يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الخاصة بالخلية إشارات في المشبك الثلاثية للحجاب الحاجز الماوس

7.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58347

⸱

أكتوبر 4, 2018

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, School of Medicine, University of Nevada, 2Department of Pharmacology, Larner College of Medicine, University of Vermont

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا للكالسيوم في صورة إشارات في سكان أنواع الخلايا الفردية في الوصلات العصبية العضلية مورين.

الملخص

يمكن رصد النشاط الكهربائي للخلايا في الأنسجة بالتقنيات الكهربية، ولكن هذه عادة ما يقتصر على تحليل الخلايا الفردية. نظراً لزيادة الكالسيوم داخل الخلايا (Ca2 +) في سيتوسول غالباً ما تحدث بسبب النشاط الكهربائي، أو استجابة لعدد ضخم محفزات الأخرى، يمكن رصد هذه العملية بتصوير الخلايا محملة الفلورسنت المراعية للكالسيوم الأصباغ.  ومع ذلك، من الصعب صورة هذه الاستجابة في نوع خلايا فردية داخل الأنسجة كاملة لأن يتم تناول هذه الأصباغ بجميع أنواع الخلايا داخل الأنسجة. على النقيض من ذلك، مؤشرات الكالسيوم المشفرة جينياً (جيسيس) يمكن التعبير عنها حسب نوع خلية فردية وفلوريس في استجابة لزيادة من داخل الخلية Ca2 +، مما سمح التصوير من Ca2 + إشارات في مجموعات سكانية بأكملها من أنواع الخلايا الفردية. هنا، علينا تطبيق الاستخدام من جيسيس GCaMP3/6 على الوصلات العصبية العضلية الماوس، وخلايا شوان المشبك ثلاثية بين الخلايا العصبية الحركية، والهيكل العظمى والعضلات، والمحطة الطرفية/بيريسينابتيك. علينا أن نبدي بفائدة هذا الأسلوب في الكلاسيكية السابقين فيفو الاستعدادات الأنسجة. استخدام تقسيم بصري، نقوم بالتصوير المزدوج-الطول الموجي لدينامية Ca2 + إشارات وتسمية ثابتة من الوصلات العصبية العضلية (NMJ) في نهج التي يمكن تكييفها بسهولة لرصد اثنين جيتشي الخلية المحددة أو الجهد وراثيا المرمزة المؤشرات (جيفي) في نفس الوقت. وأخيراً، نحن نناقش الإجراءات المستخدمة لالتقاط خرائط مكانية لشدة الأسفار. معا، يمكن أن تستخدم هذه التقنيات البصرية والمعدلة وراثيا والتحليلية لدراسة النشاط البيولوجي للفئات السكانية الفرعية خلية متميزة في NMJ في مجموعة متنوعة من السياقات.

المقدمة

NMJ، مثل جميع نقاط الاشتباك العصبي، ويتألف من ثلاثة عناصر هي: محطة presynaptic المستمدة من خلية، خلية بوستسينابتيك العصبية/المستجيب، وخلية بيريسينابتيك الدبقية1،2. في حين أظهرت الجوانب الأساسية لانتقال متشابك أولاً في هذا المشبك3، العديد من جوانب هذه العملية تظل مجهولة، جزئيا بسبب التعبير عن جزيئات نفس عناصر خلوية متميزة من هذا المشبك. على سبيل المثال، يتم التعبير عن مستقبلات لكل من البيورين نوكليوتيد الأدنين ATP واستيل (ACh)، الذي شارك تم إصدارها من قبل الخلايا العصبية الحركية في NMJ الفقارية، بالعضلات وخلايا شوان والخلايا العصبية الحركية، مما يعقد تفسير أي تأثير الوظيفية التي تمارس بها هذه المواد (مثلاً، الإفراج عن الإرسال أو الرد، توليد قوة العضلات)4. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن مكونات الثلاثية NMJ بسيطة مقارنة إلى، على سبيل المثال، الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الذي غالباً ما يحمل مدخلات متعددة متشابك، عما إذا كانت الخلايا العصبية الحركية، والخلايا العضلية أو خلايا شوان تختلف في الاستجابة للمحفزات على أساس على ما مضمن عدم التجانس (مثلاً، اشتقاق الجنينية، النوع الفرعي للألياف، ومورفولوجيا) غير واضح. بغية معالجة كل مسألة من هذه المسائل، أنه سيكون من المفيد لتعقب الاستجابة للعديد من الخلايا داخل أحد العناصر متشابك، فضلا عن المسار، في الوقت نفسه، هذه استجابة في أي من عناصر منفصلة أخرى في نفس الوقت. الاستراتيجيات التقليدية باستخدام الأصباغ الكيميائية لقياس إشارات الكالسيوم لا يمكن تحقيق هذين الهدفين، لأنه هو تناول تطبيق حمام صبغة بأنواع متعددة من الخلايا بعد التطبيق للأنسجة، ويمكن استخدام صبغة إينتراسيلولارلي تحميل فقط تصور الأفواج الفردية أو الصغيرة من الخلايا. هنا، استخدام الفئران المعدلة وراثيا معربا عن جيسيس مصممة لقياس إشارات الكالسيوم خلية على حدة، جنبا إلى جنب مع تصوير محددة و أدوات البرمجيات5، يمكننا إثبات الأول من هذين الهدفين عموما، ومناقشة كيفية الإضافة جديد أدوات معدلة وراثيا سوف يساعد على تحقيق الثاني. سوف تكون هذه التقنية مفيدة لأي شخص مهتم في تتبع ديناميات الكالسيوم أو الخلوية الأخرى مما يشير إلى أحداث يمكن ملاحظتها من خلال أجهزة الاستشعار البصرية ترميز الجينات في السكان خلية متعددة في نفس الوقت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وتربية الحيوانات والتجارب أجريت وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وإياكوك في جامعة نيفادا.

1. إعداد أغشية والأعصاب فرنك من الفئران المحورة وراثيا

  1. شراء الفئران المحورة وراثيا والإشعال اليغنوكليوتيد للنمط الوراثي هذه الفئران.
    ملاحظة: يتم سرد الإشعال على صفحة "المعلومات" لكل من هذه الفئران.
    1. تولد ماوس 3-6 شهرا معربا عن نسخة واحدة من اليل Cre-سائق المعدلة وراثيا/تدق في المناسبة وصفر نسخاً من اليل GCaMP3/6 شرطي مع ماوس ثانية من نفس العمر معربا عن نسخ واحد أو اثنين من الشرطية GCaMP3/ 6 اليل وصفر نسخاً من اليل سائق لجنة المساواة العرقية.
    2. النمط الوراثي الجراء ومارك تلك التي لديها لجنة المساواة العرقية والشرطي GCaMP3/6 الآليلات – هذه ستسمى من الآن فصاعدا الفئران المعدلة وراثيا مزدوج (مثلاً، Myf5-لجنة المساواة العرقية، GCaMP3 الشرطي)6.
      ملاحظة: سوف تستمد جميع البيانات من الفئران معربا عن نسخة واحدة من كل من لجنة المساواة العرقية والشرطي GCaMP3/6 الآليلات بهذه الطريقة،. هذا مهم خاصة عند إضافة في الفئران الأخرى متحولة (مثلاً، بالضربة القاضية) لهذه الصلبان.
  2. عندما تكون الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة للسن المناسبة (مثلاً، يوم الولادة 0 أو 5 [P0 أو P5] أو الكبار)، euthanize الفئران بقطع رأس لهم مع المقص (بالنسبة للفئران أصغر سنا من P10) أو عن طريق وضعها في دائرة لاستنشاق isoflurane — عندما تكون لم تعد تستجيب معسر الذيل مع زوج من الملقط، أنهم مستعدون للتضحية.
  3. التضحية الحيوان بقطع الرأس مع زوج من مقص.
  4. قسم العرض عبر الحيوان كامل أسفل الكبد وفقط فوق القلب والرئتين مع مقص iridectomy.
  5. تشريح بعيداً في الكبد والقلب والرئتين، مع الحرص على الحفاظ على طول العصب فرينيك طويلة بما فيه الكفاية أن تستدرج إلى شفط كهربائي (أي، 1-2 سم).
    ملاحظة: يمكن التعرف على العصب الأيسر فرنك كقطعة بيضاء من الأنسجة التي يدخل الجزء الآنسي من الحجاب الحاجز الأيسر. يجب أن لا تكون قطع عند إزالة الرئتين. العصب حق فرنك يعمل داخل قطعة من لفافة تحتوي على الأجوف فينا متفوقة أيضا وهو أرق وأكثر بياضا من الأجوف فينا. معا، وكلاهما اختراق الحاجز الآنسي حق.
  6. كذلك إزالة في القفص الصدري والعمود الفقري، باستثناء ريدج رقيقة حول الحجاب الحاجز.
  7. وضع الحجاب الحاجز والأعصاب فرنك العينة في [ميكروفوج] أنابيب مع الحل كريبس في المسابقة مع 594 1 ميكروغرام/ملليلتر-αBTX لمدة 10 دقائق في الظلام.
    ملاحظة: هذا التركز من 594-αBTX تسميات مستقبلات ACh (اختتام) دون عرقلة وظيفتها (ملاحظة شخصية).

2-حفز وتسجيل من إمكانيات عمل العضلات

  1. باستخدام دبابيس مينوتين، شل الحجاب الحاجز التي تعلق على طبق 6-سم المغلفة مع هلام السيليكون عازل ومليئة ~ 8 مل من اﻷوكسيجين كريبس-المسابقة الحل ووضعه على خشبة المسرح المجهر. نتخلل الحجاب الحاجز مع أكثر من حل المسابقة كريبس (8 مل/دقيقة) لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: هذا رنسيس 594-αBTX غير منضم، فضلا عن اكويليبراتيس الأنسجة بعد التشريح.
  2. تجعل من قطب كهربائي شفط وفقا للأساليب المتبعة7.
    1. 4 X التكبير، واستخدام ميكرومانيبولاتور، حرك مسرى شفط العصب فرينيك الأيسر وتطبيق الشفط بسحب ماسورة 5 مل حقنه متصلة بالانبوب متصل بالشفط الكهربائي.
      ملاحظة: عند وضع بنجاح في مسرى الشفط، مشدود العصب فرنك. تشغيل مشجعا وحفز فرينيك العصب بالتقليب اليدوي التبديل 1 x.
    2. ضمان أن الحجاب الحاجز عقود استجابة لتحفيز 1 هرتز بفحص ذلك بصريا مع الإضاءة برايتفيلد. إذا لم يكن الأمر كذلك، ضبط الجهد عن طريق تحويل مقبض الجهد تدريجيا لتحقيق نبض سوبراماكسيمال، التي يمكن التحقق منها بإجراء فحص مرئي لتقلص العضلات. إذا كان لا يزال غير مرئي، تفجير العصب مع المحاقن ومحاولة لرسم مرة أخرى عن طريق تطبيق شفط.
  3. إيقاف التروية وإضافة مثبط البيلاروسية الميوسين الخاصة بالعضلات6 أو عن طريق بوابة الجهد الصوديوم قناة خصم μ-كونوتوكسين8 إلى تركيز نهائي من 100 ميكرومتر.
    1. لجعل 100 ميكرومتر البيلاروسية، "الماصة؛" 4 ميليلتر من الأسهم 200 ملم في [دمس] وبريديلوتي أنه في 1 مل من محلول كريبس في المسابقة.
    2. إزالة 1 مل من محلول كريبس في المسابقة من الطبق.
    3. إضافة البيلاروسية بريديلوتيد، إلى الطبق.
      ملاحظة: يساعد هذا بريديلوشن على منع التعريفي بغير مخفف [دمس] استجابة الفلورية غير عابرة في التعبير عن GCaMP3 الخلايا.
    4. انتظر 30 دقيقة وثم تشغيل التروية الطازج كريبس-المسابقة حل لآخر 20-30 دقيقة.
  4. إعداد التسجيل الكهربائي.
    1. ضع البورسليكات زجاج فيلامينتيد مع قطر خارجي (OD) 1 مم وقطر داخلي (ID) من 0.4 مم إلى ساحبة ميكروبيبيتي ارتداء القفازات، وتشديد الأوجه المشبك في الموقف. أغلق باب ساحبة.
    2. ساحبة P-97، باستخدام برنامج الإعداد التالية: الحرارة في 900، سحب على 120، والسرعة في 75، مرة في 250، الضغط على 500، ولا حلقات إضافية.
      ملاحظة: يقاس Resistance (R) باستخدام عناصر تحكم البرمجيات من مكبر للصوت: برنامج اقتناء البيانات تؤكد المقاومة قبل حل الصيغة الخامس = الأشعة تحت الحمراء. وحدة تحكم البرمجيات يمر حالية معروفة (ط) (عادة 1 غ) عن طريق الكهربائي ويقيس التغير في الجهد (V)، وبالتالي تمكننا من حل ر.
    3. لأغشية جنينية، تأكد أن المقاومة قرب 60 MΩ، ولكبار السن أغشية، MΩ 10-20. تحميل مسرى التسجيل مع 3 م بوكل.
  5. 10 X التكبير، أقل الكهربائي في العضلات، واستخدام ميكرومانيبولاتور ثاني في الجانب الآخر من المسرح كقطب محفزة.
  6. باستخدام برنامج اقتناء البيانات الكهربية، انتظر حتى إمكانات غشاء يستريح يتغير من 0 إلى-65 mV أو أدناه.
  7. تحفز في 1 هرتز، والتحقق من وجود إمكانية عمل العضلات بالتحقق من وجود احتمال كبير أن يسلك الانحسار متواضعة (احتمال أن ترتفع فوق 0 mV عند بدء تشغيله في-65 mV أو أدناه). لا تخلط بين قطعة أثرية التحفيز إمكانات العمل.
    ملاحظة: إمكانات أطول بشكل ملحوظ في مدة (~ 5 مللي ثانية) من التحف التحفيز.

3-تصوير للأسفار العينة

  1. في 20 X التكبير، حدد موقع الفرقة اندبلت في المركز للعضلات التي تبحث عن 594-αBTX – المسماة نمجس تحت الإثارة الضوء الأخضر/الأصفر (550 نيوتن متر). قم بالتبديل إلى الإثارة الضوء الأزرق (470 nm) على صورة Ca2 + الردود في العضلات أو العصبون، أو خلايا شوان.
  2. إذا رغبت في ذلك، إعداد التقسيم الصورة مع مرشحات ممر الموجه وعامل تصفية واحد-حافة مزدوج اللون لتصوير ثنائي-الطول الموجي.
  3. من أجل حساب الأسفار القصوى (فماكس) تعرض بواسطة أنسجة GCaMP3/6-وإذ يعرب عن، إضافة ميليلتر 12 م 3 كلوريد البوتاسيوم (بوكل) ل الأعمال التحضيرية الحجاب الحاجز6.
    1. القيام بتجارب مع شريط السطوع على شريط جدول بحث تعيين إلى 110 في المائة المستوى الذي يسلك الأنسجة GCaMP3/6-وإذ يعرب عن التشبع في 20 X التكبير، دون binning في الاستجابة إلى بوكل.
  4. سجل في 20 لقطة في الثانية وأن لا تفوت أي الأحداث سريعة.
  5. حفز مع s 1-45 من 20-40 هرتز لتحفيز العصب بإيصال قطار من النبضات استخدام الشفط الكهربائي أو إضافة يضع الدوائية بتطبيق حمام أو نضح وجمع Ca2 + الردود الفلورسنت دينامية في خلية واحدة نوع فرعي جنبا إلى جنب مع إشارة NMJ ثابت 594-αBTX.
    ملاحظة: إذا كانت الأنسجة على حدة الأحمر أو استعملنا جيتشي أو جيفي الفئران تصبح متوفرة للاستخدام في NMJ، يمكن استخدامها لجمع إشارتين ديناميكية تعكس عنصرين الخلوية متميزة في NMJ.
  6. عند الانتهاء من تجارب التصوير أو الكهربية لأن النتائج المرجوة قد تحققت، نتخلل المياه من خلال خطوط نضح وتمتص المياه 2 x-x 3 عن طريق الشفط الكهربائي لضمان بناء الأملاح لا.

4-التصدير وتحليل البيانات من قبل "خريطة الانحراف المعياري لكثافة الفلورية" (SDiu16)

  1. تسجيل تسلسل الصور المسجلة كرزمة TIFF 16-بت وتحميلها على نظام تحليل بيانات التصوير المطلوب للتحليل.
  2. في القائمة ملف للبرنامج 8 د، حدد المكدس الصورة للفائدة ، ثم انقر فوق تحميل.
    1. بمجرد تحميل الفيديو، المسح الضوئي من خلال الوقت لتحديد مقطع يحتوي على أي نشاط الفلورسنت الخلوية.
      ملاحظة: سيتم استخدام هذه المنطقة لإنشاء نموذج خلفية.
    2. اضغط على المفتاح Shift وانقر لرسم منطقة مربع الفائدة (ROI) في منطقة حددت كمنطقة العينة الخلفية.
    3. بعد إنشاء المربع، اضغط على شريط الفضاء لتوليد مؤامرة لتغيير خلفية النشاط.
    4. انقر بالزر الأيمن التتبع وتحديد الخيار متنوعة لتقديم الخيار تفريغ عائد الاستثمار كنص لجعل التتبع كملف نص إحداثي س وص.
  3. نقل مرة أخرى إلى شريط الفيديو للفائدة، تفحص مرة أخرى لتحديد المنطقة الزمنية حيث يتم حدوث نشاط المصلحة.
    1. باستخدام زر الماوس الأوسط، حدد المنطقة الزمنية في المربع الأصفر وقت.
    2. انقر بالزر الأيمن على الفيديو وحدد المكدس مكتب خدمات المشاريع ، ومن ثم خريطة Stat الخيار 5.
      ملاحظة: سيؤدي هذا إلى إنشاء مخطط انحراف المعياري (SD خريطة) في الإطار الأيسر.
    3. انقر فوق على خريطة التنمية المستدامة ومن ثم اضغط ] مفتاح x 19 لتطبيق خريطة حرارة اللون المناسب.
    4. انقر بالزر الأيمن على الخريطة SD وحدد STM تحميل وحفظ، الذي سوف يقدم خيار حفظ stm كالمشاجرة لحفظ مخطط التنمية المستدامة.
    5. ثم، اضغط [ مفتاح x 19 للعودة إلى خارطة لون رمادي.
    6. اضغط C ثم D لإحضار أدوات رسم خرائط الكثافة. باستخدام زر الماوس الأيسر ومركز زر الماوس، قم بضبط العتبة تشمل كل نشاط الفلورسنت هو موضح في خريطة التنمية المستدامة.
    7. اضغط C لإغلاق أدوات الكثافة مع الحفاظ على إعدادات العتبة.
    8. انقر بالزر الأيمن خريطة التنمية المستدامة وتحديد جزيئات تحقيق الاستقرار والانتساب ، ومن ثم العثور على بتكلس.
      ملاحظة: هذا سيتم تحديد خلايا فردية معربا عن نشاط الفلورسنت.
    9. انقر بالزر الأيمن على الخريطة SD مرة أخرى وحدد إنشاء رويس الجسيمات.
      ملاحظة: هذا سوف ركب الخلايا المحددة على شريط الفيديو الأصلي للفائدة.
    10. أثناء الضغط على المفتاح Shift، انقر بالزر الأيمن على أي واحد من الجسيمات التي تم تحديدها الآن رويس في الفيديو الأصلي.
    11. حدد علامة العائد على الاستثمار و تدبير Int في العائد على الاستثمار.
      ملاحظة: سيؤدي هذا إلى إنشاء نشاط الأفراد الفلورسنت مؤامرات لكل عائد الاستثمار المحددة في شريط فيديو للاهتمام. هذه يمكن حفظها بواسطة زر الماوس الأيمن فوق أي واحد من هؤلاء وتحديد أسورتيد، تليها دوروا تفريغ كنص.
  4. لمنطق مفصلة الكامنة وراء هذه العمليات، الرجاء مراجعة ملف التعليمات البرمجية المصدر9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عدة أمثلة للتغييرات كثافة الأسفار، توسط الزيادات من داخل الخلية Ca2 + ضمن أنواع الخلايا المحددة NMJ، تظهر فائدة هذا النهج. وترد هذه النتائج كخرائط كثافة fluorescence المكاني، الذي يقدم موقع الخلايا المستجيبة، وكذلك الكثافة من ردودها، مما يسمح لتقييم الاستجابة كم عدد الخلايا، وكل خلية من كم يستجيب لمعين التحفيز. على سبيل المثال، كما هو مبين في الشكل 1، وقد اتخذنا أشرطة الفيديو من Ca2 + الردود في عدد سكان من المحطة الطرفية/بيريسينابتيك شوا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا نقدم بعض الأمثلة لقياس Ca2 + الردود في خلايا معينة في الأنسجة العضلية سليمة معربا عن جيتشي الفئران باستخدام. بغية تنفيذ هذه التجارب بنجاح، من الضروري لا تصيب العصب فرينيك أثناء التشريح. الصورة Ca2 + الردود في خلايا شوان في السلطة أما منخفضة أو عالية (أي20 X أو 60 X)، من الضروري استخدام البيلاروسية أو μ-كونوتوكسين لكتلة الحركة. لتصوير الطاقة المنخفضة من Ca2 + الردود في خلايا العضلات، فمن الممكن لقياس هذه في غياب هذه الأدوية، مما يسمح باقتناء المتزامنة للعضلات والعضلات Ca2...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) GM103554 و GM110767 إلى (T.W.G.) والمركز الوطني "بحوث الموارد" 5P20RR018751 و GM103513 8 ف 20 المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (إلى G.W.H.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Myf5-Cre الفئرانJax# 007893يقود تعبير خلايا العضلات في وقت مبكر مثل E13 < sup class = "xref" >6< / sup>
Wnt1-Cre الفئرانJax# 003829يدفع التعبير إلى الجميع   ؛ خلايا Schwann في E13 ولكن ليس P209< / sup>
Sox10-Cre الفئرانJax# 025807يقود تعبير خلية Schwann في الأعمار الأكبر
فئران GCaMP3 المشروطةJax# 029043تعبر عن GCaMP3 بطريقة خاصة بالخلية
الفئران الشرطية GCaMP6fJax# 024105يعبر عن GCaMP6f بطريقة خاصة
بالخليةBHC (3- (N-butylethanimidoyl) -4-hydroxy-2H-chromen-2-one)Hit2Lead# 5102862يمنع الميوسين العضلي الهيكلي ولكن ليس ناقل الحركة العصبي < فئة sup = "xref" >6< / sup
>CF594- &&alpha ؛ -BTXBiotium# 00007ملصقات مجموعات مستقبلات الأسيتيل كولين في NMJ
& micro ؛ -conotoxin GIIIbالببتيدات الدولية#CONO20-01000كتل Nav1.4 قناة الصوديوم المعتمدة على الجهد < فئة sup = "xref" >8< / sup>
جل عازل من السيليكون ؛ المعروف أيضا باسم SylgardEllswoth Adhesives# Sil Dielec Gel .9KG   ؛يسمح لتثبيت الحجاب الحاجز بواسطة دبابيس دقيقة
دبابيس Minutien (قطر 0.1 مم)أدوات العلوم الدقيقة26002-10يشل حركة الحجاب الحاجز على هلام عازل من السيليكون
مجهر استقيم Eclipse FN1   ؛نيكونيسمح بتنظيم ومراقبة منصة
المجهر الثابت الأساسية للعينة مع مترجم مجهر XY اليدوي Autom8MXMScrيسمح بحركة العينة
مناور دقيق يدوي  NarishigeM-152يحمل تسجيل وتحفيز الأقطاب الكهربائية   ؛
مضخم القطب الكهربائي الدقيق الأجهزة الجزيئيةAxoclamp 900Aيسمح بتسجيل الفيزيولوجيا الكهربية داخل الخلايا القطب
الكهربائي الدقيق نظام الحصول على البيانات منخفضة الضوضاءالأجهزة الجزيئيةDigidata 1550 & nbsp ؛يسمح بالحصول على البيانات الفيزيولوجية الكهربية
نظام تحليل بيانات الأقطاب الكهربائية الدقيقةالأجهزة الجزيئيةPCLAMP 10قياسي يقوم بتحليل البيانات الفيزيولوجية الكهربية
محفز الموجة المربعةالعشبS48يحفز العصب لإثارة العضلات
وحدة عزلالتحفيز العشبPSIU6يقلل من القطع الأثرية التحفيزية
خيوط البورسليكات ، القطر الخارجي 1.0 مم ، القطر الداخلي 0.5 مم   ؛SutterFG-GBF100-50-15Impales ويسجل إمكانات العضلات التي تثيرها الأعصاب
خيوط البورسليكات ، القطر الخارجي 1.5 مم ، القطر الداخلي 1.17 مم   ؛SutterBF150-117-15مطولة وتستخدم لقطب الشفط
مجتذبماصة دقيقة SutterP-97 & nbsp ؛يسحب ويجهز أقطاب التسجيل
1200 × 1200 بكسل ، كاميرا cMOS بإضاءة خلفية   ؛القياسات الضوئيةPrime 95bكاميرا حساسة تسمح بتصوير عالي الدقة وعالي السرعة
مصدر ضوءLumencorSpectra Xيوفر إضاءة من مصابيح LED للاستزاب الفلوري
  أهداف الغمر في الماء الفلوري المصحح إلى ما لا نهاية ، WD 2mm نيكونCFI60توفير مسافات عمل طويلة لتصور عينة
المضيئة مع مصباح الهالوجينSumitaLS-DWL-Nيوفر إضاءة لمراقبة المجال الساطع
W-View Gemini Image Splitter  مشاريع HamamatsuA12801-011 زوج من الصور ذات الطول الموجي المزدوج مفصولة بكاميرا ثنائية اللون إلى كاميرا واحدة
مرشحات ممر النطاق الترددي أحادي النطاق  (512/25-25 و 630/92-25) سيم روكFF01-512 / 25-25 ؛ FF01-630 / 92-25يسمح بالتصوير ثنائي النطاق
560 نانومتر مقسم شعاع ثنائي اللون أحادي الحافةSem RockFF560-FDi01-25x36مرآة ثنائية اللون تفصل أشعة الضوء للسماح بالتصوير ثنائي الطول الموجي
نظام الحصول على بيانات التصويرعناصرNIS من نيكون - MQS31000يسمح بالحصول على بيانات التصوير
وحدة التحكم في الطول الموجيوحدة نيكونMQS41220لتصوير البيانات وحدة
أجهزة تقسيم الانبعاثات النمطية نيكونMQS41410وحدة لتسجيل بيانات التصوير
نظام تحليل بيانات التصويرNAVolumetry 8D5< / sup> ، فيجييسمح بتحليل شدة التألق وبيانات التصوير الأخرى
MBA74100 الألياف البصرية

المراجع

  1. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
  2. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).
  3. Fatt, P., Katz, B. An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode. Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).
  4. Todd, K. J., Robitaille, R. Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction. Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).
  5. Hennig, G. W., et al. Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon. Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436(2015).
  6. Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology. Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276(2016).
  7. Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).
  8. Hong, S. J., Chang, C. C. Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse. British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).
  9. Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue. Elife. 7, e30839(2018).
  10. Cho, J. H., et al. The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الوصلة العصبية العضليةمؤشرات الكالسيوم المشفرة جينيًاالتصوير ثنائي الطول الموجيمقسم بصريألفا بونغاروتوكسين الفلوريتحفيز العصب الحجابيتصوير خلايا شوانتصوير الخلايا العضلية
السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الخاصة بالخلية إشارات في المشبك الثلاثية للحجاب الحاجز الماوس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.