Method Article

إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر

DOI:

10.3791/58320

⸱

October 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, 2The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 3Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, 4Nikon Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا دليلاً عمليا لبناء نظام متكامل الفحص المجهري، والذي يدمج التقليدية برنامج التحصين الموسع-فلوري التصوير، وتصوير فائقة جزيء واحد القرار القائم على الكشف، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك نقل الطاقة صدى الأسفار جزيء واحد التصوير، إلى إنشاء واحدة بطريقة فعالة من حيث تكلفة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجهر الأسفار أداة قوية للكشف عن الجزيئات البيولوجية في الموقع ورصد ديناميات والتفاعل في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى الفحص المجهري التقليدي برنامج التحصين الموسع-الأسفار، تطورت تقنيات التصوير المختلفة لتحقيق أهداف تجريبية محددة. بعض التقنيات المستخدمة على نطاق واسع وتشمل الأسفار جزيء واحد الرنين نقل الطاقة (سمفريت)، التي يمكن أن تبلغ conformational التغييرات والتفاعلات الجزيئية مع القرار انغستروم، والقائم على الكشف عن جزيء واحد فائقة القرار (SR) التصوير، والذي يمكن أن يعزز هذا القرار المكانية حوالي عشرة إلى توينتيفولد مقارنة بالفحص المجهري حيود محدودة. وهنا يقدم نظام متكامل تصميم العميل الذي يقوم بدمج عدة أساليب التصوير في المجهر واحد، بما في ذلك تصوير برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت التقليدية، تصوير ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك التصوير سمفريت. ويمكن تحقيق أساليب التصوير المختلفة بسهولة وتكاثر بتبديل العناصر البصرية. هذا التشكيل من السهل أن تعتمد أي مختبر البحوث في العلوم البيولوجية مع حاجة إلى روتين وتجارب التصوير المتنوعة في خفض التكلفة والمساحة بالنسبة إلى بناء المجاهر منفصلة لأغراض فردية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجاهر الأسفار أدوات هامة لبحوث العلوم البيولوجية الحديثة والتصوير الفلورسنت تتم بشكل روتيني في الكثير من مختبرات البيولوجيا. بوضع علامات الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام مع فلوروفوريس، ونحن مباشرة تصور لهم تحت المجهر وتسجيل التغييرات التي تعتمد على الوقت في الترجمة، والمطابقة، والتفاعل، والجمعية الدولة فيفو في أو في المختبر. مجاهر الفلورية التقليدية لدينا قرار حيود محدودة المكاني، الذي هو ~ 200-300 نانومتر في الاتجاه الأفقي، وشمال البحر الأبيض المتوسط ~ 500-700 في الاتجاه المحوري1،2، وهي، لذلك، تقتصر على التصوير في 100s من مقياس نانومتر إلى ميكرون. وقد وضعت بغية الكشف عن التفاصيل الدقيقة في الجم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-المجهر التصميم والجمعية

  1. مسار الإثارة
    ملاحظة: يتضمن مسار الإثارة أشعة الليزر ومكونات التباين (DIC) التدخل التفاضلية والجسم مجهر وذراعها الإضاءة.
    1. إعداد جدول ضوئية عزل الاهتزازات. على سبيل المثال، يعطي جدولاً التخميد هيكلية من 48 × 96 x 12 '' مساحة كافية لكافة المكونات.
      ملاحظة: بناء الهيكل في غرفة مع التحكم في درجة الحرارة (مثل، 21.4 ± 0.55 درجة مئوية). استقرار درجة الحرارة أمر حاسم للحفاظ على محاذاة البصري.
    2. تثبيت جهاز مجهر مجهز بذراع إضاءة للاتصال بالألياف الضوئية، 100 × النفط-الغمر TIRF الهدف العدسة، ومكونات DIC.
    3. ضع أربعة رؤساء الليزر (647 نانومتر، 561 نانومتر، 488 نانومتر، و 405 نانومتر، مطوقة ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويسمح هذا المجهر مرنة واستنساخه بالتبديل بين مختلف أساليب التصوير. هنا نعرض عينة من الصور التي تم جمعها مع كل وحدة التصوير.

يوضح الشكل 5 PSF جزيء وامض في أثناء اقتناء ريال. يتم بناؤها الآلاف من مثل هذه الصور لإنشاء الصورة النهائية ريال (الشكل 5E). ويبين الشكل 5E الكشف التنظيمي البكتيرية نفس كما هو موضح في الصورة برنامج التحصين الموسع-الأسفا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظام المجهر الهجين هذا يلغي الحاجة إلى شراء مجاهر متعددة. التكلفة الإجمالية لجميع أجزاء، بما في ذلك الجدول البصرية، والبرمجيات والجدول التثبيت العمالة ومحطة العمل، هو حوالي 230,000 دولار. أجزاء آلة مخصصة، بما في ذلك ماج العدسة والعدسة ثلاثية الأبعاد، ويتكلف حوالي مبلغ 700 (التكلفة تعتمد على الرسوم الفعلية في معاهد مختلفة). النموذجية المتاحة تجارياً النظم المتكاملة لجزيء واحد المستندة إلى الكشف المجهري ريال تكلف أكثر من 300,000 دولار ~ 000 400 وهي غير متاحة لقياس سمفريت، أو برنامج التحصين الموسع-تصوير لمجال رؤية معقولة، د.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتسلم J.F. الدعم من برنامج العلماء سيرل وجائزة ابتكار جديدة لمدير المعاهد الوطنية للصحة. الكتاب تقر اقتراحات مفيدة من مختبر بول Selvin (جامعة إلينوي، اوربانا-شامبين) لتحديد المواقع العدسة ثلاثية الأبعاد.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
نيكون Ti-E المجهر حاملنيكونTi-E
عدسة موضوعيةنيكون100X NA 1.49 CFI HP TIRF
برنامج التصوير المجهريNikonNIS-Elements Advanced Research / HCHC يتضمن وحدة "JOBS" ، وحدة الاستحواذ المبرمجة المستخدمة للتصوير SR.
ذراع الإضاءةنيكونTi-TIRF-EM وحدة الإضاءة الآلية Mيحتوي هذا الذراع على فتحة لعدسة تكبير
تحليل كتلةنيكونTi-Aيتم تثبيته في برج المرشح.
نظام تصحيح Z-driftنيكونPFSيتكون هذا النظام من محرك متدرج على قطعة الأنف الموضوعية ، ومصباح LED بالأشعة تحت الحمراء ، وكاشف.
سطح طاولة بصريTMC783-655-02R
قواعد طاولة بصريةTMC14-426-35
647 نانومتر ليزرCobolt90346 (0647-06-01-0120-100)الصمام الثنائي بالليزر المعدل 647 نانومتر 120 ميجا واط بما في ذلك رأس الليزر ، صندوق التحكم CDRH ، كابل USB و PSU (وحدة إمداد الطاقة)
561 نانومتر ليزرمتماسك1280721OBIS 561nm LS 150mW نظام ليزر
488 نانومتر ليزرCobolt90308 (0488-06-01-0060-100)الصمام الثنائي بالليزر المعدل 488 نانومتر 60 ميجا واط بما في ذلك رأس الليزر ، صندوق التحكم CDRH ، كابل USB و PSU (وحدة إمداد الطاقة)
405 نانومتر ليزرCrystalaserDL405-025-O405 (+/- 5) نانومتر ، 25 ميجا واط ، دائري ، M2 < ؛ 1.3 ، ضوضاء منخفضة ، CW ، TTL حتى 20 ميجا هرتز. 2 موصلات BNC ل TTL & ضبط تناظري
بالوعة الحرارةCobolt11658 (HS-03)وحدتان ، بالوعة حرارية بدون مروحة HS-03 ، بالوعة حرارية لليزر 647 نانومتر و 488 نانومتر
بالوعة حراريةمتماسكة1193289Obis بالوعة حرارية مع مروحة ، 165 × 50 × 50 مم لليزر 561 نانومتر
CAB-USB-miniUSBCobolt10908وحدتان ، كابل اتصال ليزر 647 نانومتر و 488 نانومتر
من الألومنيوم لتعديل الارتفاعMcMaster-Carr9146T35متعدد الأغراض 6061 ألومنيوم ، قضيب مستطيل ، 4 مم × 40 مم ، 1 'طويل لرفع 561 نانومتر
ألومنيوم ليزر لتعديل الارتفاعMcMaster-Carr8975K248متعدد الأغراض 6061 ألومنيوم ، 1-1 / 4 بوصة سميكة × 3 بوصة عرض × 1 بوصة طول لرفع 405 نانومتر
كابل ليزر BNCL-comCC58C-6RG58C كابل متحد المحور ، BNC ذكر / ذكر ، محول BNC 6.0 قدم
L-comBA1087محول متحد المحور ، حاجز BNC ،
محول SMA إلى BNCHODSMA-870Cobolt MLD على واجهة SMA ، لذلك يتم استخدام هذا المحول لاتصال BNC.
SMB إلى BNC محولفيرفيو الميكروويفFMC1638316-12SMB التوصيل إلى BNC أنثى الحاجز كابل RG316 Coax في 12 بوصة لليزر Obis المتماسك
بطاقة الحصول على البياناتالأدوات الوطنيةPCI-672313 بت ، 32 قناة ، 800 كيلو ثانية / ثانية جهاز الإخراج التناظري للتحكم في الليزر ، DIC LED ، وغيرها
الحاجز تصفية عجلة التحكمأداة سوترأداة لامبدا 10-Bمبدل
الفلتر البصريانبعاث الفاصلCairnOptoSplit III
ثنائي اللون شعاع مقسمChromaT640LPXR-UF2شعاع يفصل الانبعاث الأحمر عن الانبعاث الأخضر في OptoSplit III
شعاع مقسمChromaT565LPXR-UF2اللون يفصل بين الانبعاث الأخضر والأحمر والانبعاث الأزرق في OptoSplit III
مرشح الانبعاثChromaET700 / 75Mوحدتان ، مرشح الانبعاث للانبعاث الأحمر (مثل Alexa Fluor 647) في OptoSplit III وكذلك في فلتر انبعاث عجلة المرشح الحاجز
ChromaET595 / 50Mوحدتان ، مرشح الانبعاث للانبعاث الأصفر / الأخضر (مثل Cy3B) في OptoSplit III وكذلك في مرشح انبعاث عجلة مرشح الحاجز
ChromaET525 / 50Mوحدتان ، مرشح الانبعاث للانبعاث الأزرق (مثل Alexa Fluor 488 / GFP) في OptoSplit III وكذلك في مرشح انبعاث عجلة المرشح الحاجز
SemrockFF02-447 / 60-25مرشح الانبعاث للانبعاث البنفسجي (مثل DAPI / Alexa Fluor 405) ، مثبتة في عجلة مرشح الحاجز
ثنائي اللون شعاع مقسمChromazt405 / 488/561/647 / 752rpc-UF3مقسم شعاع ثنائي اللون متعدد النطاقات لإثارة الليزر 647 و 561 و 488 و 405 نانومتر داخل جسم المجهر
مجموعة مرشح DAPIChroma49000المثبتة في جسم المجهر
ليزر نيكون / مرشح TIRFChroma91032
590 مرشح التمرير الطويلChromaT590LPXR-UF1للجمع بين ليزر 647 نانومتر وليزر 561 نانومتر
525 مرشح تمرير طويلChromaT525LPXR-UF1للجمع بين ليزر 647 نانومتر و 561 نانومتر مع ليزر 488 نانومتر
470 مرشح تمرير طويلChromaT470LPXR-UF1للجمع بين ليزر 647 نانومتر و 561 نانومتر و 488 نانومتر مع مرشح تنظيف ليزر 405 نانومتر
(647)Chromazet640 / 20xلتنظيف الأطوال الموجية الأخرى من مرشح التنظيف بالليزر بالليزر 647 نانومتر
(488)SemrockLL01-488-25لتنظيف الأطوال الموجية الأخرى من مصدر ضوء الليزر LED 488 نانومتر
ExcelitasX-Cite120LEDيستخدم فقط لتصوير DAPI
حامل المرآةنيوبورتSU100-F3K
المشاركات البصريةنيوبورتPS-2
شوكة لقطنيوبورتPS-F
عداد الطاقةنيوبورتPMKITلقياس طاقة
حامل ثنائي اللونEdmund Optics58-872C-Mount Kinematic Mount ، لعقد مجمعات الشعاع ثنائية اللون في مجموعة الإثارة بالليزر
حلقة الاحتفاظThorlabsCMRRالمستخدمة في حوامل الشعاع ثنائي اللون
لوحة محول الأليافThorlabsSM1FCFC / PC لوحة محول الألياف مع SM1 خارجي (1.035 "-40) الموضوع
Z- المحور الانتقاليجبل ترجمة ThorlabsSM1ZZ-Axis ، عدسة مزدوجة لونية متوافقة مع قفص 30
ThorlabsAC050-008-A-ML& Oslash ؛ 5 مم ، مزدوجات لونية مثبتة ، مطلية ب AR: 400 - 700 نانومتر
لوحة قفصThorlabsCP1TM0930 مم لوحة قفص مع خيوط داخلية M9 × 0.5 ، 8-32 قضيب
تجميع قفصالصنبور ThorlabsER4قضيب تجميع قفص ، 4 بوصات طويلة ، & Oslash ؛ 6 مم
قوس تركيب القفصThorlabsCP02B30 مم قوس تركيب قفص
أحادي الوضعتصحيح الألياف الضوئية ThorlabsP5-405BPM-FC-2، PM ، FC / PC إلى FC / APC ، 405 نانومتر ، الباندا ، 2 متر
الألياف الضوئية متعددة الوضعThorlabsM42L01& Oslash ؛ 50 وميكرو ؛ م ، 0.22 NA ، FC / PC-FC / PC كابل تصحيح الألياف ،
عدسة مزدوجة لونية 1 متر (عدسة ماج)ThorlabsACN127-025-AACN127-025-A - f = -25.0 مم ، & Oslash ؛ 1/2 "ثنائي لوني ، ARC: 400-700 نانومتر ، عدسة مقعرة في "عدسة ماج
مزدوجة لونية (عدسة ماج)ThorlabsAC127-050-Af = 50.0 مم ، & Oslash ؛ 1/2 "المزدوج اللوني ، ARC: 400-700 نانومتر ، عدسة محدبة في "عدسة ماج" حلقة
الاحتفاظThorlabsSM05PRRSM05 حلقة الاحتفاظ البلاستيكية ل & Oslash ؛ 1/2 "أنابيب وحوامل العدسات ، ل "عدسة ماج"
برغي نايلون ذوThorlabsSS3MN6M3 × 0.5 برغي نايلون ، بطول 6 مم ، لعقد "عدسة ثلاثية الأبعاد"
عدسة ثلاثية الأبعادبصريات ليزر CVIRCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700f = 10 م ، عدسة أسطوانية مستطيلة
كاميرا EMCCDAndoriXon Ultra 888
100 نانومتر حبات متعددة القنواتحراريT7279 ، TetraSpeck المجهرية
صبغة حمراءThermoAlexa Fluor 647
صبغة صفراء وخضراءGE HealthcareCy3
صبغة خضراءGE HealthcareCy3B
صبغة زرقاءThermoAlexa Fluor 488
مؤرض يحتوي ليزر ثنائي اللون ثنائي اللون ثنائي الليزر شعاع تركيب جبل مم كابل " عدسة رأس

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
  2. Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
  3. Klar, T. A., Hell, S. W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopySuper Resolution ImagingSingle Molecule FRETMulticolor DetectionEpifluorescence ImagingOptical AlignmentLaser ControlEmission Filter Wheel3D Lens InsertionData Acquisition Card

Related Articles