Method Article

إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر

DOI:

10.3791/58320

⸱

October 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, 2The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 3Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, 4Nikon Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا دليلاً عمليا لبناء نظام متكامل الفحص المجهري، والذي يدمج التقليدية برنامج التحصين الموسع-فلوري التصوير، وتصوير فائقة جزيء واحد القرار القائم على الكشف، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك نقل الطاقة صدى الأسفار جزيء واحد التصوير، إلى إنشاء واحدة بطريقة فعالة من حيث تكلفة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجهر الأسفار أداة قوية للكشف عن الجزيئات البيولوجية في الموقع ورصد ديناميات والتفاعل في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى الفحص المجهري التقليدي برنامج التحصين الموسع-الأسفار، تطورت تقنيات التصوير المختلفة لتحقيق أهداف تجريبية محددة. بعض التقنيات المستخدمة على نطاق واسع وتشمل الأسفار جزيء واحد الرنين نقل الطاقة (سمفريت)، التي يمكن أن تبلغ conformational التغييرات والتفاعلات الجزيئية مع القرار انغستروم، والقائم على الكشف عن جزيء واحد فائقة القرار (SR) التصوير، والذي يمكن أن يعزز هذا القرار المكانية حوالي عشرة إلى توينتيفولد مقارنة بالفحص المجهري حيود محدودة. وهنا يقدم نظام متكامل تصميم العميل الذي يقوم بدمج عدة أساليب التصوير في المجهر واحد، بما في ذلك تصوير برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت التقليدية، تصوير ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك التصوير سمفريت. ويمكن تحقيق أساليب التصوير المختلفة بسهولة وتكاثر بتبديل العناصر البصرية. هذا التشكيل من السهل أن تعتمد أي مختبر البحوث في العلوم البيولوجية مع حاجة إلى روتين وتجارب التصوير المتنوعة في خفض التكلفة والمساحة بالنسبة إلى بناء المجاهر منفصلة لأغراض فردية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجاهر الأسفار أدوات هامة لبحوث العلوم البيولوجية الحديثة والتصوير الفلورسنت تتم بشكل روتيني في الكثير من مختبرات البيولوجيا. بوضع علامات الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام مع فلوروفوريس، ونحن مباشرة تصور لهم تحت المجهر وتسجيل التغييرات التي تعتمد على الوقت في الترجمة، والمطابقة، والتفاعل، والجمعية الدولة فيفو في أو في المختبر. مجاهر الفلورية التقليدية لدينا قرار حيود محدودة المكاني، الذي هو ~ 200-300 نانومتر في الاتجاه الأفقي، وشمال البحر الأبيض المتوسط ~ 500-700 في الاتجاه المحوري1،2، وهي، لذلك، تقتصر على التصوير في 100s من مقياس نانومتر إلى ميكرون. وقد وضعت بغية الكشف عن التفاصيل الدقيقة في الجمعية الجزيئية أو المنظمة، ميكروسكوبيس ريال المختلفة التي يمكن كسر الحد حيود. وتشمل الاستراتيجيات المستخدمة لتحقيق ريال التأثيرات البصرية غير الخطية، مثل الانبعاثات حفز استنفاد (STED) الفحص المجهري3،4 والمنظم الإضاءة مجهرية (SIM)5،6، 7، كشف العشوائية لجزيئات مفردة، مثل التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)8 وفوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل)9، ومزيج من الاثنين، مثل مينفلوكس10. بين هذه ميكروسكوبيس ريال، يمكن تعديل مجاهر ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد بسهولة نسبيا من هيكل مجهر جزيء واحد. مع التنشيط المتكررة وتصوير فوتواكتيفاتابل البروتينات الفلورية (FPs) أو صور التحويل الأصباغ معلم على الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام، القرار المكانية يمكن أن تصل إلى 10-20 نانومتر11. للحصول على معلومات بشأن التفاعلات الجزيئية و conformational مطلوب الديناميات في القرار في الوقت الحقيقي، انغستروم إلى نانومتر. سمفريت،من1213 نهج واحد لتحقيق هذا القرار. عموما، واعتماداً على الأسئلة البيولوجية للفائدة، يلزم أساليب التصوير مع القرارات المكانية المختلفة.

عادة، لكل نوع من التصوير، يلزم تكوين محدد الإثارة و/أو الانبعاثات الضوئية. على سبيل المثال، أحد أساليب الإضاءة الأكثر استخداماً للكشف عن جزيء واحد من خلال الانعكاس الداخلية مجموع (النقل البري)، التي تحتاج إلى تحقيقه من خلال موشور أو من خلال عدسة الهدف بزاوية معينة من إثارة. للكشف عن سمفريت، الانبعاثات من الأصباغ كل من المانحين ويقبلون بحاجة إلى فصل مكانياً والموجهة إلى أجزاء مختلفة من الإلكترون ضرب، جهاز (امككد)، الذي يمكن أن يتحقق مع مجموعة من المرايا وشق شعاع مزدوج اللون وضعت في طريق الانبعاث. ثلاثي الأبعاد (3-D) ريال التصوير، عنصرا بصرية، مثل عدسة أسطوانية14، تحتاج ليسبب تأثير الاستجماتيزم في مسار الانبعاثات. ولذلك، [هومبويلت] أو مجاهر المتكاملة المتاحة تجارياً، عادة، وظيفيا المتخصصة لكل نوع من التصوير أسلوب وليست مرنة للتبديل بين مختلف أساليب التصوير في إنشاء نفس. نقدم هنا هو نظام هجين فعالة من حيث التكلفة، يوفر قابل للتعديل واستنساخه للتبديل بين ثلاث طرق مختلفة التصوير: تصوير برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت التقليدية مع القرار حيود محدودة، ريال على أساس الكشف عن جزيء واحد التصوير، والكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان، بما في ذلك سمفريت التصوير (الشكل 1A). على وجه التحديد، يتضمن الإعداد المقدمة هنا إلى جانب ألياف الليزر الإدخال للإثارة متعدد الألوان وذراع إضاءة تجارية في مسار الإثارة، الذي يسمح المبرمجة تحكم زاوية الإثارة، للتبديل بين وضع النقل البري الدولي وفي وضع برنامج التحصين الموسع. في مسار الانبعاثات، كاسيت عدسة أسطوانية قابلة للإزالة [هومبويلت] يوضع داخل الجسم المجهر للتصوير ثلاثي الأبعاد بريال، ويوضع مقسم شعاع تجارية قبل كاميرا امككد التي يمكن تمكين بشكل انتقائي للكشف عن قنوات متعددة في الانبعاثات في نفس الوقت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-المجهر التصميم والجمعية

  1. مسار الإثارة
    ملاحظة: يتضمن مسار الإثارة أشعة الليزر ومكونات التباين (DIC) التدخل التفاضلية والجسم مجهر وذراعها الإضاءة.
    1. إعداد جدول ضوئية عزل الاهتزازات. على سبيل المثال، يعطي جدولاً التخميد هيكلية من 48 × 96 x 12 '' مساحة كافية لكافة المكونات.
      ملاحظة: بناء الهيكل في غرفة مع التحكم في درجة الحرارة (مثل، 21.4 ± 0.55 درجة مئوية). استقرار درجة الحرارة أمر حاسم للحفاظ على محاذاة البصري.
    2. تثبيت جهاز مجهر مجهز بذراع إضاءة للاتصال بالألياف الضوئية، 100 × النفط-الغمر TIRF الهدف العدسة، ومكونات DIC.
    3. ضع أربعة رؤساء الليزر (647 نانومتر، 561 نانومتر، 488 نانومتر، و 405 نانومتر، مطوقة الشكل 1B) الحرارة المصارف على الطاولة الضوئية، وتأكد من أشعة الليزر المنبعثة لها نفس الارتفاع وهي قصيرة قدر الإمكان لضمان استقرار جيدة (مثل ، 3 '').
      ملاحظة: إذا كان رأس ليزر يجلس على ارتفاع أقل من غيرها الليزر، وضع صفيحة ألومنيوم بسماكة كافية تحته. دائماً ضمان الحد الأقصى من الاتصال بين المصارف الحرارة والجدول البصرية لتبديد الحرارة أفضل (الشكل 1B). الليزر بحاجة إلى أن تكون قوية بما يكفي لتصوير ريال. انظر الجدول للمواد. من المستحسن أن يكون الليزر تنظيف المرشحات أمام ليزر صمام ثنائي.
    4. تثبيت بطاقة الحصول على بيانات من خلال واجهة interconnect (PCI) مكون طرفية في محطة عمل والاتصال أشعة الليزر باستخدام هذه البطاقة. التحكم في السلوكيات ON/OFF الليزر الترانزستور الترانزستور منطق (TTL) إخراج وتكيفهم السلطة بإخراج تمثيلية لهذه البطاقة (الشكل 1). تثبيت الفحص المجهري سليم التصوير البرمجيات (تجارية أو [هومبويلت]) للتحكم في بطاقة حيازة البيانات، فضلا عن الجسم المجهر.
    5. جبل المرايا وشق شعاع مزدوج اللون (590 و 525 و 470 طويلة تمرير مرشحات) لما يتصاعد منها. استخدام يتصاعد مرآة مستقرة جداً للمرايا. استخدام شق دائري مع الاحتفاظ بحلقات لتجنب ثني أي من شق شعاع مزدوج اللون (الشكل 1).
    6. وضع المرايا وشق شعاع مزدوج اللون على الطاولة الضوئية الجمع بين أشعة الليزر (الشكل 1B). لتحقيق المحاذاة الأكثر استقرارا، تجعل هذا الترتيب كله حسب الاتفاق قدر الإمكان، واستخدام الوظائف البصرية 1 ''-سمك. ترتيب الليزر حيث أن الليزر الطول الموجي أقصر أقرب إلى اقتران الألياف البصرية (الشكل 1B) نظراً للطول الموجي القصير الأضواء تتبدد أكثر في الهواء.
    7. الجمع بين أشعة الليزر في ألياف الضوئية طريقة واحدة. للقيام بذلك، بناء مقرنة ألياف في قفص نظام من خلال الخطوات التالية:
      1. تحميل لوحة محول ألياف في جبل محور ع ترجمة (الشكل 1E، الفريق الموجود في أقصى اليمين).
      2. جبل عدسة يبنوا متعامي (البعد البؤري = 7.5 ملم) في لوحة قفص (الشكل 1E، الفريق الثاني من اليسار).
      3. اتصال أجزاء اثنين أعلاه بمد قضبان شكل قفص. جبل القفص على الطاولة الضوئية مع تصاعد بين قوسين على الوظائف 1 '' سميكة ضوئية (الشكل 1E، الفريق الأوسط).
      4. محاذاة 647-نانومتر الليزر أولاً مع ألياف الضوئية طريقة واحدة (نهاية FC/آسيا والمحيط الهادئ إلى المقرنة).
        ملاحظة: استخدام ألياف البصرية وضع متعددة من قبل استخدام الألياف الضوئية طريقة واحدة قد تساعد عملية المحاذاة محاذاة الخام. ضبط زوايا المرايا وشق شعاع مزدوج اللون (الشكل 1، بالمقابض التكيف)، فضلا عن المسافة بين العدسة يبنوا متعامي ولوحة محول الألياف (الشكل 1E، عن طريق ضبط محور ع الترجمة جبل) للحصول على الليزر أقصى إنتاج الطاقة عن طريق الألياف.
      5. حالما يتم محاذاة أول ليزر، مؤقتاً تثبيت زوج من القزحيات ومحاذاة بقية الليزر واحداً تلو الآخر (الشكل 1F). التحقق من كفاءة المحاذاة مع مقياس طاقة.
      6. ترك واحدة القزحية الجزء الأمامي من لوحة محول للحد من انعكاسات الليزر.
        ملاحظة: قوي الظهر انعكاسات يمكن أن تقلل من عمر مصادر الليزر. بشكل اختياري، يمكن تثبيت عازل بصري أمام كل رئيس الليزر لإزالة الأفكار تماما.
    8. توصيل الطرف الآخر من الألياف الضوئية للذراع إضاءة المجهر (الشكل 1 ح).
    9. تصميم وتثبيت "التكبير عدسة (ماج)" من خلال الخطوات التالية:
      ملاحظة: يمكن استخدام الليزر لتصوير برنامج التحصين الموسع-الأسفار من العينة، ولكن حجم الضيق شعاع الليزر كل حدود المنطقة المضاءة من العينة إلى منطقة عدة مرات أصغر من الحجم الفعلي للاستشعار الكاميرا المقابلة، لا سيما بالنسبة أحدث كاميرات (مع 18.8 مم في طول قطري مقارنة بطول 11.6 ملم التقليدية). وهكذا، من المستحسن توسيع شعاع لتحقيق إضاءة أكبر وتملق للعينة.
      1. تصميم ماج العدسة، والتي يمكن أن تندرج في ذراع الإضاءة (الشكل 1 ح).
        ملاحظة: يعتمد تصميم عدسة ماج على حيث يتم تثبيته. ويبين الشكل 1 ح مثال للتثبيت في الذراع الإضاءة، ولكن يمكن تثبيته في أي بقعة بعد أشعة الليزر وتحديدالمنطقه (انظر المناقشة). التصميم مع التصميم بمساعدة الكمبيوتر وصياغة البرامج.
      2. ضع اثنين achromatic عدسات مقعرة واحدة (البعد البؤري = و1)، والآخر محدب (البعد البؤري = و2) في حامل العدسة ماج الصنع (الشكل 2 ألف و 2 (ج))، مع المسافة يساوي مجموع أطوال بهم، و1 + و2 = (-25) + 50 = 25 مم (الشكل 2).
        ملاحظة: مع هذا الاختيار لأطوال، عدسة ماج يوسع الشعاع و2/| إف1| = طيات 2. توفر العدسة ماج براعة. ويمكن إزالتها باستئناف الإضاءة العادية دون توسيع الحزم (الشكل 2D) أو إدراجها في الاتجاه المعاكس لتركيز شعاع الليزر لتحقيق شدة إثارة أقوى.

2-انبعاث المسار

ملاحظة: مسار الانبعاثات تتكون من عدسة أسطوانية قابلة للإزالة وعجلة تصفية حاجز الفاصل انبعاثات كاميرا امككد (الشكل 1). لتحقيق أفضل نقطة انتشار الدالة (PSF) من جزيئات مفردة، يتم وضع منظور DIC بعيداً عن العدسة والهدف.

  1. إدراج مخصص-تصميم كاسيت أسطواني (عدسة ثلاثية الأبعاد)، التي يمكن أن تندرج في محلل DIC اليدوي فتحه في جسم المجهر (الشكل 3).
    ملاحظة: هذا التصميم لا يضر محلل DIC حيث يمكن إدراج كتلة محلل في البرج عامل التصفية.
  2. وضع العدسة ثلاثية الأبعاد من 10 أمتار من البعد البؤري في الكاسيت وأدخله في مسار شعاع انبعاث لخلق تأثير الاستجماتيزم اللازمة لاستخراج إحداثي z كل جزيء واحد14.
    ملاحظة: بشكل اختياري، يمكن وضع كاسيت عدسة ثلاثية الأبعاد أو الخروج من مسار الانبعاثات (الشكل 3).
  3. تثبيت تقسيم شعاع مزدوج اللون متعدد فرقة في برج التصفية داخل الجسم المجهر.
  4. تثبيت عوامل الانبعاثات.
    ملاحظة: يتم اختيار عوامل الانبعاثات حسب فلوروفوريس المفضل. اعتماداً على وحدة التصوير، تستخدم عوامل الانبعاثات وضعت في مواقع مختلفة كما هو موضح أدناه:
    1. لتصوير متسلسل متعدد الألوان برنامج التحصين الموسع-الأسفار أو تصوير ريال، استخدام مرشحات الانبعاثات توضع في عجلة تصفية حاجز متصل بجانب الجسم المجهر للتقليل من الاهتزاز في الجسم المجهر أثناء تبديل القناة (الشكل 1).
    2. لكشف متعدد الألوان المتزامنة (مثلاً، تجارب سمفريت)، وضع عامل تصفية آخر في الخائن انبعاثات (الاختيار الخطوة 4 للحصول على التفاصيل).
      ملاحظة: عادة، مقسم انبعاث تجارية وضعين للتحويل (أي، "المشاركة" أو "تجاوز" وسائط). لفصل الأضواء الانبعاثات لونياً للتصوير بالألوان متعددة متزامنة (وضع "المشاركة")، يتم استخدام مكعب تصفية عقد شق شعاع مزدوج اللون اثنين وثلاثة عوامل الانبعاثات ("ثلاثية المكعب،" الرقم 4 و 4 د). ويستخدم في تركيبة مع المكعب الثلاثي فتحه فارغة في عجلة تصفية الحاجز. للتصوير بالألوان متعددة متسلسلة، من ناحية أخرى، يتم استبدال المكعب الثلاثي مكعب يحتوي فقط على مرآة داخل ("تجاوز المكعب،" الشكل 4A و 4 د).
  5. قم بتثبيت الكاميرا امككد كالجزء الأخير من مسار الانبعاثات. استخدام اتصال USB PCI بتحقيق معدل إطار بسرعة.
    ملاحظة: من المستحسن كاميرا امككد للكشف عن جزيء واحد الأكثر حساسية، ولكن كاميرا سكموس متقدمة يمكن أن تكون بديلاً.

3-حيود محدودة التصوير مع برنامج التحصين الموسع-الإثارة

  1. ضبط زاوية عرضية الليزر الإثارة إلى وضع برنامج التحصين الموسع في الذراع الإضاءة.
  2. فك الارتباط مع العدسة ثلاثية الأبعاد إذا شارك (الشكل 3، اللوحة اليمنى).
  3. إدراج المكعب الالتفافية في التقسيم الانبعاثات (الشكل 4A و 4E، اللوحة السفلية).
  4. (اختياري) إدراج العدسة ماج لمنطقة إضاءة موسعة (الشكل 2D، اللوحة اليمنى).
    ملاحظة: مع استخدام عدسة ماج و 100 × النفط-غمر عدسة الهدف، حوالي 91 × 91 ميكرومتر2 يمكن أن تكون مضيئة بالتساوي، مما يلغي الحاجة استخدام مصدر ضوء أبيض ومكعبات تصفية متعددة.
  5. استخدام الفحص المجهري التصوير البرمجيات اتخاذ متعدد القنوات، و/أو Z-مكدس، والوقت الفاصل بين الصور.
    ملاحظة: هناك العديد من البرامج المتاحة للتصوير المجهري، وليس فقط من الشركات المصنعة للمجهر، بل أيضا من شركات الطرف الثالث أو مفتوحة المصدر للمطورين.

4-متعدد القنوات تصوير جزيء واحد بما في ذلك سمفريت

ملاحظة: نقل إلى موضع "فارغ" في عجلة تصفية الحاجز، حيث أنه يمكن أن تصل إلى جميع الانبعاثات مع أي الطول الموجي للمجموعة الثانية من مرشحات/مزدوج اللون شق شعاع في المقسم والانبعاثات.

  1. لإعداد الكشف عن جزيء واحد متعدد الألوان المعطل تداولها سطح الجزيئات15 استخدام الإثارة TIRF، بما في ذلك قياس سمفريت، وضبط زاوية الليزر الإثارة عرضية إلى الزاوية TIRF. فض الاشتباك ماج العدسة والعدسة ثلاثية الأبعاد.
  2. المشاركة في وضع ثلاث قنوات في التقسيم الانبعاثات (الشكل 1) من خلال الخطوات التالية:
    1. استبدال المكعب الالتفافية مع مكعب "معايرة" الذي يسمح للضوء للذهاب من خلال جميع القنوات (الشكل 4 باء و 4E).
    2. قم بتشغيل الكاميرا تحت DIC (أي، لا يوجد عامل تصفية الانبعاثات في عجلة تصفية الحاجز) وضبط الفتحة المقسم الانبعاثات حتى ثلاث قنوات منفصلة تماما تظهر على الشاشة.
      ملاحظة: إجراء هذه الخطوة مع ضوء غرفة مضاءة، لتصور كل القنوات.
    3. تشغيل مقابض التحكم ضبط رأسية وأفقية في المقسم والانبعاثات ومحاذاة القنوات الثلاث (الشكل 4E و 4F) تقريبا.
    4. إيقاف الكاميرا واستبدال المكعب المعايرة مع مكعب ثلاثية (الشكل 4 و 4E).
    5. ضع عينة مع الخرز متعدد القنوات 100 نانومتر على رأس 100 × عدسة الهدف والتركيز على العينة.
    6. قم بتشغيل الكاميرا والليزر 488 نانومتر والتكبير والتصغير في واحدة من الخرز مشرق وناعما محاذاة القنوات الثلاث التي تحول التكيف التحكم المقابض مرة أخرى (الشكل 4E وز 4).
      ملاحظة: حبات 100 نانومتر الأقنية ينبعث أطوال موجية مختلفة من الضوء على الإثارة 488 نانومتر، تمكين المحاذاة ثلاث قنوات.
  3. قم بتشغيل الكاميرا وأشعة الليزر، التركيز، وإيجاد موقف جيد مع كثافة بقعة معقولة. ضبط الوقت الليزر السلطة والتعرض لتحقيق مستويات مقبولة من الإشارات إلى الضجيج وفوتوبليتشينج. استخدام الفحص المجهري برامج التصوير لتأخذ صوراً بمرور الزمن.

5-ريال تصوير

ملاحظة: هذا هو جزيء واحد المستندة إلى الكشف المجهري ريال.

  1. لإعداد تصوير ريال، إدراج العدسة ثلاثية الأبعاد وإزالة العدسة ماج. تعيين وقت التعرض للكاميرا في قنوات الليزر المناسبة (مثل، مرض التصلب العصبي المتعدد 5-60). تحديد وتعيين يدوياً زاوية عرضية الليزر الإثارة الأمثل أن تكون الزاوية TIRF.
  2. ضع العينة في التصوير المخزن المؤقت16ريال. تسمح المخزن المؤقت لحجته لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل التصوير.
    ملاحظة: تنتهي ريال التصوير المخزن المؤقت بعد 1 ساعة تقريبا، لذا يجب ريال جديد التصوير المخزن المؤقت تبعاً لذلك.
  3. تأخذ صورة DIC قبل تصوير ريال. بغية إيجاد ارتفاع الهدف الصحيح لريال، الذي يحسن تأثير الاستجماتيزم، استخدم DIC التصوير للعثور على الطائرة المتوسطة للخلايا. تعريف الطائرة بالارتفاع الذي الخلايا الانتقال من "الخفيفة" بالصور "الظلام" ويبدو أن تصبح شفافة (الشكل 5Aو 5B وج 5). حالما يتم تحديد المستوى البؤري المطلوب، إشراك نظام تصحيح z-الانجراف (الشكل 1A).
  4. إجراء تصوير ريال. تغيير قوة 405 نانومتر الليزر للحفاظ على كثافة معقولة 'وامض على' البقع.
    ملاحظة: في حين أنه من الممكن لتغيير الليزر 405 نانومتر يدوياً، أكثر ملاءمة لتشغيل رمز اقتناء بيانات مبرمجة للحفاظ على كثافة البقع "امض على". هنا مثال عن كيف تتم تلقائياً. شفرة المصدر متاح عند الطلب (الشكل 6).
    1. بدء الحصول على التصوير مع 0 واط/سم2 الليزر البنفسجي السلطة.
    2. عد الوميض على البقع في فترة زمنية معينة.
    3. تعدل قوة الليزر البنفسجي حيث أن يتم الإبقاء على عدد البقع وامض على عتبة المعرفة من قبل المستخدم "عد" في مجال الرؤية. زيادة قوة الليزر البنفسجي عندما ينخفض عدد البقع وامض على عتبة عد الأصوات.
    4. إنهاء اقتناء عندما ينخفض عدد البقع وامض على عتبة العد باستخدام قوة الليزر البنفسجي الأقصى.
      ملاحظة: يمكن أن يكون الحد الأقصى لتعيين بشكل مختلف اعتماداً على سطوع عينة، ولكن لا يزيد عن 130 واط/سم2. اعتماداً على الهدف الفعلي لتصوير ريال، يمكن إنهاء هذه التعليمات البرمجية الحصول التلقائي يدوياً في أي وقت تريده.
  5. تحقق من سلوك وامض وبسفس البقع قريبا بعد بداية اقتناء.
    ملاحظة: إذا كان سلوك وامض ليست مثالية، تغيير زاوية عرضية الليزر الإثارة أو استبدالها في المخزن المؤقت للتصوير. تتوقع أخذ عينات "عمودي"، "الأفقي" والأشكال "الماس" من PSF، تمثل فلوروفوريس من أسفل، أعلاه، وضمن المستوى البؤري، على التوالي (الشكل 5). إذا كان إظهار معظم البقع بسفس الأفقي أو العمودي، ثم المستوى البؤري إيقاف من مركز الخلايا وحتى إنهاء التجربة وضبط المستوى البؤري مرة أخرى. وجود فقاعة هواء في النفط الغمر أو غيرها من العوامل المحلية يمكن أن تؤثر على نوعية بسفس، ولذلك قد يكون من الضروري لاستبدال النفط أو تغيير إلى منطقة تصوير مختلفة للعينة.
  6. لتحليل البيانات، استخدام المصدر المفتوح (في الإضافات إيماجيج المعاهد الوطنية للصحة) أو الرموز المتاحة تجارياً للكشف عن سينترويدس لكل نقطة في كل إطار التصوير واستخراج قيم z لكل نقطة من عرض x و y14.
    ملاحظة: في هذا التقرير، رمز مصدر وضعت أصلاً في واحدة من أقرب جزيء واحد على أساس الكشف عن ريال8 تعديل للكشف عن ثلاثي الأبعاد16 وتم استخدامه.
  7. وفي حالة التصوير باللونين، صورة فلوروفوري مع الطول الموجي الإثارة وقتاً أطول، تليها واحدة مع الطول الموجي أقصر الإثارة. تشغيل التعليمات البرمجية اقتناء الآلي وبالمثل إلى الموضحة في الخطوة 5، 4، ولكن مع ليزر تصوير مختلفة.
    ملاحظة: يجب تصحيح لوني بين الصور مع فلوروفوريس مختلفة (مثلاً، والصبغ الأحمر والصبغ الأصفر والأخضر). هنا هي الخطوات.
    1. شل عدة حبات الأقنية 100 نانومتر على ساترة زجاجية، تجنب تكوين مجموعات.
    2. التقاط صور منها في قنوات مختلفة من الإثارة.
    3. استخراج (X, Y, Z) بتنسيق من البرمجيات (الخطوة 5، 6).
    4. ارسم ΔXأنا = X-1i X 2طاء والمادة ΔYi = Y1i -ص2i (لحبات مختلفة و 1 و 2 قنوات الألوان المختلفة) كل على حدة ويصلح لهم مع الوظائف المناسبة. حفظ المهام.
      ملاحظة: الوظائف الخطية كافية في معظم الحالات. حالما يتم تحديد هذه المهام، ليس لديه هذا القياس بأن يتكرر في كل مرة للتصوير.
    5. في تصوير ريال اللونين الفعلية عينة من الفائدة، تطبيق الوظائف إلى زيغ الصحيحة (X, Y). للاتجاه z زيغ، القيام بالحصول على ΔZ = ض1 -ض2 حبات الأقنية أو عينات مرجعية معروفة الأقنية المصنف جنبا إلى جنب مع عينة الفائدة.
      ملاحظة: عكس (س، ص) زيغ، الاتجاه z زيغ ليس جيدا استنساخه في كل تجربة، ويرجع ذلك أساسا إلى صيانة غير كاملة الاتجاه z التركيز عند التبديل القناة. ومن ثم، يوصي بإجراء التصحيح في كل مرة. ΔZ = ض1 -ض2 في الغالب مستقلة (X, Y)، حتى مجرد عدد قليل من حبات أو العينات المرجعية سيكون كافياً كل منطقة عينة كل الاهتمام. ارسم الصور ريال اللونين النهائية شيدت في برمجيات تصور ثلاثي الأبعاد وتحقق ΔZ يدوياً.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويسمح هذا المجهر مرنة واستنساخه بالتبديل بين مختلف أساليب التصوير. هنا نعرض عينة من الصور التي تم جمعها مع كل وحدة التصوير.

يوضح الشكل 5 PSF جزيء وامض في أثناء اقتناء ريال. يتم بناؤها الآلاف من مثل هذه الصور لإنشاء الصورة النهائية ريال (الشكل 5E). ويبين الشكل 5E الكشف التنظيمي البكتيرية نفس كما هو موضح في الصورة برنامج التحصين الموسع-الأسفا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظام المجهر الهجين هذا يلغي الحاجة إلى شراء مجاهر متعددة. التكلفة الإجمالية لجميع أجزاء، بما في ذلك الجدول البصرية، والبرمجيات والجدول التثبيت العمالة ومحطة العمل، هو حوالي 230,000 دولار. أجزاء آلة مخصصة، بما في ذلك ماج العدسة والعدسة ثلاثية الأبعاد، ويتكلف حوالي مبلغ 700 (التكلفة تعتمد على الرسوم الفعلية في معاهد مختلفة). النموذجية المتاحة تجارياً النظم المتكاملة لجزيء واحد المستندة إلى الكشف المجهري ريال تكلف أكثر من 300,000 دولار ~ 000 400 وهي غير متاحة لقياس سمفريت، أو برنامج التحصين الموسع-تصوير لمجال رؤية معقولة، د...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتسلم J.F. الدعم من برنامج العلماء سيرل وجائزة ابتكار جديدة لمدير المعاهد الوطنية للصحة. الكتاب تقر اقتراحات مفيدة من مختبر بول Selvin (جامعة إلينوي، اوربانا-شامبين) لتحديد المواقع العدسة ثلاثية الأبعاد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
نيكون Ti-E المجهر حاملنيكونTi-E
عدسة موضوعيةنيكون100X NA 1.49 CFI HP TIRF
برنامج التصوير المجهريNikonNIS-Elements Advanced Research / HCHC يتضمن وحدة "JOBS" ، وحدة الاستحواذ المبرمجة المستخدمة للتصوير SR.
ذراع الإضاءةنيكونTi-TIRF-EM وحدة الإضاءة الآلية Mيحتوي هذا الذراع على فتحة لعدسة تكبير
تحليل كتلةنيكونTi-Aيتم تثبيته في برج المرشح.
نظام تصحيح Z-driftنيكونPFSيتكون هذا النظام من محرك متدرج على قطعة الأنف الموضوعية ، ومصباح LED بالأشعة تحت الحمراء ، وكاشف.
سطح طاولة بصريTMC783-655-02R
قواعد طاولة بصريةTMC14-426-35
647 نانومتر ليزرCobolt90346 (0647-06-01-0120-100)الصمام الثنائي بالليزر المعدل 647 نانومتر 120 ميجا واط بما في ذلك رأس الليزر ، صندوق التحكم CDRH ، كابل USB و PSU (وحدة إمداد الطاقة)
561 نانومتر ليزرمتماسك1280721OBIS 561nm LS 150mW نظام ليزر
488 نانومتر ليزرCobolt90308 (0488-06-01-0060-100)الصمام الثنائي بالليزر المعدل 488 نانومتر 60 ميجا واط بما في ذلك رأس الليزر ، صندوق التحكم CDRH ، كابل USB و PSU (وحدة إمداد الطاقة)
405 نانومتر ليزرCrystalaserDL405-025-O405 (+/- 5) نانومتر ، 25 ميجا واط ، دائري ، M2 < ؛ 1.3 ، ضوضاء منخفضة ، CW ، TTL حتى 20 ميجا هرتز. 2 موصلات BNC ل TTL & ضبط تناظري
بالوعة الحرارةCobolt11658 (HS-03)وحدتان ، بالوعة حرارية بدون مروحة HS-03 ، بالوعة حرارية لليزر 647 نانومتر و 488 نانومتر
بالوعة حراريةمتماسكة1193289Obis بالوعة حرارية مع مروحة ، 165 × 50 × 50 مم لليزر 561 نانومتر
CAB-USB-miniUSBCobolt10908وحدتان ، كابل اتصال ليزر 647 نانومتر و 488 نانومتر
من الألومنيوم لتعديل الارتفاعMcMaster-Carr9146T35متعدد الأغراض 6061 ألومنيوم ، قضيب مستطيل ، 4 مم × 40 مم ، 1 'طويل لرفع 561 نانومتر
ألومنيوم ليزر لتعديل الارتفاعMcMaster-Carr8975K248متعدد الأغراض 6061 ألومنيوم ، 1-1 / 4 بوصة سميكة × 3 بوصة عرض × 1 بوصة طول لرفع 405 نانومتر
كابل ليزر BNCL-comCC58C-6RG58C كابل متحد المحور ، BNC ذكر / ذكر ، محول BNC 6.0 قدم
L-comBA1087محول متحد المحور ، حاجز BNC ،
محول SMA إلى BNCHODSMA-870Cobolt MLD على واجهة SMA ، لذلك يتم استخدام هذا المحول لاتصال BNC.
SMB إلى BNC محولفيرفيو الميكروويفFMC1638316-12SMB التوصيل إلى BNC أنثى الحاجز كابل RG316 Coax في 12 بوصة لليزر Obis المتماسك
بطاقة الحصول على البياناتالأدوات الوطنيةPCI-672313 بت ، 32 قناة ، 800 كيلو ثانية / ثانية جهاز الإخراج التناظري للتحكم في الليزر ، DIC LED ، وغيرها
الحاجز تصفية عجلة التحكمأداة سوترأداة لامبدا 10-Bمبدل
الفلتر البصريانبعاث الفاصلCairnOptoSplit III
ثنائي اللون شعاع مقسمChromaT640LPXR-UF2شعاع يفصل الانبعاث الأحمر عن الانبعاث الأخضر في OptoSplit III
شعاع مقسمChromaT565LPXR-UF2اللون يفصل بين الانبعاث الأخضر والأحمر والانبعاث الأزرق في OptoSplit III
مرشح الانبعاثChromaET700 / 75Mوحدتان ، مرشح الانبعاث للانبعاث الأحمر (مثل Alexa Fluor 647) في OptoSplit III وكذلك في فلتر انبعاث عجلة المرشح الحاجز
ChromaET595 / 50Mوحدتان ، مرشح الانبعاث للانبعاث الأصفر / الأخضر (مثل Cy3B) في OptoSplit III وكذلك في مرشح انبعاث عجلة مرشح الحاجز
ChromaET525 / 50Mوحدتان ، مرشح الانبعاث للانبعاث الأزرق (مثل Alexa Fluor 488 / GFP) في OptoSplit III وكذلك في مرشح انبعاث عجلة المرشح الحاجز
SemrockFF02-447 / 60-25مرشح الانبعاث للانبعاث البنفسجي (مثل DAPI / Alexa Fluor 405) ، مثبتة في عجلة مرشح الحاجز
ثنائي اللون شعاع مقسمChromazt405 / 488/561/647 / 752rpc-UF3مقسم شعاع ثنائي اللون متعدد النطاقات لإثارة الليزر 647 و 561 و 488 و 405 نانومتر داخل جسم المجهر
مجموعة مرشح DAPIChroma49000المثبتة في جسم المجهر
ليزر نيكون / مرشح TIRFChroma91032
590 مرشح التمرير الطويلChromaT590LPXR-UF1للجمع بين ليزر 647 نانومتر وليزر 561 نانومتر
525 مرشح تمرير طويلChromaT525LPXR-UF1للجمع بين ليزر 647 نانومتر و 561 نانومتر مع ليزر 488 نانومتر
470 مرشح تمرير طويلChromaT470LPXR-UF1للجمع بين ليزر 647 نانومتر و 561 نانومتر و 488 نانومتر مع مرشح تنظيف ليزر 405 نانومتر
(647)Chromazet640 / 20xلتنظيف الأطوال الموجية الأخرى من مرشح التنظيف بالليزر بالليزر 647 نانومتر
(488)SemrockLL01-488-25لتنظيف الأطوال الموجية الأخرى من مصدر ضوء الليزر LED 488 نانومتر
ExcelitasX-Cite120LEDيستخدم فقط لتصوير DAPI
حامل المرآةنيوبورتSU100-F3K
المشاركات البصريةنيوبورتPS-2
شوكة لقطنيوبورتPS-F
عداد الطاقةنيوبورتPMKITلقياس طاقة
حامل ثنائي اللونEdmund Optics58-872C-Mount Kinematic Mount ، لعقد مجمعات الشعاع ثنائية اللون في مجموعة الإثارة بالليزر
حلقة الاحتفاظThorlabsCMRRالمستخدمة في حوامل الشعاع ثنائي اللون
لوحة محول الأليافThorlabsSM1FCFC / PC لوحة محول الألياف مع SM1 خارجي (1.035 "-40) الموضوع
Z- المحور الانتقاليجبل ترجمة ThorlabsSM1ZZ-Axis ، عدسة مزدوجة لونية متوافقة مع قفص 30
ThorlabsAC050-008-A-ML& Oslash ؛ 5 مم ، مزدوجات لونية مثبتة ، مطلية ب AR: 400 - 700 نانومتر
لوحة قفصThorlabsCP1TM0930 مم لوحة قفص مع خيوط داخلية M9 × 0.5 ، 8-32 قضيب
تجميع قفصالصنبور ThorlabsER4قضيب تجميع قفص ، 4 بوصات طويلة ، & Oslash ؛ 6 مم
قوس تركيب القفصThorlabsCP02B30 مم قوس تركيب قفص
أحادي الوضعتصحيح الألياف الضوئية ThorlabsP5-405BPM-FC-2، PM ، FC / PC إلى FC / APC ، 405 نانومتر ، الباندا ، 2 متر
الألياف الضوئية متعددة الوضعThorlabsM42L01& Oslash ؛ 50 وميكرو ؛ م ، 0.22 NA ، FC / PC-FC / PC كابل تصحيح الألياف ،
عدسة مزدوجة لونية 1 متر (عدسة ماج)ThorlabsACN127-025-AACN127-025-A - f = -25.0 مم ، & Oslash ؛ 1/2 "ثنائي لوني ، ARC: 400-700 نانومتر ، عدسة مقعرة في "عدسة ماج
مزدوجة لونية (عدسة ماج)ThorlabsAC127-050-Af = 50.0 مم ، & Oslash ؛ 1/2 "المزدوج اللوني ، ARC: 400-700 نانومتر ، عدسة محدبة في "عدسة ماج" حلقة
الاحتفاظThorlabsSM05PRRSM05 حلقة الاحتفاظ البلاستيكية ل & Oslash ؛ 1/2 "أنابيب وحوامل العدسات ، ل "عدسة ماج"
برغي نايلون ذوThorlabsSS3MN6M3 × 0.5 برغي نايلون ، بطول 6 مم ، لعقد "عدسة ثلاثية الأبعاد"
عدسة ثلاثية الأبعادبصريات ليزر CVIRCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700f = 10 م ، عدسة أسطوانية مستطيلة
كاميرا EMCCDAndoriXon Ultra 888
100 نانومتر حبات متعددة القنواتحراريT7279 ، TetraSpeck المجهرية
صبغة حمراءThermoAlexa Fluor 647
صبغة صفراء وخضراءGE HealthcareCy3
صبغة خضراءGE HealthcareCy3B
صبغة زرقاءThermoAlexa Fluor 488
مؤرض يحتوي ليزر ثنائي اللون ثنائي اللون ثنائي الليزر شعاع تركيب جبل مم كابل " عدسة رأس

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
  2. Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
  3. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
  4. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
  5. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  6. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  7. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  8. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  9. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  10. Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
  11. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
  12. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  13. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  14. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  15. Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
  16. Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
  17. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  18. Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
  19. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  20. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  21. Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
  22. Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopySuper Resolution ImagingSingle Molecule FRETMulticolor DetectionEpifluorescence ImagingOptical AlignmentLaser ControlEmission Filter Wheel3D Lens InsertionData Acquisition Card

Related Articles