السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الخاصة بالخلية إشارات في المشبك الثلاثية للحجاب الحاجز الماوس

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا للكالسيوم في صورة إشارات في سكان أنواع الخلايا الفردية في الوصلات العصبية العضلية مورين.

الملخص

يمكن رصد النشاط الكهربائي للخلايا في الأنسجة بالتقنيات الكهربية، ولكن هذه عادة ما يقتصر على تحليل الخلايا الفردية. نظراً لزيادة الكالسيوم داخل الخلايا (Ca^{2 +}) في سيتوسول غالباً ما تحدث بسبب النشاط الكهربائي، أو استجابة لعدد ضخم محفزات الأخرى، يمكن رصد هذه العملية بتصوير الخلايا محملة الفلورسنت المراعية للكالسيوم الأصباغ.  ومع ذلك، من الصعب صورة هذه الاستجابة في نوع خلايا فردية داخل الأنسجة كاملة لأن يتم تناول هذه الأصباغ بجميع أنواع الخلايا داخل الأنسجة. على النقيض من ذلك، مؤشرات الكالسيوم المشفرة جينياً (جيسيس) يمكن التعبير عنها حسب نوع خلية فردية وفلوريس في استجابة لزيادة من داخل الخلية Ca^{2 +}، مما سمح التصوير من Ca^{2 +} إشارات في مجموعات سكانية بأكملها من أنواع الخلايا الفردية. هنا، علينا تطبيق الاستخدام من جيسيس GCaMP3/6 على الوصلات العصبية العضلية الماوس، وخلايا شوان المشبك ثلاثية بين الخلايا العصبية الحركية، والهيكل العظمى والعضلات، والمحطة الطرفية/بيريسينابتيك. علينا أن نبدي بفائدة هذا الأسلوب في الكلاسيكية السابقين فيفو الاستعدادات الأنسجة. استخدام تقسيم بصري، نقوم بالتصوير المزدوج-الطول الموجي لدينامية Ca^{2 +} إشارات وتسمية ثابتة من الوصلات العصبية العضلية (NMJ) في نهج التي يمكن تكييفها بسهولة لرصد اثنين جيتشي الخلية المحددة أو الجهد وراثيا المرمزة المؤشرات (جيفي) في نفس الوقت. وأخيراً، نحن نناقش الإجراءات المستخدمة لالتقاط خرائط مكانية لشدة الأسفار. معا، يمكن أن تستخدم هذه التقنيات البصرية والمعدلة وراثيا والتحليلية لدراسة النشاط البيولوجي للفئات السكانية الفرعية خلية متميزة في NMJ في مجموعة متنوعة من السياقات.

المقدمة

NMJ، مثل جميع نقاط الاشتباك العصبي، ويتألف من ثلاثة عناصر هي: محطة presynaptic المستمدة من خلية، خلية بوستسينابتيك العصبية/المستجيب، وخلية بيريسينابتيك الدبقية^1،2. في حين أظهرت الجوانب الأساسية لانتقال متشابك أولاً في هذا المشبك³، العديد من جوانب هذه العملية تظل مجهولة، جزئيا بسبب التعبير عن جزيئات نفس عناصر خلوية متميزة من هذا المشبك. على سبيل المثال، يتم التعبير عن مستقبلات لكل من البيورين نوكليوتيد الأدنين ATP واستيل (ACh)، الذي شارك تم إصدارها من قبل الخلايا العصبية الحركية في NMJ الفقارية، بالعضلات وخلايا شوان والخلايا العصبية الحركية، مما يعقد تفسير أي تأثير الوظيفية التي تمارس به....

البروتوكول

وتربية الحيوانات والتجارب أجريت وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وإياكوك في جامعة نيفادا.

1. إعداد أغشية والأعصاب فرنك من الفئران المحورة وراثيا

1. شراء الفئران المحورة وراثيا والإشعال اليغنوكليوتيد للنمط الوراثي هذه الفئران.
   ملاحظة: يتم سرد الإشعال على صفحة "المعلومات" لكل من هذه الفئران.
   1. تولد ماوس 3-6 شهرا معربا عن نسخة واحدة من اليل Cre-سائق المعدلة وراثيا/تدق في المناسبة وصفر نسخاً من اليل GCaMP3/6 شرطي مع ماوس ثانية من نفس العمر معربا عن نسخ واحد أو اثنين من الشرطية GCaMP3/ 6 اليل وصفر نسخاً من اليل سائق لجنة المساواة العرقية.
   2. النمط الوراثي الجراء ومار....

النتائج

عدة أمثلة للتغييرات كثافة الأسفار، توسط الزيادات من داخل الخلية Ca^{2 +} ضمن أنواع الخلايا المحددة NMJ، تظهر فائدة هذا النهج. وترد هذه النتائج كخرائط كثافة fluorescence المكاني، الذي يقدم موقع الخلايا المستجيبة، وكذلك الكثافة من ردودها، مما يسمح لتقييم الاستجابة كم عدد الخلايا، وكل خلية من كم يستجيب لمعين التحفيز. على سبيل المثال، كما هو مبين في الشكل 1، وقد اتخذنا أشرطة الفيديو من Ca^{2 +} الردود في عدد سكان من المحطة الطرفية/بيريسينابتيك شوا.......

المناقشة

هنا نقدم بعض الأمثلة لقياس Ca^{2 +} الردود في خلايا معينة في الأنسجة العضلية سليمة معربا عن جيتشي الفئران باستخدام. بغية تنفيذ هذه التجارب بنجاح، من الضروري لا تصيب العصب فرينيك أثناء التشريح. الصورة Ca^{2 +} الردود في خلايا شوان في السلطة أما منخفضة أو عالية (أي20 X أو 60 X)، من الضروري استخدام البيلاروسية أو μ-كونوتوكسين لكتلة الحركة. لتصوير الطاقة المنخفضة من Ca^{2 +} الردود في خلايا العضلات، فمن الممكن لقياس هذه في غياب هذه الأدوية، مما يسمح باقتناء المتزامنة للعضلات والعضلات Ca^2.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Myf5-Cre الفئران	Jax	# 007893	يقود تعبير خلايا العضلات في وقت مبكر مثل E13 < sup class = "xref" >6< / sup>
Wnt1-Cre الفئران	Jax	# 003829	يدفع التعبير إلى الجميع   ؛ خلايا Schwann في E13 ولكن ليس P209< / sup>
Sox10-Cre الفئران	Jax	# 025807	يقود تعبير خلية Schwann في الأعمار الأكبر
فئران GCaMP3 المشروطة	Jax	# 029043	تعبر عن GCaMP3 بطريقة خاصة بالخلية
الفئران الشرطية GCaMP6f	Jax	# 024105	يعبر عن GCaMP6f بطريقة خاصة
بالخليةBHC (3- (N-butylethanimidoyl) -4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	# 5102862	يمنع الميوسين العضلي الهيكلي ولكن ليس ناقل الحركة العصبي < فئة sup = "xref" >6< / sup
>CF594- &&alpha ؛ -BTX	Biotium	# 00007	ملصقات مجموعات مستقبلات الأسيتيل كولين في NMJ
& micro ؛ -conotoxin GIIIb	الببتيدات الدولية	#CONO20-01000	كتل Nav1.4 قناة الصوديوم المعتمدة على الجهد < فئة sup = "xref" >8< / sup>
جل عازل من السيليكون ؛ المعروف أيضا باسم Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG   ؛	يسمح لتثبيت الحجاب الحاجز بواسطة دبابيس دقيقة
دبابيس Minutien (قطر 0.1 مم)	أدوات العلوم الدقيقة	26002-10	يشل حركة الحجاب الحاجز على هلام عازل من السيليكون
مجهر استقيم Eclipse FN1   ؛	نيكون		يسمح بتنظيم ومراقبة منصة
المجهر الثابت الأساسية للعينة مع مترجم مجهر XY اليدوي	Autom8	MXMScr	يسمح بحركة العينة
مناور دقيق يدوي	Narishige	M-152	يحمل تسجيل وتحفيز الأقطاب الكهربائية   ؛
مضخم القطب الكهربائي الدقيق	الأجهزة الجزيئية	Axoclamp 900A	يسمح بتسجيل الفيزيولوجيا الكهربية داخل الخلايا القطب
الكهربائي الدقيق نظام الحصول على البيانات منخفضة الضوضاء	الأجهزة الجزيئية	Digidata 1550 & nbsp ؛	يسمح بالحصول على البيانات الفيزيولوجية الكهربية
نظام تحليل بيانات الأقطاب الكهربائية الدقيقة	الأجهزة الجزيئية	PCLAMP 10	قياسي يقوم بتحليل البيانات الفيزيولوجية الكهربية
محفز الموجة المربعة	العشب	S48	يحفز العصب لإثارة العضلات
وحدة عزل	التحفيز العشب	PSIU6	يقلل من القطع الأثرية التحفيزية
خيوط البورسليكات ، القطر الخارجي 1.0 مم ، القطر الداخلي 0.5 مم   ؛	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales ويسجل إمكانات العضلات التي تثيرها الأعصاب
خيوط البورسليكات ، القطر الخارجي 1.5 مم ، القطر الداخلي 1.17 مم   ؛	Sutter	BF150-117-15	مطولة وتستخدم لقطب الشفط
مجتذب	ماصة دقيقة Sutter	P-97 & nbsp ؛	يسحب ويجهز أقطاب التسجيل
1200 × 1200 بكسل ، كاميرا cMOS بإضاءة خلفية   ؛	القياسات الضوئية	Prime 95b	كاميرا حساسة تسمح بتصوير عالي الدقة وعالي السرعة
مصدر ضوء	Lumencor	Spectra X	يوفر إضاءة من مصابيح LED للاستزاب الفلوري
أهداف الغمر في الماء الفلوري المصحح إلى ما لا نهاية ، WD 2mm	نيكون	CFI60	توفير مسافات عمل طويلة لتصور عينة
المضيئة مع مصباح الهالوجين	Sumita	LS-DWL-N	يوفر إضاءة لمراقبة المجال الساطع
W-View Gemini Image Splitter	مشاريع Hamamatsu	A12801-01	1 زوج من الصور ذات الطول الموجي المزدوج مفصولة بكاميرا ثنائية اللون إلى كاميرا واحدة
مرشحات ممر النطاق الترددي أحادي النطاق  (512/25-25 و 630/92-25)	سيم روك	FF01-512 / 25-25 ؛ FF01-630 / 92-25	يسمح بالتصوير ثنائي النطاق
560 نانومتر مقسم شعاع ثنائي اللون أحادي الحافة	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	مرآة ثنائية اللون تفصل أشعة الضوء للسماح بالتصوير ثنائي الطول الموجي
نظام الحصول على بيانات التصوير	عناصر	NIS من نيكون - MQS31000	يسمح بالحصول على بيانات التصوير
وحدة التحكم في الطول الموجي	وحدة نيكون	MQS41220	لتصوير البيانات وحدة
أجهزة تقسيم الانبعاثات النمطية	نيكون	MQS41410	وحدة لتسجيل بيانات التصوير
نظام تحليل بيانات التصوير	NA	Volumetry 8D5< / sup> ، فيجي	يسمح بتحليل شدة التألق وبيانات التصوير الأخرى

MBA74100 الألياف البصرية