Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Q: What is the main focus of this study?

The study focuses on isolating primary mouse hepatocytes and understanding hepatic protein synthesis.

Q: Why is non-radioactive labeling used?

Non-radioactive labeling is safer and allows for effective detection of nascent proteins.

Q: What are the applications of this protocol?

This protocol can be applied in research related to obesity, fatty liver, and type 2 diabetes.

Q: What challenges are associated with liver perfusion?

The perfusion step is challenging due to the small size of mouse blood vessels.

Q: How does this method contribute to metabolic disease research?

It provides insights into molecular alterations in hepatic energy and protein biosynthesis.

Esam S.B. Salem; Kazutoshi Murakami; Toshimasa Takahashi; Elise Bernhard; Vishnupriya Borra; Mridula Bethi; Takahisa Nakamura

doi:10.3791/58323

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي لتحليل توليف البروتين الوليدة بأسلوب العلامات غير مشعة L-أزيدوهوموالانيني

DOI: 10.3791/58323

October 23, 2018

Esam S.B. Salem*^1,2, Kazutoshi Murakami*², Toshimasa Takahashi², Elise Bernhard², Vishnupriya Borra², Mridula Bethi², Takahisa Nakamura^2,3,4

¹Department of Pharmacology and Systems Physiology, College of Medicine,University of Cincinnati, ²Division of Endocrinology,Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ³Division of Developmental Biology,Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ⁴Department of Pediatrics, College of Medicine,University of Cincinnati

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل خلايا الكبد الماوس الأساسي صحية ووظيفية. وقدمت إرشادات للكشف عن البروتين الوليدة كبدي من الركازة التوسيم غير المشعة للمساعدة في فهم الآليات الأساسية تخليق البروتين في سياق التوازن الطاقة الأيض في الكبد.

Abstract

خلايا الكبد خلايا الكبد متني وممارسة وظائف ايضية متعددة، بما في ذلك تجميع وإفراز البروتينات ضروري للتوازن الطاقة الشاملة. خلايا الكبد الأولية المعزولة من الكبد مورين تشكل أداة بيولوجية قيمة لفهم الخصائص الوظيفية أو التغييرات التي تحدث في الكبد. هنا يمكننا وصف أسلوب للعزلة والثقافة من خلايا الكبد الماوس الأساسي قبل تنفيذ أسلوب نضح كولاجيناز خطوتين ومناقشة الاستفادة منها للتحقيق في استقلاب البروتين. هو perfused الكبد من الماوس الكبار التتابع مع حمض tetraacetic جليكول-مكررا (اجتا) وكولاجيناز، متبوعاً بعزل خلايا الكبد مع كثافة المخزن المؤقت التدرج. خلايا الكبد معزولة هذه قابلة للتطبيق على ألواح الثقافة والحفاظ على معظم الخصائص هبت لخلايا الكبد. يمكن استخدام خلايا الكبد هذه التقييمات استقلاب البروتين، بما في ذلك البروتين الوليدة مع الكواشف غير مشعة. ونحن تبين أن خلايا الكبد معزولة يتم التحكم فيها بسهولة وتشمل استقرار أعلى جودة وحجم تخليق البروتين مرتبطة باستقلاب الطاقة عن طريق استخدام رد فعل ربط الكيماوي انتقائية مع بروتين تيتراميثيلرهوداميني (طمره) طريقة الكشف والتحليلات الغربية النشاف. ولذلك، هذا الأسلوب قيمة للتحقيق في تخليق البروتين الوليدة الكبدية مرتبطة بالتوازن الطاقة. يحدد البروتوكول التالي المواد والأساليب لعزل خلايا الكبد الماوس الأساسية عالية الجودة، والكشف عن تخليق البروتين الوليدة.

Introduction

البروتين عنصر هام في تغذية، وحوالي 50% الوزن الجاف لجسم الإنسان يتكون من البروتينات التي لها العديد من الصفات البيولوجية ووظائف¹. ونتيجة لذلك، تخليق البروتين أحد الأحداث التي تستهلك معظم الطاقة وتغيير في التمثيل الغذائي البروتين يرتبط جداً مع تطور الأمراض، بما في ذلك الأمراض الأيضية²^،^،من³⁴. في الكبد، وحسابات تخليق البروتين الحيوي لحوالي 20-30 في المائة من الاستهلاك الإجمالي للطاقة⁵^،⁶. وباﻹضافة إلى ذلك، وظيفة البروتينات ليس فقط سلبية أو بناء كتل من الكبد، ولكن عوامل نشطة أيضا التوسط في إشارة إينتراسيلولارلي أو اكستراسيلولارلي لتنظيم الأيض الجهازية⁷. على سبيل المثال، انخفاض مستويات الزلال، الذي يتم تصنيعه ويفرزها الكبد والبروتين الأكثر وفرة في بلازما⁸، يزيد من خطر النوع 2 السكري التنمية⁹^،¹⁰^، ¹¹، في حين أن أعلى تركيز ألبومين المصل الحماية ضد تطوير المتلازمة الأيضية¹². وعلاوة على ذلك، تشعر بانزعاج أو اضطراب البروتينات الكبدية الافرازية أو الغشاء زمنياً، والتي تعدل التوازن نسبة الكولسترول في الدم، بما في ذلك البروتينات الدهنية، ولدلر، و LRP1، يمكن أن يؤدي إلى تطوير مقاومة الأنسولين، والدهون، أو تصلب الشرايين ¹³-ولذلك، تحديد الآليات الفيزيولوجية المرضية الجزيئية التي تشارك في اضطرابات التمثيل الغذائي البروتين في الكبد ومضاعفاته الأيضية المرتبطة بها قد تكون مفيدة لاكتشاف رواية الدوائية نهج تؤخر ظهور أو علاج الأمراض الأيضية مثل مقاومة الأنسولين وداء السكري والكبد الدهني غير الكحولية.

تخليق البروتين محكم مرتبط بمركز الطاقة الخلوية (مثلاً، تشكيل واحد ببتيد السندات خلال الخطوة استطالة تخليق البروتين يتطلب سندات phosphodiester 4¹⁴) وينظم مسارات الجزيئية التي بمعنى جملة بين الخلايا وداخلها توافر المغذيات¹⁵^،¹⁶. أمبير-تنشيط بروتين كيناز (أمبك) هو واحد من أجهزة استشعار الطاقة داخل الخلايا التي تحافظ على التوازن الطاقة¹⁷. حالما يتم تنشيط أمبك عندما تصبح أقل مستويات الطاقة الخلوية، تعمل أمبك ولها ركائز المستهدفة لتحفيز مسارات تقويضي وتمنع الابتنائية العمليات بما في ذلك البروتين التوليف¹⁸^،¹⁹. تنظيم تخليق البروتين هو توسط الفسفرة متعددة العوامل الترجمة والبروتينات ريبوسومال²⁰. من المذكرة، الهدف الثدييات من ربمسن 1 معقدة (mTORC1)، محرك رئيسي تخليق البروتين، أحد الأهداف الرئيسية من أمبك²¹. تنشيط المسار mTORC1 يعزز نمو الخلايا وانتشارها بالبروتين تنشيط الترجمة وأوتوفاجي^،من²⁰²¹. ولذلك، فمن المنطقي أن تنشيط أمبك يمكن أن تمنع mTORC1 بوساطة البروتين التوليف²². وفي الواقع، تفعيل AMPK يصد ومباشرة فوسفوريلاتيس mTORC1 على بقايا ثريونين 2446 (Thr²⁴⁴⁶) مما أدى إلى المنظمة²³ وقمع من البروتين الحيوي²⁴. وعلاوة على ذلك، أمبك يمكن أن تمنع غير مباشر وظيفة mTORC1 الفسفرة والتنشيط من التصلب درني المعقدة 2 (TSC2)²⁵ وهي الجهة المنظمة للمراحل الأولى من تتالي الإشارات mTORC1. وباختصار، التقلبات من هذه المسارات في الكبد وكثيراً ما يرتبط بتطور الأمراض الأيضية ولذلك هناك حاجة ماسة لإنشاء أدوات تجريبية فعالة التحقيق في دور هذه المسارات في تنظيم الطاقة و استقلاب البروتين في خلايا الكبد.

وهناك تشابه أقوى بين الخصائص الوظيفية لخلايا الكبد الأولية المعزولة و في فيفو خلايا الكبد من²⁷^،^،من²⁶ في المختبر المستمدة من الكبد الخلية خطوط²⁸. وقد ثبت أن خلايا الكبد البشرية الأولية مشاركة 77% التشابه مع خزعات الكبد، بينما تعرض الخلايا HepG2، وهي خلايا سرطانية كبدية المتمايزة جيدا وتستخدم على نطاق واسع للتحقيق في وظائف الكبد، أقل من 48% في سياق ملامح التعبير الجيني²⁹. ولذلك، استعمال خلايا الكبد الأولية، بدلاً من خلايا الثقافة مخلدة، له أهمية حيوية في التحقيق في وظيفة الكبد وعلم وظائف الأعضاء، وتتوفر العديد من البروتوكولات للعزلة والثقافة من خلايا الكبد الأولية خاصة من الفئران³⁰^،³¹. بينما خلايا الكبد في الفئران مفيدة مع عائد أعلى نسبيا من الخلايا، خلايا الكبد الماوس على إمكانيات أكبر في العديد من الجوانب العلمية بسبب توافر واسعة من الفئران المعدلة وراثيا. ومع ذلك، هناك العديد من التحديات التقنية في عزل خلايا صحية ووفيرة من الكبد الأولية من الفئران الخلوية والجزيئية-التقييمات المستندة إلى: أولاً، الإدراج القنية نتخلل في الكبد مع الكواشف المخزن المؤقت من الصعب جداً التعامل مع بسبب الوريد البابي الماوس صغيرة ورقيقة أو أدنى الوريد الأجوف؛ ثانيا، يمكن أن يسبب وقتاً أطول من تلاعب بالخلايا من خلال العزل الحد في الخلية الكمية والنوعية؛ أساليب الفصل الثالث، غير الانزيمية الميكانيكية يمكن أن تسفر عن أضرار جسيمة وإنتاج منخفضة عائد من خلايا الكبد الأولية المعزولة قابلة للتطبيق³²^،³³. في الثمانينات، بدأ كولاجيناز نضح تقنية لعزل خلايا الكبد من الكبد من الحيوانات³⁴. ويستند هذا الأسلوب على نضح كولاجيناز الكبد³⁵^،^،من³⁶³⁷، ضخ الكبد مع الكالسيوم تشيلاتور حل³⁸^،³⁹، الهضم الأنزيمي و الميكانيكية تفكك لحمه الكبد³⁵. في الخطوة الأولى، هو perfused كبد ماوس مع المخزن مؤقت حرة كالسيوم [Ca^{2 +}] يتضمن [Ca^{2 +}] تشيلاتور (حمض tetraacetic الإيثيلنديامين، يدتا). في الخطوة الثانية، هو perfused في الكبد الماوس مع عازلة التي تحتوي على كولاجيناز يتحلل التفاعلات المصفوفة خارج الخلية الخلوية. خلافا للمخزن المؤقت المستخدم في خطوة واحدة، الوجود [Ca^{2 +}] الأيونات في المخزن المؤقت للخطوة الثانية المطلوبة لنشاط كولاجيناز فعالة، قد الكبد هضمها بعد ذلك كذلك بلطف وميكانيكيا فصل استخدام الملقط بين كبسولة الكبد والأنسجة بارينتشيماتوس. أخيرا، تتم إزالة النسيج الضام بالتصفية والطرد المركزي اللاحقة يفصل بين خلايا الكبد سليمة من خلايا غير متني على حد سواء، وتتمثل غير الحية باستخدام الكثافة العازلة التدرج⁴⁰^،⁴¹ ^،⁴². في هذه الدراسة، نعرض تقنية التروية كولاجيناز خطوتين معدلة لعزل خلايا الكبد الأولية من كبد ماوس للتحليل تخليق البروتين.

راديولابيلينج البروتينات يستخدم على نطاق واسع قياس مستويات التعبير، معدلات دوران الموظفين، وتحديد التوزيع البيولوجي ل البروتينات⁴³ نظراً لحساسية عالية للكشف عن النشاط الإشعاعي⁴⁴. ومع ذلك، يتطلب استخدام النظائر المشعة البحوث العالية التي تسيطر عليها ظروف وإجراءات⁴⁵. تم تطوير طرق بديلة غير المشعة واكتسبت شعبية متزايدة. أن رد الفعل ربط الكيماوي انتقائية مع طريقة الكشف عن بروتين تيتراميثيلرهوداميني (طمره) هو واحد منهم ويقوم على رد الفعل الكيماوي الانتقائي بين أزيد وإضافة مجموعات⁴⁶، التي يمكن أن تستخدم لتحليل الأحداث الخلوية مثل الكشف عن البروتين الوليدة والفئات الفرعية ل glycoproteins تعديل مع جماعة أزيد. تخليق البروتين الوليدة، يمكن أيضي دمج البروتينات L-أزيدوهوموالانيني (L-اها، هو تعديل لأزيد من الأحماض الأمينية) والكشف عنها بواسطة استخدام الأسلوب الكشف عن البروتين طمره⁴⁷. باستخدام هذا الإنزيم في خلايا الكبد الماوس الأساسي، نحن تظهر أن معدل توليف البروتين الوليدة مشددة مرتبطة بتوافر ATP من الميتوكوندريا وتفعيل أمبك (الشكل 1).

وباختصار، الاستفادة من خلايا الكبد الماوس الأساسي أمر حاسم للتحقيق في استقلاب البروتين والطاقة والتحديد الكمي تخليق البروتين الوليدة قيمة لاكتساب رؤى في دور الفيزيولوجية من المسارات ذات الصلة بتنمية و علاج للأمراض التي تتمثل.

Protocol

ويتضمن هذا البروتوكول استخدام فئران المختبرات. رعاية الحيوان وإجراءات تجريبية أجريت وفقا للإجراءات التي أقرتها لجان الرعاية الحيوانية سينسيناتي الأطفال مستشفى المركز الطبي.

1-عزل خلايا الكبد الأساسي للماوس

التحضير قبل عزلة
1. إعداد 450 مل من 40% الكثافة المتدرجة المخزن المؤقت كما هو موضح في الجدول 1 وتبقى عند 4 درجة مئوية (15 مل/الماوس).
2. إعداد 500 مل المتوسطة ويليامز كما هو موضح في الجدول 1 ، والحفاظ على 4 درجة مئوية.
3. إعداد 500 مل دميم كما هو موضح في الجدول 1 ، والحفاظ على الجليد (30 مل في الماوس).
4. إعداد 500 مل من المخزن المؤقت هبس (-) كما هو موضح في الجدول 1 والحفاظ على 42 درجة مئوية في حمام الماء (40 مل/الماوس).
5. إعداد 500 مل حبس (+) المخزن المؤقت مع 0.3 ملغ/مل كولاجيناز نوع X كما هو موضح في الجدول 1 بحضانة 30 دقيقة في 42 درجة مئوية في حمام الماء (40 مل/الماوس).
6. إعداد المضخة التروية بوضع أنابيب الإدارة (I.V) عن طريق الحقن الوريدي عبر دواسة القدم الإغلاق والتحقق من تدفق بيغ الحل دون فقاعات الهواء.
7. الاحماء سخان أنبوب في 42درجة مئوية.
8. يبرد الجهاز أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
التخدير والتروية
1. تنظيف بمجالات العمل والمضخة.
2. شطف من الأنبوب الرابع متصل بالمضخة عن طريق تشغيل 70% إيثانول جيدا لمدة 10 دقيقة.
3. إزالة الإيثانول المتبقي من الأنبوب الرابع متصل بمضخة قبل الشطف مع دو كلياً لمدة 10 دقيقة.
4. يمسح بالمقص والملقط مع الإيثانول 70%.
5. ضع الماوس في وعاء من بلاستيك مع قاع فتحات الشباك وشاش غارقة في إيسوفلوراني 2 مل تحت الشبكة لتجنب الاتصال المباشر.
6. تقويم عمق التخدير بدواسة ريفلكس (قرصه إصبع ثابتة).
7. إزالة الماوس عندما وصلت إلى عمق التخدير المطلوب.
  ملاحظة: لا ينبغي وقت تحريض التخدير أكثر من 1 دقيقة.
8. بناء مخروط الآنف باستخدام أنبوب مخروطي 15 مل مع لوحة غارقة في إيسوفلوراني 1 مل دفعت إلى نهاية الأنبوب.
9. التحكم في عمق التخدير عن طريق تحريك مخروط الآنف أقرب أو بعيداً عن الخياشيم الماوس.
10. ضع الماوس على منصة العمل مع الجانب البطني مواجها لأعلى.
11. رش الإيثانول 70% فوق منطقة البطن للماوس وثم فتح تجويف البطن بإجراء شق كبير عرضية من باطن الجلد والغشاء البريتوني باستخدام مقص حاد وملقط مسنن.
12. ثم، قم بقطع عمودية من طبقات البطن حتى تتعرض جميع أجهزة البطن تماما باستخدام مقص حاد وملقط مسنن.
13. ويتعرض وضوح الخطوة الصغيرة والأمعاء الكبيرة تجاه الجانب الأيسر للماوس مع تلميح يعقم القطن حتى الكبد والوريد البابي، وأدنى الوريد الأجوف (IVC).
14. إدراج قسطرة ز 24 في IVC فقط في التشعب بالوريد الكلوي الحق بعناية دون المصافحة بالأيدي لتجنب إصابة IVC والنزيف.
  ملاحظة: في حال حدوث نزيف في حين تقوم بإدراج القسطرة في IVC، ثم ينبغي محاولة إدراج القسطرة الجديدة في الوريد portal.
15. إزالة الإبرة للقسطرة والتحكم في موضع قنية لتجنب الخروج IVC، ثم قم بتوصيل قنية ز 24 مع أنبوب التروية باستخدام الموصل.
  ملاحظة: تجنب وجود فقاعات الهواء قبل البدء في التروية.
16. بدء نضح الكبد مع حبس الحارة (-) بمعدل تدفق 4 مل/دقيقة وقطع الوريد الطحال بسرعة استنزاف خارج الدم الداخلية باستخدام مقص.
  ملاحظة: إذا كان كانوليشن نجاح، سوف تبدأ الكبد لانش بسبب توزيع الدفق من المخزن المؤقت من IVC إلى الأوردة الكبدية. يتشكل الوريد البابي الاتحاد للاوردة المساريقي العلوي الطحال ومتفوقة؛ ولذلك، أنها آمنة تماما قطع الوريد الطحال حيث أنها كبيرة والبعيدة من الكبد.
17. مواصلة التروية مع 35 مل من حبس الحارة (-).
  ملاحظة: سيصبح الكبد شاحب اللون إذا كان التروية الكافية، والماوس لا يزال على قيد الحياة تحت التخدير في هذه المرحلة.
الهضم واستخراج
1. نتخلل الكبد الماوس مع الحارة 35 مل من حبس (+) بما في ذلك كولاجيناز نوع X بمعدل تدفق 4 مل/دقيقة.
2. كل بضع دقائق، المشبك على المنوال الطحال باستخدام الملقط ~ 10 s للسماح لوحدة التخزين بأكملها من حبس (+) منتشر في جميع الأجزاء التشريحية للكبد.
  ملاحظة: يبدأ الكبد الإنتفاخ بعد لقط على المنوال الطحال بسبب الازدحام المخزن المؤقت.
3. صب 5 مل حبس الحارة المعدة (+) مع كولاجيناز نوع X في 100 مم طبق بيتري في نهاية عملية التروية.
4. قطع الكبد بيرفوسيد من بقية أنحاء الجسم قبل إيقاف المضخة تجنب الدفق الدم في الكبد وإزالة المرارة بالملقط ثم يمسح الكبد بلطف بمنشفة ورقية لإزالة الدم.
5. نقل الكبد إلى طبق بتري الذي يحتوي على 5 مل حبس الحارة المعدة (+) وإزالة الكبسولة الكبد برفق باستخدام الملقط مقلوب على التوالي.
  ملاحظة: الكبسولة الكبد هو طبقة رقيقة من الأنسجة الضامة التي تحيط بالكبد.
6. تفريق نسيج متني بعناية باستخدام الملقط. إضافة 15 مل دميم الباردة إلى طبق بيتري.
  ملاحظة: المتوسط سوف تتحول غائم بسبب الخلايا متني إذا الكبد يهضم جيدا.
7. هز الكبد ممزقة برفق للإفراج عن الخلايا متني المتبقية في المتوسط وإضافة آخر 15 مل دميم الباردة إلى طبق بتري للحصول على بقية الخلايا.
8. نقل دميم في الكبد تم حله من خلال 100 ميكرومتر خلية مصفاة في أنبوب 50 مل مخروطية والاحتفاظ بالجليد.
تنقية
1. الطرد المركزي من تعليق خلية في ز 60 x دقيقة 2 في 4 درجات مئوية، بعناية وإزالة المادة طافية بالشفط بالتخلية وريسوسبيند بيليه في 10 مل دميم.
2. أضف حراكه بيليه كطبقة رقيقة على رأس 40% الكثافة المتدرجة المخزن المؤقت، والطرد المركزي في 800 × ز لمدة 10 دقائق دون الفرامل في 4درجة مئوية.
3. بعناية إزالة المادة طافية بما في ذلك الطبقة العليا (دميم) وطبقة وسطى (خلايا ميتة أو غير متني)، ولكن ليس الطبقة السفلي (بيليه: خلايا الكبد متني الأولية).
4. ريسوسبيند الخلايا الأولية مع ه 2 – 3 مل وليام المتوسطة، ونقل إلى أنبوب 50 مل جديدة لتفادي تلوث خلايا ميتة على جدار الأنبوبة.
5. إضافة المتوسط 7-8 مل وليام ه وتخلط بلطف والطرد المركزي في ز 800 x لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
6. بعناية إزالة المادة طافية بالشفط بالتخلية وثم ريسوسبيند بيليه مرة أخرى مع 10 أو 20 أو 30 مل من المتوسطة وليام ه (وفقا لحجم بيليه).
7. حساب عدد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية.
8. البذور مع المتوسط وليام ه، والحفاظ اللوحة في حاضنة في 37درجة مئوية ح 2-3، ثم استبدال % with10 المتوسطة المتوسطة دميم FBS مع مكافحة المضادة لإزالة الخلايا ميتة أو فاتحة وبين عشية وضحاها الحضانة عند 37 درجة مئوية.
9. وفي اليوم التالي الماوس الأساسي خلايا الكبد جاهزة للاستخدام التجريبي.

2-الكيماوي انتقائية ربط رد فعل المقايسة للكشف عن البروتين الوليدة

وضع العلامات الاستقلابية
1. (ما قبل المعالجة) يغسل خلايا الكبد الأولية مع برنامج تلفزيوني الحارة 37 درجة مئوية مرتين وإضافة احتياطيات متوسطة دميم خالية من الميثيونين لمدة 30 دقيقة إلى استنزاف الميثيونين هيولى.
  ملاحظة: L-أزيدوهوموالانيني، هو من الأحماض الأمينية والتناظرية إلى الميثيونين، ويحتوي على مجموعة أزيدو التي يمكن إدراجها في البروتينات خلال التركيب الحيوي للبروتينات الخلوية حيث أنه سيعزز استنفاد الميثيونين هيولى تغذية والتأسيس من أزيدوهوموالانيني ل في البروتينات المركبة حديثا لاستزراع خلايا الكبد الأولية.
2. (العلاج) الحارة PBS مرتين يغسل خلايا الكبد الأولية مع 37 درجة مئوية وإضافة المتوسطة دميم خالية من الميثيونين مع 25 ميكرومترات اها (L-أزيدوهوموالانيني) ح 4 – 6.
3. إضافة أي مادة كيميائية محددة (أي 10 ميكرومترات والروتينون) في متوسطة لمدة 4 – 6 ح في وجود اها بغية التحقيق في تأثيره على مستويات التعبير البروتين الوليدة.
4. بعد الحضانة، إزالة المتوسطة بالشفط بالتخلية ويغسل خلايا الكبد الأولية مع برنامج تلفزيوني الباردة ثلاث مرات.
5. إضافة 200 ميكروليتر تحلل العازلة اللوحة واحتضان لمدة 15-30 دقيقة على الجليد، ثم إمالة اللوحة وتتخذ الخلية كله في أنبوب 1.7 مل.
  ملاحظة: يمكنك يجب مراعاة تلك الخلية ليستي لزجة جداً أثناء الحصاد الخلية.
6. Sonicate الخلية ليساتي على الجليد ل 5 s ثلاث مرات باستخدام سونيكاتور مسبار لجعل البروتينات وتفريق الحمض النووي.
7. الطرد المركزي الخلية في 21,130 س ز لمدة 10 دقائق في 4 ^سج دوامة الخلية لمدة 5 دقائق، وبعد ذلك نقل المادة طافية واضحة في أنبوب جديد. قياس تركيز البروتين مرتين.
  ملاحظة: في هذه المرحلة، عينات البروتين يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية لمدة أسبوعين إذا لم يتم استخدامها فورا.
وسم البروتين الوليدة تعديل أزيد
1. إعداد المكونات (ألف + باء) بإضافة 60 ميكروليتر من العنصر (A) للعنصر (ب).
  ملاحظة: الحل الذي يتحول إلى وردي مشرق اللون بعد إضافة العنصر (أ) إلى (ب).
2. إعداد المخازن المؤقتة (د) و (ه) طبقاً للبروتوكول.
3. يستغرق 20-40 ميكروغرام خلية ليستي وإضافة 50 ميكروليتر 2 × رد فعل المخزن المؤقت (المكون A + B)، ثم ضبط مستوى الصوت إلى 80 ميكروليتر بإضافة دو ودوامه ل 5 ق.
4. إضافة 5 ميكروليتر CuSO4 (العنصر جيم)، ودوامه ل 5 ق.
5. إضافة 5 ميكروليتر رد فعل المخزن المؤقت 1 المضافة (مكونات الطازجة د)، ثم دوامة ل 5 s وانتظر لمدة 3 دقائق.
6. إضافة 10 ميكروليتر تشكيل رد فعل المخزن المؤقت 2 المضافة (المكون ه)، ثم دوامة ل 5 s وتدوير عينات لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام جهاز متعدد المدورة.
  ملاحظة: الحل يتحول إلى اللون البرتقالي مشرق اللون بعد إضافة المكون (ه). وينبغي حماية العينات من الضوء أثناء الدوران.
7. إضافة 300 ميكروليتر الميثانول ودوامه ل 5 ق، إضافة 75 كلوروفورم ميكروليتر ودوامه ل 5 s، ثم قم بإضافة 200 ميكروليتر دو ودوامه ل 5 ق.
8. الطرد المركزي هذه العينات في 21,130 س ز و 4درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تجاهل المادة طافية مائي وإبقاء بيليه.
9. إضافة 250 ميكروليتر الميثانول إلى الأنبوبة، ودوامه، وتدور مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 21,130 س ز.
10. تجاهل المادة طافية، ثم تغطية العينات مع النسيج خالية من الوبر وتسمح الكريات أيردري لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تحليل صفحة والنشاف الغربية
1. جعل بيليه في 20 ميكروليتر من تحميل المخزن المؤقت دون β-ميركابتوثانول، ودوامه لمدة 10 دقائق، والحرارة عند 70 درجة مئوية باستخدام كتلة الحرارة لمدة 10 دقائق. ثم تحميل العينات إلى 10% الحزب الديمقراطي الصربي هلام (1.5 مم) للكشف عن تيتراميثيلرهوداميني (طمره).
2. الكشف عن إشارة اها استخدام ماسح ليزر وضع متغير كوانتيتيشن دقيقة من البروتينات الوليدة.
3. أغسل الهلام مع دو لمدة 15 دقيقة.
4. ثم، وصمة عار جل مخزونات النشر الاستراتيجي 10 في المائة مع كاشف صبغ أخذ سريعة وحساسة لمدة 15 – 60 دقيقة للكشف عن مجموع البروتينات كعنصر تحكم.
5. إزالة وصمة عار للهلام مع دو ح 1 – 2، والحصول على الصورة باستخدام تصوير الأسفار الأشعة فوق البنفسجية.

Representative Results

ويؤدي عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي عائد من حوالي 20 × 106 مجموع الخلايا/الماوس. الأشيع، خلايا حية والمرفقة من الكبد الأولية تظهر مضلعة أو نموذجية سداسية في الشكل مع وضوح الحدود غشائي بعد 24 ساعة الحضانة (الشكل 2).

لتأكيد ما إذا كانت الخلايا المعزولة هي خلايا الكبد الأولية، قارنا مستويات التعبير من بروتين الزلال في الماوس الأساسي عزل خلايا الكبد (بمهس) والليفية الجنينية الماوس (MEFs) وخط خلية الكبدي ماوس (Hepa 1-6)، وكبد الفأر. التعبير بروتين الزلال اكتشفت في خلايا الكبد الماوس الأساسي وكبد الفأر ولكن لم يكن يمكن اكتشافها في ميفس أو هيبا 1-6 خلايا (الشكل 3).

لتحديد ما إذا كانت آثار والروتينون على البروتين المنشط أمبير الكبدية كيناز (أمبك) تنشيط خلية مستقلة، قارنا استجابة خلايا الكبد الأولية المعزولة من كبد الفأرة البرية من نوع المعتمدة على الزمن. وتم علاج خلايا الكبد الأولية دون أو مع 10 ميكرومترات والروتينون 0, 4 أو 6 ح. في هذه الخلايا، معاملة والروتينون قوة الناجمين عن التنشيط أمبك، كما تم الكشف عن مستويات الفسفرة زيادة في أمبك-T172 مماثلة لتلك التي ينظر إليها في فيفو48 (الشكل 4).

لقياس آثار العلاج والروتينون على تخليق البروتين الوليدة في خلايا الكبد الأولية مباشرة، تم تقييم إدماج اها غير مشعة في البروتين أكثر من 5 ح عن طريق إجراء تحليل رد فعل ربط الكيماوي انتقائية. وكان العلاج مع 10 ميكرومترات والروتينون ح 5 عميقة الآثار المثبطة على تخليق البروتين الوليدة في خلايا الكبد الأولية المعالجة بالمقارنة مع خلايا الكبد الأولية غير المعالجة (الشكل 5).

الشكل 1: ويبين مثال على الخطوات الأولية بالماوس عزل خلايا الكبد وتحليل لطخة غربية، وإجراءات رد فعل ربط الكيماوي انتقائية.

رقم 2: المرحلة على النقيض من الصور المورفولوجية لخلايا الكبد الماوس الرئيسي- تم اقتناء الصور التمثيلية لخلايا الكبد الأولية المعزولة في 2, 12 و 24 و 72 ح بعد الطلاء. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر.

رقم 3: تحليل لطخة غربية للتعبير الزلال البروتين في خلايا الكبد الماوس الرئيسي- وأجرى تحليل لطخة غربية مع التحميل من 10 ميكروغرام البروتين/حارة من الماوس الأساسي خلايا الكبد (بمهس) والماوس الخلايا الليفية الجنينية (ميفس) والخلايا هيبا 1-6 وكبد الماوس. أحادي الاتجاه ANOVA أظهرت مقارنة تعبير بروتين الزلال هامة في بمهس MEF أو هيبا 1-6 خلايا. القيم هي وسائل ± ووزارة شؤون المرأة لحجم المجموعة (n = 3). ف، #ف < 0.001 مقابل. 1-6 هيبا أو ميفس، على التوالي. $ ف < 0.001 مقابل. الكبد ليستي.

الشكل 4: تحريض الفسفرة أمبك في خلايا الكبد الماوس الأساسي تعامل والروتينون. خلايا الكبد الأولية من كبد الفأرة البرية من نوع تعامل مع 10 ميكرومترات والروتينون تم الكشف عن مستويات الفسفرة حاء 0, 4 أو 6 من أمبك من النشاف الغربية، وبيتا-أكتين استخدمت كعنصر تحكم تحميل (10 ميكروغرام البروتين تم تحميل لين). وأظهرت القياسات المتكررة ANOVA 2-طريقة أن العلاج أدى إلى زيادة كبيرة في التعبير البروتين من والرمات-أمبك بالمقارنة مع خلايا الكبد الأولية غير المعالجة. القيم هي وسائل ± ووزارة شؤون المرأة لحجم المجموعة (n = 3). ف < 0.001 مقابل. خلايا الكبد غير المعالجة.

الرقم 5: الحد من التعبير البروتين الوليدة كبدي بعد علاج والروتينون. خلايا الكبد الأولية من كبد الفأرة البرية من نوع تعامل مع 10 ميكرومترات والروتينون ح 5، متبوعاً مقايسة توليف بروتين وليدة غير مشعة اها الأسلوب. تم تقييم مستويات البروتين التوليف قبل ماسح ليزر كشف fluorescence طمره. تم الكشف عن مستويات تحميل مجموع البروتين لهذا الفحص بأخذ صبغ الكاشف.

Discussion

الكتاب تبين لديهم لا تضارب في المصالح.

Disclosures

Acknowledgements

ونشكر الدكتور جونباي كبار المسئولين الاقتصاديين وهوا فيفيان للمدخلات العلمية والمناقشة. وأيد هذا العمل "المعهد الوطني للصحة" (NIH) (R01DK107530). وأيد T.N. المعزوفة من اليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا. وأيد بمنحه من المعاهد الوطنية للصحة (P30DK078392) لمركز الجهاز الهضمي الأمراض البحوث الأساسية في سينسيناتي جزءا من هذه الدراسة.

Materials

كوكتيل مثبط التحليل الحيوي مجموعة GE معدات أجهزة إشارات ناعم

عازلة HEPES	فيشر Scientific	BP310-500
D-glucose	Fisher Scientific	D16-500
الإيثيلين جلايكول مكرر (& بيتا ؛ أمينوإيثيل الأثير) - حمض رباعي الأسيتيك	AmericanBio	AB00505-00025
مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x)	Gibco	15240-062
HBSS (10x) خال من الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول الأحمر	جيبكو	14185-052
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl_{2< / sub>.2H_{2< / sub>O)}}	فيشر Scientific	C79-500
عازلة تدرج الكثافة	GE Healthcare	17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) منخفض الجلوكوز ، البيروفات	جيبكو	11885-084
مصل الأبقار الجنيني	Hyclone	SH30910.03
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (1x)	Gibco	1897141
Williams medium E ، بدون جلوتامين	Gibco	12551-032
مكمل L-alanyl-L-glutamine ثنائي الببتيد	Gibco	35050-061
Collagenase Type X	Wako Pure Chemical Industries	039-17864
مضخة التروية	Cole-Parmer	Masterflex L / S	Equipment
IV مجموعة الإدارة	EXELINT	29081	معدات
حمام مائي	REVSCI	RS-PB-200	معدات
سخان أنبوب	فيشر Scientific	Isotemp	Equipment
Ethanol	Decon Lab، Inc	0-39613
Isoflurane	PHOENIX	10250
Autoclaved نصائح القطن	فيشربراند	23-400-124
100 مم طبق بتري	TPP	93100
موصل (ذكر حلقة قفل لور) أداة	كول بارمر	EW-4551807
24 جرام قسطرة	TERUMO	Surflo 24Gx3 / 4'100
& م مرشح (مصافي الخلايا)	VWR	10199-658
15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية القاع	VWR	89039-666
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية القاع	VWR	89039-658
تفاعل الربط الانتقائي الكيميائي طقم الكشف عن تحليل البروتين ، Tamra Alkyne	Invitrogen	C33370
AHA (L-azidohomoalanine)	Invitrogen	C10102
DMEM (خالي من الميثيونين)	Gibco	21013024
L-Cystine Dihydrochloride	SIGMA	C2526
Laemmli عينة عازلة	BioRad	161-0737
كوكتيل مثبط البروتياز	SIGMA	P9599
محلول SDS (20٪)	BioRad	161-0418
Tris-HCL (1M)	أمريكي	الفوسفاتيز AB14044-01000
	SIGMA	P5726
قياس تركيز البروتين (Bovin Serum Albumin-BSA)	BioRad	500-0207
لوحة ثقافة الأنسجة ذات 6 آبار	TPP	92006
Digital Heatblock	VWR	12621-092	معدات
متعددة الدوران	Grant-bio	معدات PTR-60
بالموجات فوق الصوتية	كول بارمر	معدات GE130PB
القياسية خلاط دوامة للخدمة الشاقة	VWR	97043-566	معدات
ماسح ضوئي ليزر متغير الوضع	Healthcare Life	Science FLA 9500	Equipment
Coomasie-dye كاشف	حراري علمي 24594
مجهر مقلوب	معدات	أوليمبوس	CKX53
جهاز النشاف الغربي	BioRad	1658004
الطرد المركزي	معدات Eppendorf	5424R
معدات عداد الخلايا الآلي	BioRad	TC20
معدات نظام FluorChem R	بروتينSimple		المعدات
p-Ampka (T172) إشارات خلية الأجسام المضادة		2535
خلية الأجسام المضادة الإجمالية AMPK		5832
إشارات الخلية للجسم المضاد للألبومين		4929
جسم مضاد بيتا أكتين	سانتا كروز	sc-130656
مقص وملقط

References

Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade--a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer's cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes--past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي لتحليل توليف البروتين الوليدة بأسلوب العلامات غير مشعة L-أزيدوهوموالانيني