطرد المركزي أولترافيلتريشن

DOI:

10.3791/58310

⸱

نوفمبر 9, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن تصف البروتوكولين من العزلة حويصلة خارج الخلية، أولترافيلتريشن الطرد المركزي وتنبيذ فائق مع كثافة التدرج الطرد المركزي، لعزل حويصلات خارج الخلية من الغسل للفيسيولوجيا مورين عينات السوائل. الحويصلات خارج الخلية المستمدة من سائل الغسل للفيسيولوجيا مورين بكلتا الطريقتين كمياً وتتميز.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حويصلات خارج الخلية (EVs) هي مكونات سوبسيلولار المكتشفة حديثا التي تلعب أدواراً هامة في البيولوجية العديد من الإشارات وظائف خلال الدول الفسيولوجية والمرضية. عزل المركبات الكهربائية لا يزال يشكل تحديا رئيسيا في هذا المجال، بسبب القيود المتأصلة لكل تقنية. هو نهج استخداماً تنبيذ فائق التفاضلية مع أسلوب الطرد المركزي التدرج الكثافة ويعتبر الإجراء معيار الذهب لعزل EV. بيد أن هذا الإجراء هو مضيعة للوقت، وكثيفة العمالة، ويؤدي عادة في قابلية منخفضة، التي قد لا تكون مناسبة لعينات صغيرة الحجم مثل سائل الغسل للفيسيولوجيا. ونحن تبين أن أسلوب عزل الطرد المركزي أولترافيلتريشن بسيطة وفعالة من حيث الوقت والعمل يوفر الانتعاش عالية الغلة والنقاء. ونحن نقترح أن هذا الأسلوب العزلة يمكن أن يكون نهج بديل مناسب لعزل EV، خاصة بالنسبة للعينات البيولوجية صغيرة الحجم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اكسوسوميس هي مجموعة فرعية أصغر من المركبات الكهربائية، 50 – 200 نانومتر في القطر، ولها وظائف متعددة والبيولوجية عبر مجموعة متنوعة من إشارات العمليات1،2،3،،من45. أنها تنظم الخلايا والأنسجة والتوازن أساسا بتيسير الاتصالات بين الخلايا عن طريق جزيئات البضائع مثل الدهون والبروتينات، والأحماض النووية6،،من78،9 . واحد خطوة حاسمة في البحث EV هو عملية العزل. التفضيلية تنبيذ فائق (UC), مع أو بدون كثافة التدرج الطرد المركزي (DGC)، يعتبر النهج معيار الذهب، ولكن هذا الأسلوب يحمل القيود الرئيسية، بما في ذلك عدم كفاية معدلات الاسترداد EV وقابلية منخفضة10 , 11 , 12، التي تقيد استخدامها أفضل إلى أكبر حجم العينات، مثل خلية ثقافة اكسوسومي طافية أو ارتفاع إنتاج العينات. مزايا وعيوب الأساليب الأخرى، مثل حجم الاستبعاد ultrafiltration أو اللوني، عزل إيمونوافينيتي بواسطة الخرز أو الأعمدة، وميكروفلويديكس، موصوفة جيدا، ووضعت إجراءات تكميلية الحديثة إلى التغلب عليها، وتقليل القيود التقنية في كل نهج12،،من1113،،من1415. البعض الآخر قد أظهرت أن أولترافيلتريشن الطرد المركزي (الوليد) بغشاء نانوبوروس في وحدة التصفية وهي تقنية بديلة يوفر النقاء مقارنة بتفرد أسلوب16،،من1718. يمكن اعتبار هذا الأسلوب أحد الأساليب البديلة العزلة.

للفيسيولوجيا الغسل السائل (بالف) تحتوي على المركبات الكهربائية التي تمتلك العديد من الوظائف البيولوجية في مختلف ظروف الجهاز التنفسي19،،20،21،22. دراسة يستتبع المركبات الكهربائية المستمدة من بالف بعض التحديات بسبب اختزاع الإجراء القصبات في البشر، فضلا عن كمية محدودة من استعادة السوائل الغسل. في الحيوانات المختبرية الصغيرة مثل الفئران، ملليلتر قليلة فقط يمكن استردادها في الظروف العادية الرئة، وحتى أقل من ذلك في الرئتين ملتهبة أو تليفية23. وبالتالي فإن جمع كمية كافية من بالف لعزل EV تنبيذ فائق تفاضلية للتطبيقات المتلقين للمعلومات قد لا يكون ممكناً. ومع ذلك، عزل السكان EV الصحيح عاملاً حاسما لدراسة الوظائف البيولوجية EV. التوازن الدقيق بين الكفاءة والفعالية لا يزال يشكل تحديا في أساليب العزلة EV الراسخة.

في هذه الدراسة الحالية، ونحن تبين أن نهج ultrafiltration الطرد مركزي، استخدام كاتشين 100 وزن الجزيئي وقف إنتاج المواد الانشطارية (موكو) نانوميمبراني تصفية وحدة، مناسبة للعينة البيولوجية صغيرة الحجم مثل بالف. هذا الأسلوب هو بسيط وفعال، ويوفر درجة نقاء عالية وقابلية لدعم دراسة المركبات الكهربائية المستمدة من بالف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد أقر استخدام الحيوانات وجميع الإجراءات الحيوان "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجان (إياكوك) في سيدرز-سيناء الطبي مركز (كسمك).

1-مورين للفيسيولوجيا الغسل السائل (بالف) جمع وإعداد

  1. مجموعة بالف
    1. Euthanize الفئران مع مزيج من الكيتامين (300 ملغ/كغ) وإكسيلازيني (30 ملغ/كغ) عبر الطريق داخل متبوعاً بخلع عنق الرحم.
    2. إدراج أنجيوكاثيتير ز 22 في القصبة الهوائية. إرفاق حقنه الأنسولين التي تحتوي على 1 مل (mL) من الفوسفات المالحة دولبيكو العقيمة المثلج المخزن المؤقت (دببس) وغرس 1 مل دببس إلى كلا الرئتين من خلال أنجيوكاثيتير.
    3. سحب المكبس حقنه استرداد بالف والاستغناء عن بالف في أنبوب 50 مل مخروطية ببطء. الحفاظ بالف على الجليد.
    4. كرر الخطوتين 1.1.2 و 1.1.3 3 x (x 4 في المجموع في كل الماوس).
      ملاحظة: يتم استرداد حوالي 0.8 مل عموما في المليلتر من تقطير. أيضا، يمكن تنفيذ الخطوات التالية للفئران الفردية (أي3 مل بالف)، ولكن تجميع عينات بالف متعددة تسمح عزلة دفعة أكبر من المركبات الكهربائية للاتساق في تجارب المتلقين للمعلومات.
  2. إعداد بالف
    1. تجمع بالف من الفئران 25 وتقسم إلى مجموعتين متساوية (~ 35 مل كل قاسمة).
    2. الطرد المركزي في بالف في ز 400 x، عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، لإزالة الخلايا وغيرها من الحطام الخلوية وجمع المادة طافية.
    3. الطرد المركزي المادة طافية في س 1,500 ز، عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، لإزالة الحطام خلية. جمع المادة طافية والشروع في خطوات عزل EV.

2-عزل حويصلات خارج الخلية من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل

ملاحظة: في هذه الدراسة، تقنيات العزل EV اثنين، هما الوليد وتنبيذ فائق مع ازدهار المستخدمة لعزل المركبات الكهربائية من بالف. يرد أدناه وصف البروتوكول مفصلاً لكل أسلوب.

  1. أسلوب الإثراء الطرد المركزي (الوليد) أولترافيلتريشن
    ملاحظة: تم تعديل هذا الأسلوب من بروتوكول هو موضح سابقا10.
    1. تصفية المادة طافية من الخطوة 1.2.3 من خلال مرشح المحاقن معقمة 0.2 ميكرومتر، والحفاظ على بالف التي تمت تصفيتها على الجليد.
      ملاحظة: هذا خطوة استبعاد حجم موجبة فقط حويصلات أصغر من 200 تجمع شمال البحر الأبيض المتوسط.
    2. حجته وحدة الطرد المركزي تصفية موكو كاتشين 100 مع دببس العقيمة لأدنى 10 أجهزة الطرد المركزي وحدة الطرد المركزي في س 1,500 ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية للتخلص من دببس.
      تنبيه: بمجرد الغشاء في جهاز عامل التصفية هو اكويليبراتيد مع دببس، الغشاء يجب إبقاء الرطب في كل وقت حتى يتم استخدام الجهاز.
    3. ملء وحدة التصفية مع 15 مل عينة بالف من الخطوة 2.1.1 وأجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. يمكن تجاهل بالف من خلال تدفق أو جمعها في أنبوب الكنسي منفصلة وتخزينها في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
    4. كرر الخطوة 2.1.3 بالف تصفية ميكرومتر 0.2 المتبقية.
      ملاحظة: استغرق ثلاثة من التكرار من سينتريفوجيشنز التركيز بما فيه الكفاية EVs بالف من وحدة التخزين الأصلية ابتداء من 35 مل. وادي هذا إلى 1 – 1.5 مل ريتينتاتي.
    5. أغسل ريتينتاتي مع 14 مل دببس العقيمة من بلطف بيبيتينج متكررة. الطرد المركزي وحدة تصفية في 3,000 x ز، عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، لإزالة دببس وتركيز ريتينتاتي EV.
    6. جمع المركبات المشتقة من بالف مركزة من جهاز تصفية بإدراج بيبيتور في الجزء السفلي من جهاز عامل تصفية وسحب العينة استخدام اقتراحا كاسحة جنبا إلى جنب لضمان الشفاء التام.
    7. قاسمة EVs المستمدة من بالف وتخزينها في-80 درجة مئوية لمزيد من التحديد الكمي الجسيمات وتوصيف (راجع الخطوة 3).
  2. تنبيذ فائق (UC) مع كثافة الطفو التدرج الطرد المركزي (DGC)
    ملاحظة: تم تعديل البروتوكول التالية من البروتوكول هو موضح سابقا24.
    1. نقل المادة طافية من الخطوة 2.1.1 في أنبوب ultracentrifuge 37 مل والطرد المركزي العينة في س 10,000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام أولتراسينتريفوجي. جمع المادة طافية وأجهزة الطرد المركزي في 100,000 س ز، عند 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. في حين يتم فصل الكريات EV، إعداد تركيزات مختلفة من كثافة الطفو التدرج المخازن المؤقتة (الجدول 1) لخطوة 2.2.3.
    2. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الكريات EV في 200 ميكروليتر من دببس.
    3. مزيج تعليق EV مع 300 ميكروليتر من حل عملي إيوديكسانول 50% (الجدول 1)، وأنه نقل إلى أنبوب أولتراسينتريفوجي 15 مل. أعلى 50% إيوديكسانول--EV تعليق الخليط، طبقة تسلسلياً حل المخزن المؤقت التالية بالترتيب من الأسفل إلى الأعلى: 30% إيوديكسانول (4.5 مل)، 25% من إيوديكسانول (3 مل) و 15% إيوديكسانول (2.5 مل) 5% إيوديكسانول (6 مل). أجهزة الطرد المركزي في 100,000 س ز، عند 4 درجة مئوية لمدة دقيقة 230.
      ملاحظة: يستند التدرج كثافة الطفو المئة من إيوديكسانول القياس مع تركيز أعلى (50%) في الجزء السفلي لأدنى تركيز (5%) في الجزء العلوي. لتوليد تركيزات مختلفة من إيوديكسانول، كميات مختلفة من متوسطة التجانس (الجدول 1) كانت مختلطة مع العامل الحل (إيوديكسانول 50%).
    4. جمع الكسر 15% و 25% وتمييع لهم في دببس العقيمة لإحضار وحدة التخزين إلى 15 مل. نقلها إلى أنبوب ultracentrifuge الصغيرة الجديدة وأجهزة الطرد المركزي في 100,000 س ز، عند 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    5. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الكريات EV في 50 ميكروليتر من دببس العقيمة لمزيد من الوصف.

3-خارج الخلية حويصلة القياس الكمي

ملاحظة: يتم quantitated العائد استرداد المركبات الكهربائية المستمدة من بالف مع اثنين من المقاييس.

  1. نانوحبيبات تتبع قياس التحليل (NTA)
    1. تمييع عينة EV في 1: 200 – 1: 500 في 1 مل دببس وتحميل العينة في محقن الأنسولين. إرفاق حقنه عينة لمضخة الحقن وتبدأ بقياس عدد الجسيمات وحجم (انظر الجدول للمواد).
    2. تعيين مستوى الكاميرا في 14 وعتبة الكشف في 1 لكل عينة القياسات. خمسة القياسات المتكررة مع إطارات 1,500 في 30 ثانية وسجلت لكل عينة، مع تأخير 20 s بين القراءات. الجمع ومتوسط البيانات الخاصة بتركيز نهائي وحجم التقارير.
      ملاحظة: لدقة التقاط جميع الجسيمات، ضبط مستوى الكاميرا حسب الاقتضاء لتصور جميع الجزيئات واستخدام إعدادات مماثلة لجميع القياسات عينة في كل تجربة.
  2. تقدير البروتين
    ملاحظة: استخدمت مقايسة البروتين (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك لقياس تركيز البروتين EVs المستمدة من بالف.
    1. جعل العينات EV في المخزن المؤقت لتحلل x 1.
    2. تحديد مقدار البروتين في EVs المستمدة من بالف كل بروتوكول اتفاق التعاون الأساسي القياسية باستخدام الكشف عن قياس الألوان عن طريق قياس امتصاص في 560 نانومتر في قارئ لوحة.

4-الكشف عن حويصلات خارج الخلية المستمدة من بالف

ملاحظة: استخدمت البروتينات السطحية العلامة المعروفة اكسوسومي (TSG101، CD63، CD81، و CD9) للتحقق من المبالغ المستردة EV بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة وإيمونوبلوتينج والتدفق الخلوي التحليل.

  1. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة و immunoblotting
    1. حل مبلغ مساو من البروتينات EV كل عينة مع قم تحميل المخزن المؤقت (الليثيوم دوديسيل كبريتات) و 50 مم ديثيوثريتول (DTT) في أنبوب 1.6 مل. الحرارة العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. تحميل العينات من الخطوة 4.1.1 إلى % 4 – 12 مكررا-تريس "بالإضافة إلى" هلام اكريلاميد وتشغيل التفريد (150 فولت، 35 mA) لمدة 35 دقيقة.
    3. نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز تستخدم أسلوب نقل جافة.
    4. كتلة الغشاء باللبن المقشود 5% ل 60 دقيقة، التأرجح في درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. احتضان الغشاء مع جسم مضاد لعلامة بروتين سطحي EV، الورم قابلية الجينات 101 (TSG101)، في تمييع 1: 500 في جيش صرب البوسنة 5% في تريس مخزنة المالحة توين-20 (تبسة) في 4 درجات مئوية، التأرجح بين عشية وضحاها.
    6. وفي اليوم التالي يغسل الغشاء 3 × 10 دقيقة كل غسل، في المخزن المؤقت تبسة، واحتضان أنه مع أرنب المضادة IgG، جسم مرتبطة ببرنامج الصحة الإنجابية، في إضعاف 1:5,000 لمدة 60 دقيقة في الرايت
    7. يغسل الغشاء 3 × 10 دقيقة كل غسل، في المخزن المؤقت تبسة. وضع الغشاء مع تشيميلومينيسسينت HRP كاشف الكشف عن الأجسام المضادة والصورة (انظر الجدول للمواد لنظام التصوير).
  2. التدفق الخلوي
    1. تمييع المستمدة من بالف المركبات الكهربائية في ميكروليتر 49 الكراك تلطيخ المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + يدتا 5 مم + 0.5% جيش صرب البوسنة، التي تمت تصفيتها من خلال غشاء تصفية حقنه 0.1 ميكرومتر).
    2. إضافة كل من الأجسام المضادة التالية في كل عينة فردية: 1) جسم PE CD63 الماوس لمكافحة الفئران (100 نانوغرام كل رد الفعل)؛ 2) الفئران الماوس المضادة PE CD81 (500 نانوغرام)؛ 3) الماوس لمكافحة الفئران CD9 فيتك (200 نانوغرام). احتضان عند 4 درجة مئوية، هزاز لمدة 60 دقيقة في الظلام.
    3. تمييع العينات مع ميكروليتر 450 تصفية الأغشية الكراك تلطيخ المخزن المؤقت وإخضاع العينات لتحليل التدفق الخلوي (انظر الجدول للمواد)25.
    4. ضبط إعدادات سيتوميتير التدفق على النحو التالي: 1) تعيين جميع القنوات على سجل فرط (هلوج)؛ 2) تعيين المشغل على التعاون بين بلدان الجنوب في 4؛ 3) إيقاف تشغيل المشغل الثانوي. تشغيل العينات في وضع السرعة المنخفضة وتكتسب الأحداث 10,000 على الأقل في كل عينة.
    5. القيام بتحليل البيانات الخلوي منخفضة في كل عينة باستخدام برمجيات التحليل (انظر الجدول للمواد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن يتم عزل EV من الماوس بالف باستخدام أساليب عزل الوليد وجامعة كاليفورنيا-DGC في نفس اليوم. يتطلب الأسلوب الوليد حوالي 2.5 – 3 ح، حين يتطلب تقنية الاتصالات الموحدة--DGC 8 ح الوقت اللازم للتجهيز. هذا لا يشمل المخازن المؤقتة وكاشف إعداد الوقت. تجدر الإشارة إلى أن بعض المهام الأخرى يمكن أن تتم خلال فترات طويلة من الطرد المركزي. ومع ذلك، استمرت الإجراءات بأكملها تقريبا يوم كامل لتقنية العزل UC-DGC.

عرض EVs بالف المستمدة من الفئران ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العقود القليلة الماضية، وقد متدهور العلماء دلالات من المركبات الكهربائية في التوازن الخلوية. الأهم من ذلك، تؤدي المركبات الكهربائية أدواراً رئيسية في العديد من الأمراض العمليات بتحوير الخلايا المجاورة والبعيدة من خلال تلك الشحنات النشطة بيولوجيا الجزيئات1،21،22،،من2627 , 28 , 29 ,

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العمل معتمد من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة/NHLBI HL103868 (للكمبيوتر) و HL137076 (على الكمبيوتر)، ومعونات جمعية القلب الأمريكية (للكمبيوتر) وجائزة البحث معهد السرطان الشامل صامويل أوشين (سوتشي) سرطان الرئة (للكمبيوتر). ونود أن نعرب عن تقديرنا الكبير لمعهد القلب سميت في سيدرز-سيناء الطبي أن يوفر لنا آلة Nanosight نانوحبيبات EV تتبع تحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرشحات الطرد المركزي < > المادة< القوية>
أيكون ألترا 15 Ultracel-100Kسيجما-ميليبور ، سانت لويس ، ميزوريUFC910024
ملحي مخزن بالفوسفات من دولبيكو (DPBS)كورنينج سيلجرو ، ماناساس ، فيرجينيا21-031-CV
السكروزسيجما ميليبور ، سانت لويس ، ميزوريEMD8550
HEPESResearch Products International ، Prospect ، IL75277-39-3
EDTACorning Cellgro ، Manassas ، VA46-034-CI
كلوريد الصوديومسيجما-ميليبور ، سانت لويس ، ميزوريS3014-1KG
OptiPrepسيجما ميليبور ، سانت لويس ، ميزوريMKCD9753كثافة التدرج متوسط
الكيتامينVetOne ، بويز ، معرف13985-702-10
زيلازينأكورن لصحة ، ليك فورست ، إلينوي59399-110-20
حقنة 1 ملحقنة BD ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي309656
قسطرة وعائية 20 جرامحقنة BD ، بحيرات فرانكلين ، نيوجيرسي381703
أنابيب الطرد المركزي 15 ملVWR ، رادنور ، بنسلفانيا89039-666
أنابيب الطرد المركزي 50 ملCorning Cellgro ، Manassas ، VA430828
مقايسة بروتين حمض البيسنكونيك (BCA)بيرس ، ثيرمو فيشر ساينتيفيك ، روكفورد ، إلينوي23235
أرنب مضاد للفأر TSG101 الأجسام المضادةAbCam ، كامبريدج ، ماساتشوستسAB125011
الفئران المضادة للفئران PE-CD63 الأجسامالمضادة Biolegend ، سان دييغو ، كاليفورنيا143904
CD81
CD9
IgG المضاد للأرانب ، تقنية إشارات الخلايا ذات الأجسام المضادة المرتبطة بHRP ، دانفرز ، MA7074S
4x LDS
10x عامل اختزال (بولت) 10x
عازلة تحلل (بولت)تقنية إشارات الخلية ، دانفرز ، MA
Bolt 4-12٪ Bis-Tris Plus جل أكريلاميدInvitrogen ، ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستسNW04120
iBlot 2 مداخن صغيرة من النيتروسليلوزInvitrogen ، Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MAIB23002
كاشف الكشف عن الأجسام المضادة HRP الكيميائي HyGLODenville Scientific ، Holliston ، MAE2400
أنابيب الطرد المركزي الفائق 17 ملBeckman Coulter ، Pasadena ، CA337986
أنابيب الطرد المركزي الفائق 38.5 ملبيكمان كولتر ، باسادينا ، كاليفورنيا326823
حقنة كورنينج SFCA 0.2 & micro; م مسامثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس09-754-13
< قوي > المعدات < / قوي >
جهاز طرد مركزيإيبندورف ، هامبورغ ، ألمانيا-
جهاز طرد مركزي فائقبيكمان كولتر ، باسادينا ، كاليفورنيا-
نانوسايت (NS300)مالفيرن ، رسيستيرشاير ، المملكة المتحدة-لقياس توزيع حجم الجسيمات و تركيز الجسيمات
MACuant Analyzer 10 مقياس التدفقالخلوي Miltenyi Biotec ، Bergisch Gladbach ،ألمانيا-iBlot
جهاز نقلThermo Fischer Scientific ، Waltham ، MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad ، Hercules ، CA
FlowJo v. 10برنامج التحليل
محلول مرشحات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
  2. Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  4. Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
  5. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  6. Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
  7. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  8. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
  9. Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
  10. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
  11. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
  12. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389(2017).
  16. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031(2015).
  17. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297(2017).
  18. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).
  19. Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
  20. Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
  21. Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404(2016).
  22. Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
  23. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398(2017).
  24. Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
  25. Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581(2016).
  26. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
  27. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
  28. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
  29. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
  30. Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
  31. Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
  32. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  33. Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
  34. Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050(2017).
  35. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  36. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  37. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  38. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329(2016).
  39. Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277(2016).
  40. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
  41. Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
  42. Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019(2017).
  43. Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD63 CD9 CD81

مقالات ذات صلة