تصوير تفاعل الخلية في الغشاء المخاطي الرغامى أثناء عدوى فيروس الإنفلونزا باستخدام الفحص المجهري إينترافيتال اثنين-فوتون

اثنين-فوتون إينترافيتال المجهري (2 فناقلات الأمراض) أسلوب فعال للوقت الحقيقي التصوير من خلية إلى خلية التفاعلات التي تحدث في البيئة الطبيعية على¹. واحدة من المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب أنه يتيح دراسة العمليات الخلوية في عمق عينة أكبر (500 ميكرومتر إلى 1 ملم) بالمقارنة مع سائر تقنيات التصوير التقليدية². في الوقت نفسه، يقلل استخدام اثنين الفوتونات منخفضة الطاقة المتولدة عن الليزر اثنين-فوتون تلف الأنسجة الصور المرتبطة عادة ب عملية اقتناء الصورة². خلال العقد الماضي، طبق ف 2-ناقلات الأمراض لدراسة مختلف أنواع التفاعلات خلية في عدة تخصصات^3،،من⁴⁵. وكانت هذه الدراسات ذات الصلة وبخاصة للتحقيق في الخلايا المناعية، التي تتميز بديناميتها عالية وتشكيل جهات بارزة بعد الإشارات التي تم إنشاؤها بواسطة الخلايا الأخرى والبيئة. 2 فناقلات طبق أيضا على دراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة والمضيفة⁶. وفي الواقع، سابقا ثبت أن بعض العوامل الممرضة يمكن أن تغير نوع ومدة بالاتصالات بين الخلايا المناعية، تعوق الاستجابة المناعية⁷، نتيجة لذلك.

الغشاء المخاطي لمجرى الهواء هو أول موقع الاستجابة المناعية ضد العوامل الممرضة المحمولة جوا التي ولدت⁸. ولذلك، في فيفو تحليل التفاعلات المضيف الممرض في هذا النسيج أمر حاسم لفهم الشروع في آليات الدفاع المضيف أثناء الإصابة. 2 فناقلات الأمراض للخطوط الجوية غير صعبة أساسا نظراً للنتائج الملموسة التي تنتجها دورة التنفس للحيوان، الذي يعرض للخطر عملية الحصول على الصور. في الآونة الأخيرة، وقد وصف النماذج الجراحية المختلفة للتصوير القصبة الهوائية موريني^{9،10،11،12} والرئتين^13،،من^{1415، 16}. تمثل نماذج الرغامى ف 2-ناقلات الأمراض إعداد ممتاز لتصور المرحلة الأولى من رد فعل المناعة في الخطوط الجوية العليا، بينما نماذج ف 2-ناقلات الأمراض الرئة-الحويصلات الهوائية أكثر ملاءمة للدراسة في المرحلة المتأخرة من العدوى. نماذج الرئة المتقدمة هذا القيد المرتبطة بوجود الحويصلات الهوائية المملوءة بالهواء، التي تحد من اختراق الليزر الضوئية وجعل الطبقة المخاطية للخطوط الجوية الخزعات التي يتعذر الوصول إليها في فيفو التصوير¹⁷ . على العكس من ذلك، وهيكل القصبة الهوائية، التي شكلتها ظهارة مستمر، يسهل الحصول على الصور.

نقدم هنا، بروتوكولا يتضمن وصفاً مفصلاً للخطوات المطلوبة للقيام بعدوى الإنفلونزا، وإعداد العمليات الجراحية للحيوانات، وف 2-ناقلات الأمراض من القصبة الهوائية. وبالإضافة إلى ذلك، يصف لنا مجموعة تجريبية محددة للتصور من العَدلات والخلايا الجذعية (DC)، نوعين من الخلايا المناعية تلعب دوراً هاما كوسطاء لآلية الدفاع ضد فيروس الإنفلونزا^18،19 . وأخيراً، يصف لنا إجراء تحليل التفاعلات العَدلات-DC. جهات الاتصال هذه قد ثبت أن تعدل DC التنشيط، ومن ثم تؤثر على الاستجابات المناعية ضد العوامل الممرضة²⁰.

وافق جميع الإجراءات الحيوان الفئران التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية "مكتب الطب البيطري الفدرالي السويسري" والبروتوكولات الحيوان سلطات بيطري محلي.

1. الإنفلونزا العدوى من الفئران CD11c-يفب

1. السلامة الأحيائية
   ملاحظة: الماوس تكيف السلالة من الإنفلونزا H1N1 A/Puerto ريكو/8/34 (PR8) كان يزرع في البويضات المخصبة وتنقيته ومعاير كما هو موضح سابقا²¹. جميع الخطوات التي تنطوي على الحيوانات المصابة أو عينات بيولوجية كانت تجري بالسلامة الأحيائية مجلس الوزراء وفقا لمستوى السلامة الأحيائية (BSL) شروط 2.
   1. تنظيف مجلس الوزراء السلامة الأحيائية بمحلول إيثانول 70% قبل وبعد الإجراء العدوى.
   2. تجاهل جميع النفايات المنتجة خلال هذا الإجراء السليم الذي السلامة الأحيائية المبادئ التوجيهية التالية (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). التخلص من النفايات الصلبة في صناديق أوتوكلافابل والسوائل الملوثة في أكياس بلاستيكية مملوءة بالمطهر الطبي أو حل إيثانول 70%.
2. عدوى الإنفلونزا يعطي داخل الآنف
   ملاحظة: B6. واستخدمت في هذه الدراسة cg-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/ي (CD11c-يفب)²² على خلفية C57BL/6J. وأبقى على الفئران في مرفق خالية من مسببات الأمراض خاصة في معهد للبحوث في الطب الحيوي.
   1. مكان كحد أقصى 5 العمر والجنس-المطابقة (ستة إلى ثمانية عاماً الأسبوع) CD11c-يفب الفئران في قفص. الانتظار لمدة يومين على الأقل للفئران التأقلم لظروف السكن قبل الإجراء العدوى.
   2. تذويب PR8 المخزون وإعداد تمييع المقابلة باستخدام x 1 الباردة المالحة العازلة فوسفات دولبيكو لتعديلها بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم (PBS) للحصول على تركيز نهائي 200 لوحة تشكيل وحدات (بفو) في 30 ميليلتر. إبقاء الفيروس تمييع على الجليد أثناء الإجراء بأكمله.
      ملاحظة: ينصح المعايرة لكل دفعة من فيروس الإنفلونزا قبل استخدامه التأكد من جرعة إصابة بدقة.
   3. حقن جرعة من الكيتامين (100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ) إينترابيريتونيلي (القائمة) باستخدام حقنه 1 مل إبرة ز 26.
   4. الانتظار حتى يتم الماوس تماما تخديره (خسارة كاملة للاستقامة ودواسة منعكس سحب). التخدير العميق ضروري لعدوى أمثل، حيث سيتم ابتلاع الفئران تماما عدم تخديره أو طرد العدوى الفيروس، مما يؤدي إلى اختلافات في جرعة العدوى.
   5. ضع الماوس أنيسثيتيزيد في موقف ضعيف. جمع 15 ميليلتر من فيروس العدوى. ضع طرف ماصة قريبة من الآنف الأيمن الماوس والاستغناء عن العدوى الفيروسية قطره قطره. كما يجب أن يكون استنشاقه قطرات، لا "الماصة؛" لهم مباشرة داخل تجويف الآنف.
   6. الانتظار 2-5 دقائق ووضع طرف ماصة تحتوي على ميليلتر 15 الباقية من فيروس العدوى في منخر الحق.
      ملاحظة: لتجنب الاختناق، الاستغناء عن قطرات صغيرة الحجم في حوالي 20 s الفواصل.
   7. تحقق من أن الماوس هو التنفس بشكل صحيح ووضعه في قفص في الأفقي استلقاء. رصد الماوس التنفس والتخدير الإنعاش (حوالي 60 دقيقة بعد التعريفي).
      ملاحظة: من الممكن أن تصيب الماوس أكثر من 1 في نفس الوقت. في هذه الحالة، إدارة العدوى الفيروسية في الآنف الأيسر من جميع الفئران في تسلسل والانتظار لمدة 2-5 دقائق وثم إدارة الفيروس في الآنف الصحيح. لتجنب التباين بين الأفراد، تصيب الفئران لا يزيد عن 3 في نفس الوقت.
   8. مراقبة صحة الحيوان مركز وفقدان الوزن يوميا.
   9. Euthanize الفئران وفقا لنقطة النهاية إنسانية يحدد المبادئ التوجيهية للسلطة. يجب أن تكون معتمدة من قبل السلطات الحيوان التجريب أسلوب القتل الرحيم ويجب احترام القواعد الأخلاقية المحلية. وبعد تجارب اثنين-فوتون، euthanize الفئران الإدارة من جرعة زائدة من الكيتامين/xylazine متبوعاً بخلع عنق الرحم. في جميع التجارب الأخرى، استخدم استنشاق أول أكسيد الكربون₂ كأسلوب للقتل الرحيم.
      ملاحظة: يمكن إجراء المقايسة (RT-PCR) كما هو موضح سابقا²³لقياس التتر الفيروسية من القصبة الهوائية المصابة أو المقايسة الجرعة المعدية (TCID50) زراعة الأنسجة 50% أو الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل.
3. تقييم لتجنيد العَدلات في القصبة الهوائية بالتدفق الخلوي
   ملاحظة: يكون هذا الجزء من البروتوكول الاختياري. ويهدف إلى تقييم تجنيد العَدلات في مخاطية الرغامى بعد الإصابة بالإنفلونزا.
   1. Euthanize الفئران المصابة وغير مصاب مراقبة في اليوم الثالث بعد الإصابة (بي) باستنشاق أول أكسيد الكربون₂ .
      ملاحظة: للحيلولة دون تلف الرغامى، تجنب استخدام التفكك عنق الرحم إلى euthanize الحيوانات. بالإضافة إلى ذلك، ينصح نضح euthanized الفئران لتفادي التلوث من العَدلات الدم.
   2. رش الرقبة الماوس مع الحل الإيثانول 70% وتنفيذ شق جلد باستخدام مقص جراحي من الصدر إلى الذقن.
   3. فصل في الغدد اللعابية استخدام الملقط وفضح القصبة الهوائية.
   4. تشريح العضلات حول القصبة الهوائية باستخدام الملقط، والمقص.
      ملاحظة: هذه الخطوة يجب إجراء بعناية منذ القصبة الهوائية يمكن أن تتلف بسهولة أثناء الإجراء.
   5. عقد القصبة الهوائية بالملقط وفصل المريء بعناية بالتشريح.
   6. عقد الجزء الوعائي من القصبة الهوائية مع الملقط، جعل شق في بداية الشجرة الشعب الهوائية. ثم فصل القصبة الهوائية من الحنجرة وإزالة بعناية أي عضلات غادر.
   7. ضع الجهاز في أنبوب 1.5 مل تحتوي على RPMI 1640 + حبيس المتوسطة (ربمي) على الجليد.
   8. إعداد الخليط إنزيم الهضم القصبة الهوائية، التي تتضمن 0.26 وحدة/مل من كولاجيناز (الأول والثاني) و 0.2 مغ/مل من الدناز في ربمي.
   9. مكان تشريح القصبة الهوائية في صفيحة 6-البئر الذي يحتوي على 1 مل مزيج الإنزيم.
   10. قطع الجهاز إلى قطع صغيرة بالمساعدة ملقط ومقص. تبقى لوحة على الجليد أثناء هذه الخطوة.
   11. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. وخلال هذا الوقت، اهتز لوحة كل 15 دقيقة.
   12. وقف إنزيم الهضم عن طريق إضافة 1 مل من نظام مراقبة الأصول الميدانية الغسيل المخزن المؤقت (2 مم يدتا و 2% معطل الحرارة تصفية تعقيم الجنين البقري المصل (FBS)) في برنامج تلفزيوني.
   13. ريسوسبيند الحل مع ماصة 1 مل للمساعدة في أن تنأى بالقطع عسر الهضم جزئيا من الأنسجة.
   14. نقل الحل إلى بئر أخرى بتمرير المحتوى من خلال مصفاة 40 ميكرومتر. ثم، بلطف تحطيم القطع المتبقية للجهاز المحاصرين على رأس مصفاة استخدام المكبس حقنه 2 مل.
       ملاحظة: تحطيم القطع عسر الهضم جزئيا من القصبة الهوائية عبر مصفاة خطوة حاسمة الحصول عدد أمثل من الخلايا أثناء تحليل تدفق سيتوميتريك.
   15. تغسل جيدا وفي المصفاة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية الغسيل المخزن المؤقت ونقل التعليق في أنبوب 5 مل أبقى على الجليد.
   16. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 166 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية الغسيل المخزن المؤقت.
   17. المضي قدما في تلطيخ جسم السطحية للتدفق الخلوي. بإيجاز، كتلة مستقبلات Fc من الخلايا المعزولة باستخدام جسم مضاد ضد CD16/32، متبوعاً تلطيخ السطحية. لتحديد العَدلات بشكل صحيح، يجب أن تحتوي لوحة قياس التدفق الأضداد التالية: αLy6G، αCD11b، αCD45، فضلا عن بقاء صبغ لاستبعاد الخلايا الميتة.
   18. تشغيل المحتوى كله من العينات في سيتوميتير تدفق وتحليل البيانات.
       1. للحصول عدد أمثل من الخلايا المناعية، تشغيل تعليق خلية مفردة بسرعة لا تفوق 3,000 الأحداث/s. هذا سوف تقليل عدد الأحداث المستبعدة خلال اقتناء. باستخدام هذا البروتوكول، ينبغي أن يكون من الممكن الحصول على 1 إلى 2 مليون من الخلايا في القصبة الهوائية.

2-العزلة وحقن من العَدلات

ملاحظة: في هذا الإجراء، B6.129 (الممثل المدني)--تيراغرام (كاج-اكفب) CK6Nagy/ياء الفئران (CK6-اكفب) كانت تستخدم²⁴. عن هذه الحيوانات الحراجية المعتمدة في جميع أنواع الخلايا تحت المروج البشرية β-أكتين. وبدلاً من ذلك، من الممكن أيضا استخدام الفئران C57BL/6J لعزل الخلايا ووصمة عار لهم وفقا للبروتوكول هو موضح في الخطوة 2، 6. تنقية والتلاعب في العَدلات قد يزيد وضعهم التنشيط، يحتمل أن تغيير خصائصها الوظيفية والكثيرة الارتحال.

1. Euthanize الحيوان باستنشاق أول أكسيد الكربون₂ .
2. إزالة كل قصبة وتيبياس وتنظيفها برفق باستخدام الملقط.
3. قطع epiphyses العظام وتدفق نخاع العظام باستخدام حقنه 1 مل مليئة ببرنامج تلفزيوني الباردة العقيمة، في أنبوب 50 مل أبقى على الجليد.
4. ريسوسبيند الخلايا مع إبرة 18 جرام وتصفية تعليق خلية مع مصفاة 40 ميكرومتر. أغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني في 110 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند الخلايا في 2 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
5. تمييع 100 ٪ بركل 9:1 في برنامج تلفزيوني x 10 وإعداد الحلول المتدرجة من بركل 72%، 64% و 52% 1 x PBS باستخدام. الطبقة 2 مل لكل من التدرجات الثلاثة في أنبوب 15 مل بعناية، بدءاً من الأكثر تركيز واحد.
   1. أضف بعناية 2 مل تعليق خلية نخاع العظم على رأس التدرجات وأجهزة الطرد المركزي في س 1,100 ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) دون تسريع والفرامل.
6. بعناية إزالة الفرقة في مجال التفاعل بين 64 في المائة و 72 في المائة وغسله مرة واحدة في 200 x غ لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع برنامج تلفزيوني الباردة. ريسوسبيند الخلايا في حجم 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني وإبقائهم على الجليد. نقاء العَدلات من المتوقع أن يكون أعلى من 90%.
7. بشكل اختياري، تسمية العَدلات مع مجموعة انتشار خلايا باستخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. إضافة الصبغة إلى تعليق خلية لتركيز نهائي 10 ميكرومترات في حجم 1 مل واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ويغسل (166 س ز، 5 دقيقة).
8. تقدير تركيز الخلية باستخدام هيموسيتوميتير وحقن الوريد 5 × 10⁶ خلايا في حجم الحد أقصى من 100 ميكروليتر في الفئران المصابة سابقا CD11c-يفب⁺ استخدام ز 26 إبرة 1 مل حقنه، ح 12 قبل التصوير.

3-إعداد الماوس للتصوير

1. التخدير
   1. تخدير الفئران CD11c-يفب⁺ المصابة في اليوم 3 بي وفقا للخطوة 1.2.3.
   2. حالما يتم تخديره عميق من الفئران، تعد قسطرة للتخدير إعادة الجرعات.
      1. إزالة إبرة 30 جرام من حقنه باستخدام الملقط.
      2. أدخل الإبرة لقطعة 20 سم من أنابيب السيليكون الطبي PE-10.
      3. إدراج 30 غ إبرة حقنه مليئة بخليط الكيتامين/إكسيلازيني على الجانب الآخر من الأنبوب.
      4. إزالة الهواء داخل الأنبوب.
   3. إعداد 20 غ قسطرة متصلة بأنبوب من جهاز إينسوفلاتينج أكسجين للمحافظة على التهوية الآلية (الشكل 1Aأنا). إعداده بنسبة التنفس من 130 نبضة في الدقيقة (b.p.m.) بحجم 0.2 مل استخدام إمدادات غاز أكسجين 100% من المد والجزر.
2. إعداد الماوس لجراحة
   1. الاحتفاظ بالماوس على لوحة العمليات جراحية مخصصة محددة (1A الشكلالثاني-الثالث) عبر صفيحة ساخنة أو مقعد جراحية ساخنة تعيين في 37 درجة مئوية لكل الوقت لعملية جراحية.
   2. حلاقة الشعر من رقبة الماوس باستخدام حلاقة الكهربائية وكريم مزيل الشعر (الشكل 1Bأنا)-
   3. ضع الماوس فوق الماوس البلاستيك الموضعية (الشكل 1Aالثاني-أ)، إبقاء رأسه الحيوان خارج الموضعية (1B الشكلالثاني) لإنشاء زاوية تسهل تنبيب القصبة الهوائية.
   4. إصلاح الأمامية والكفوف والذيل مع الشريط الجراحي وترطيب العينين الماوس مع هلام فيتامين (أ) إثراء وتطهير الرقبة الماوس (1B الشكلالثاني).
3. جراحة
   1. تحضير العناصر يعقم بشكل صحيح، إلا وهي المقص والمقص ميكروسورجيكال والملقط.
   2. إجراء شق صغير على محور وسطى طويل العنق، حوالي 1 سم طويل، في منطقة وسط بين أعلى الصدر وخط يمر عبر النقطة السفلي للفك السفلي (1B الشكلالثالث).
   3. التحرك أفقياً بقع الجلد والغدد اللعابية ووضع تصور للقصبة الهوائية، مشمولة بالعضلات. ثم تشريح عضلات القصبة الهوائية بعناية باستخدام الملقط (1B الشكلالثالث).
   4. التنبيب الماوس مع قسطرة وبدء التنفس الاصطناعي (1B الشكلالرابع).
      ملاحظة: وتتألف من جزء البلاستيك الخارجي، الذي يحمي الغشاء المخاطي الرغامى، وابرة حديد داخلية القسطرة. ويمثل وجود الإبرة الحل المثالي لتوسيع وتحقيق الاستقرار في القصبة الهوائية وتنظيم المعرض لها. وسوف تضمن التهوية الاصطناعية عن طريق القسطرة التنفس السليم للماوس.
   5. البدء فورا في التهوية الاصطناعية للماوس جهاز التنفس.
   6. إصلاح القسطرة الارتفاع واتجاه استخدام خطاف جراحي (1B الشكلالخامس) متصل بقضيب معينة على لوحة العمليات الجراحية (1A الشكلالثاني-ب). كشف القصبة الهوائية في نفس الارتفاع من الذقن.
   7. تطويق القصبة الهوائية مع فازلين وتغطية ذلك مع بضع قطرات من برنامج تلفزيوني ساخن مسبقاً لضمان ترطيب مناسب للجهاز (1B الشكلالسادس).
   8. جبل ساترة على أعلى الإعداد. لهذه الخطوة، الصق ساترة على حامل معدني (الشكل 1Bالسابع)، الذي سوف يكون مشدود إلى المترجم XYZ (1A الشكلالثاني-جيم). ضبط المترجم XYZ لوضع ساترة على رأس إعداد العمليات الجراحية.
   9. مكان القسطرة لإدارة التخدير إينترابيريتونيلي (1B الشكلالثامن).
   10. حقن 50 في المائة الجرعة الأولى من الكيتامين/xylazine الخليط كل 30 دقيقة.
       ملاحظة: إعادة الجرعات من 50% إلى 25% المخلوط الكيتامين/xylazine الأولية هو بديلة آمنة وصالحة²⁵. بيد أن هذا البروتوكول المحطة الطرفية ومطلوب التثبيت دقيق للحيوان أثناء الإجراء بأكمله، استخدام جرعات أعلى للحفاظ على طائرة جراحية العميقة للتخدير.

4. في فيفو الوقت الفاصل بين التصوير

ملاحظة: الحصول على الصور وأجرى مع مجهر اثنين-فوتون تستقيم، مجهزة بأشعة الليزر Ti:Sa اثنين وغرفة حضانة درجة الحرارة التي تسيطر 25 X/1.1 غ الماء الغمر والهدف. وكانت فوتومولتيبليرس (PMT) المستخدمة للحصول على الصور كاشفات الهجين أو حساسية عالية جاسب.

1. وضع المجلس الجراحية باستخدام الماوس أنيسثيتيزيد داخل غرفة الحضانة المجهر (قبل تسخينه عند 37-38 درجة مئوية) وإضافة قطره مياه على ساترة.
2. تركيز المركز والعثور على أنسجة القصبة الهوائية.
3. ضبط تردد المسح الضوئي إلى 800 هرتز، مع 520 x 520 بكسل، مجال رؤية ميكرومترات 440 × 440² وخط متوسط 1.
   1. لحن Ti:Sa الليزر إلى 830 نانومتر لإثارة الجيل الثاني متناسق (SHG) من الكولاجين، مع قوة يدل على مصدر 150 ميغاواط. لحن الليزر Ti:Sa الثاني في 920 نيوتن متر مع 94 ميجاوات في المصدر، تثير الحراجية المعتمدة ويفب.
   2. الهيكل الثلاثي الأبعاد وطريقة اكتساب timelapse مع الإثارة المتزامنة
      ملاحظة: الاحتفاظ بصلاحيات الليزر منخفضة قدر الإمكان للتقليل من فوتوبليتشينج والضيائيه.
4. سجل الفلورية استخدام قناتين في وضع غير ديسكانيد، مع مرآة مزدوج اللون رئيسي في 560 نانومتر. في التشكيل المستخدمة في هذا البروتوكول، تقسيم مرآة مزدوج اللون ثاني الإشارة في 495 نيوتن متر لفصل قناة 1 (تصفية الانبعاثات 475/50) من القناة 2 (تصفية الانبعاثات 525/50) (الشكل 2 أ). يجمع هذا التكوين SHG الخفيفة من الكولاجين في القناة الأولى، بينما يتم جمع الانبعاثات الحراجية المعتمدة في كلتا القناتين 1 و 2 ويتم جمعها يفب فقط في القناة الثانية.
5. تعريف مجموعة ميكرومتر 50 على المحور Z، مع حجم خطوة 3 ميكرومتر (فوكسل الحجم 0.86 ميكرو x 3 ميكرومتر). سجل الصور كل 30 ثانية لمجموع مدة 30 دقيقة.
6. إذا رغبت في ذلك، الحصول على مناطق متعددة. قبل تشغيل المزيد من المقتنيات، فحص العلامات الحيوية ونحثهما التخدير عن طريق القسطرة إذا لزم الأمر (راجع الخطوة 3.3.10).
7. في نهاية عملية التصوير، euthanize الماوس عن طريق جرعة زائدة من الكيتامين/xylazine متبوعاً بخلع عنق الرحم.

5-صورة التحليل الكمي وتجهيز حركية العَدلات-العاصمة والتفاعل

ملاحظة: استخدمت برنامج تصوير متخصصة في هذا البروتوكول، لتحليل بيانات الفحص المجهري.

1. بعد الانتهاء من الحصول على الصور د 4، نقل الملفات (البيانات والبيانات الوصفية) على محطة عمل مع الموارد الحسابية كافية (اقترح متطلبات النظام الحد الأدنى: 32 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي، وحدة المعالجة المركزية سرعة سوليد الدول محركات، مؤخرا، مكرسة الجرافيك على أساس واسع العمارة المتوازية).
2. فتح الملفات في برامج التصوير.
3. تشغيل الفيديو والتأكد من أن الخلايا التي تهم مرئية بوضوح وأن التحف التصوير غائبة.
   ملاحظة: وتحقيقا لهذه الغاية، تحقق من أن كل حركة للعينة وتباين السطوع محصورة بما فيه الكفاية. وفي الواقع، تمثل هذه التحديات ل التحليل الآلي²⁶. إذا كانت حركة عينة بين الإطارات المتجاورة المفرط، تطبيق أسلوب تصحيح الانحراف، على سبيل المثال باستخدام قناة SHG كمرجع ثابت. هذا يسمح لتدبير أفضل حركة الخلايا بدلاً من الحركة للعينة. بالإضافة إلى ذلك، وجود خلفية ساطعة أو الحطام، تقليم السطوح أعيد بناؤها باستخدام وحدة التخزين كمعلمة تحديد.
4. إنشاء محدد قناة تعريب المشارك للخلايا الحراجية المعتمدة⁺ ، بغية فصل إشارة بين الحركة والكولاجين (SHG). وتحقيقا لهذه الغاية، الدلالة مضلع النابضة (الشكل 2Bأنا) الذي يحدد فقط فوكسيلس بعد كثافة إيجابية سواء في قناة الأخضر في القناة الزرقاء.
   ملاحظة: هذا الإجراء قد تختلف وفقا لتصفية مجموعة من المجهر وتلطيخ الخلايا. يمكن أن يتحقق عن طريق تحديد فقط فوكسيلس بكثافة كافية في كل من الأخضر والأزرق القنوات. بين الأدوات المتاحة، يمكن استخدام وظيفة "كولوك" لحساب قناة كولوكاليزاتيون استناداً إلى مستوى العتبة كثافة تلقائياً. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام أساليب تستند إلى التعلم الآلي لهذه الخطوة بالإشراف الخبراء²⁷.
5. كشف وتعقب الخلايا الحراجية المعتمدة⁺ ، والتعمير السطح التلقائي باستخدام وتتبع (أداة السطحية) عبر قناة التعريب المشارك المناسب.
   ملاحظة: curation اليدوية في نهاية المطاف تتبع الأخطاء والاستبعاد من المسارات لمدة أقصر من عتبة محددة (أي، 150 ق) قد تكون مطلوبة.
6. إنشاء محدد قناة تعريب المشارك للخلايا CD11c-يفب⁺ ، بغية فصل الإشارات الحراجية المعتمدة ويفب. وتحقيقا لهذه الغاية، الدلالة مضلع النابضة (2B الشكلالثاني) الذي يحدد فقط فوكسيلس وجود كثافة إيجابية في قناة الأخضر ولكن كثافة منخفضة في القناة الزرقاء.
   ملاحظة: ميكروجرافس الممثل تظهر الإشارات من القناة الأولى والقناة 2 والقناة التعريب المشارك للحركة، قناة التعريب المشارك يفب والمزيج من جميع القنوات ويمكن الاطلاع على في 2B الشكلالثالث.
7. إعادة بناء سطح الخلايا CD11c-يفب⁺ وتتبع موقفهم على مر الزمن (أداة السطحية).
   ملاحظة: غير مطلوب دليل تصحيح الأخطاء تتبع في نهاية المطاف لهذه الخطوة. والواقع أن سبب الديناميات المعقدة الزمانية للعاصمة، تعمير سطحها دقيقة من البيانات ف 2-ناقلات الأمراض هو مهمة صعبة لا يمكن أن تتحقق مع البرمجيات المتاحة تجزئة. بين الأسباب التي تجعل هذه المهمة الصعبة، نتوءات رقيقة وتغيرات سطوع لا تسمح باستخدام بعض تقنيات معالجة الصور، مثل تجانس مرشحات أو العتبة ثابتة. وعلاوة على ذلك، في شبكة العاصمة، من الصعب فصل الخلايا المفردة فقط استناداً إلى مظهرهم في البيانات ف 2-ناقلات الأمراض. لهذه الأسباب، بدلاً من محاولة تجزئة دقيقة بتوليف معلمات البرامج، نقترح إعادة بناء الأسطح غير دقيقة من العاصمة. ثم، معالجة الأخطاء المحتملة عن طريق قياسات قوية كما هو موضح في 5.8.
8. قياس الهجرة الخلية.
   1. تصدير تدابير الهجرة الكلاسيكي للحركة⁺ والخلايا CD11c-يفب⁺ . ويشير إلى "تعني سرعة المسار" بين هذه، متوسط سرعة الهجرة من الخلايا بينما "تعقب الاستقامة" يشير إلى الاتجاه للخلايا. يمكن تصدير هذه التدابير كملف جدول بيانات من برامج التصوير.
   2. في ملفات جدول بيانات تم تصديرها، بحساب "الاستقامة تصحيح المسار" (المشار إليها أيضا كنسبة الولادة المصوبة) الحراجية المعتمدة⁺ والخلايا CD11c-يفب⁺ ، الذي يعرف بأنه "الاستقامة المسار" مضروبة في الجذر التربيعي "تعقب مدة" مقسوماً على الجذر التربيعي لمدة الفيديو. وهذا التدبير أكثر قوة من "تعقب الاستقامة" حضور قصيرة المسارات²⁸، التي تنشأ على سبيل المثال من تتبع الأخطاء.
      ملاحظة: يمكن مقارنة أشرطة الفيديو فقط من نفس الطول بهذا التدبير.
9. قياس التفاعل الخلية.
   1. تحديد جهة اتصال بين خلية الحراجية المعتمدة⁺ وخلية CD11c-يفب⁺ إذا كانت المسافة التي تفصل بينهما (أقرب فوكسيلس) مساوية أو أقل من عتبة (أي 2 ميكرومتر).
      ملاحظة: يجب أن تكون صارمة بما فيه الكفاية للكشف عن اتصال فقط عندما تكون الخلايا على مقربة من هذه العتبة. ومع ذلك، ونحن نشجع للحفاظ على هذه العتبة أكبر من 0, N مثالي مرات أكبر من دائرة نصف قطرها فوكسل (N > 2)، نظراً لتجانس الحدود يمكن أن تجعل إعادة إعمار خلايا أصغر من حجم الخلية الفعلية.
   2. عد العدد ومدة الاتصالات بين الحركة⁺ والخلايا CD11c-يفب⁺ . في برامج التصوير يمكن أن يتم ذلك على سبيل المثال بتنفيذ سد "قبله وتشغيل" في. يمكن تصدير هذه التدابير كملف جدول بيانات من علامة التبويب الإحصائيات.
10. استيراد التدابير التي سبق حسابها في برامج إحصائية، وتوليد المؤامرات وإجراء الاختبارات الإحصائية.

في هذا العمل، وصفناها بروتوكول مفصل للدراسة في فيفو الحركية والتفاعلات بين العَدلات والعاصمة أثناء الإصابة بالإنفلونزا في القصبة الهوائية مورين (الشكل 3A). لهذا الغرض، ونحن عزل الحراجية المعتمدة+ العَدلات (نقاء 92%؛ الشكل 3) من CK6-اكفب الفئران ونحن أدوبتيفيلي نقلتهم إلى ماوس يفب CD11c مصابة بإنفلونزا. وبعد ذلك، أجرينا ف 2-ناقلات الأمراض من القصبة الهوائية في بي يوم 3 عند هذه النقطة من الوقت لاحظنا توظيف واضحة من العَدلات في المنطقة المصابة، كما يتضح من تحليل تدفق سيتوميتريك (الشكل 3). البروتوكول ف 2-ناقلات الأمراض يتطلب استخدام لوحة العمليات جراحية محددة ومورد لأكسجين للقوارض (الشكل 1A). توريد الأوكسجين من خلال قنية إدراجها في القصبة الهوائية ساعدت الحيوان التنفس، ويسرت المعرض من القصبة الهوائية، والخاضعة لسيطرة حركة الجهاز المرتبطة بالتنفس (الشكل 1B). في أعقاب هذا التشكيل التجريبية، اكتسبناها مستقرة د 4 الصور في فيفو في القصبة الهوائية المصابة خلال فترة 30 دقيقة (الشكل 3Dفيلم 1).

يسمح تحليل الصور 4 د المكتسبة من خلال برامج التصوير المتخصصة لقياس هجرة الخلايا والتحديد الكمي لديناميات الزمانية العَدلات والعاصمة. فيما يتعلق بحركية الخلية، لاحظنا فوارق كبيرة بين حركة العاصمة والعدلات المعينين، الذي أظهر بسرعة أكبر كثيرا من هذا الأخير (الشكل 4 أ). وتؤكد هذه النتيجة الطبيعة الدينامية العَدلات، الموصوفة سابقا كخلايا متحركة عالية قادرة على ترحيل نحو مصدر تشيمواتراكتانت29. فيما يتعلق باتجاهيه، خلصنا إلى أن مورفولوجيا معقدة من العاصمة أسفرت عن أخطاء متكررة في خلية تتبع، الذي بدوره أنتج المسارات مع تناقص المدة وزيادة التباين يقاس سلوك الاتجاه (الشكل 4 باء). لهذا السبب، نحن يحسب متري قوية قادرة على قياس اتجاهية بالنظر في مدة المسار. باستخدام هذا المقياس، لاحظنا اختلافاً كبيرا في اتجاه العَدلات مقابل DC (الشكل 4).

بالإضافة إلى ذلك، يسمح حساب المسافة بين العاصمة والعدلات لكشف وتحليل اتصالاتهم مع مرور الوقت. وفي هذا النموذج التجريبي، لاحظنا بعض العَدلات التي شكلت اتصالات متعددة-موجز بالعاصمة وغيرها التي لا تشكل أي اتصال أثناء فترة المصورة (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، دراسة اتجاه متوسط المسافة بين العاصمة والعدلات مع مرور الوقت يسمح لنا لدراسة تحديد المواقع الشاملة للخلايا المدروسة (4E الشكل)، أثناء التحقيق في هذا الاتجاه في خلايا معينة يسمح بتميز سلوك لكل خلية واحدة (4F الرقم2 الفيلم).

رقم 1: المعدات والخطوات للناقلات ف 2 من القصبة الهوائية مورين. (منظمة العفو الدولية) تخدير الحيوان المحمولة النظام المسؤول عن التهوية الآلية متصل بمضخة أن إمدادات الأوكسجين إلى الماوس. الجبهة رأي (أخي) وعرض الجانب (أيي) المجلس الجراحية مصنوعة خصيصا تستخدم لنموذج القصبة الهوائية. ويتألف المجلس من مرحلة المعادن مع ماوس بلاستيك موضعية (أخي-أ)، رود للضغط المشبك منقولة (أخي-ب)، ودفع غرامة الانضباطي XYZ مترجم (أخي-ج). (ب) خطوات متسلسلة من طراز الجراحية الرغامى: (Bi) لإزالة الشعر من منطقة العمليات الجراحية، (Bii) لتحديد المواقع الماوس أنيسثيتيزيد في المجلس الجراحية، (بيي) المعرض الجراحية في القصبة الهوائية، (Biv ) تنبيب مع قسطرة مع التنفس الاصطناعي، وتثبيت القسطرة (Bv)، (جزر فيرجن البريطانية) بالإضافة لبرنامج تلفزيوني إلى القصبة الهوائية المكشوفة، تصاعد (بفيي) ساترة، ووضع قسطرة (بفييي) مع التخدير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: الكشف عن إشارة مضيئة أثناء ف 2-ناقلات الأمراض- (أ) التمثيل التخطيطي لاكتشاف المجهر تصفية الإعداد وقنوات المقابلة. مرآة مزدوج اللون في يفصل 560 نانومتر الأزرق/الأخضر من انبعاثات الأحمر الأحمر/المتطرف. مرآة مزدوج اللون إضافية في 495 نانومتر يستخدم لزيادة الاعتراف بمختلف المناطق من طيف الانبعاث. وتوظف القناة 1 كاشف هجين (تصفية الانبعاثات 475/50)، بينما القناة 2 الاستخدامات حساسية عالية جاسب PMT (تصفية الانبعاثات 525/50). (ب) مبعثر الممثل دوت المؤامرات إشارات ف 2 عرض الاستراتيجية النابضة لتوليد قنوات كولوكاليزيشن للتعرف على الإشارات القادمة من الحراجية المعتمدة (Bi) و fluorophores يفب (Bii). (بيي) ميكروجرافس الممثل تظهر إشارات محددة من قناة 1 (الفصل 1، الأزرق الداكن) والقناة 2 (Ch 2، الأخضر) وقناة التعريب المشارك الحراجية المعتمدة (أزرق فاتح)، وقناة التعريب المشارك يفب (أصفر) والمزيج من جميع القنوات (الفصل 1 + الفصل 2 + CFP + يفب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: تصوير د 4 إينترافيتال العَدلات والعاصمة في القصبة الهوائية إنفلونزا المصابة. (أ) ملخص تخطيطي للبروتوكول. (ب) تبين النسبة المئوية العَدلات فيما يتعلق بمجموع الخلايا CD45 + في تعليق خلية معزولة عن مورين نخاع العظام باستخدام أسلوب التدرج في بركل سكاتيربلوت سيتوميتريك تدفق الممثل. (ج) تدفق الممثل سيتوميتريك سكاتيربلوتس تظهر زيادة في تواتر حدوث العَدلات في تراتشيس من الفئران مصابة بالمقارنة بالفئران المصابة بفيروس الإنفلونزا في يوم 3 بي (د) (اللوحة اليمنى) الصورة التشريحية للفئران القصبة الهوائية عرض المنطقة المختارة للحصول على الصور. (اللوحة اليمنى) الممثل 3D الإسقاط صورة مجهرية ناقلات الأمراض ف 2 عرض تعمير السطحية من العَدلات (أزرق فاتح) والعاصمة (أصفر) جنبا إلى جنب مع المسارات في اليوم 3 بي SHG إشارة ترد في الظلام الأزرق. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: توصيف العَدلات وديناميات الهجرة والتفاعل DC في الإنفلونزا إصابة القصبة الهوائية. قطع الممثل عرض سرعة المسار يعني (أ) وتتبع الاستقامة (ب) وتصحيح المسار الاستقامة (ج)، كما حددها بلطمان وزملاؤه (2009)28، من العَدلات والعاصمة في القصبة الهوائية في بي يوم 3 مع فيروس الإنفلونزا. قياس الاستقامة تصحيح المسار المعارض متانة لتتبع الأخطاء. (د) المدرج التكراري 2D عرض تواتر العَدلات وفقا لعدد الاتصالات مع العاصمة ومتوسط مدة الاتصال. (ﻫ) متوسط المسافة من العَدلات إلى وحدة تحكم المجال DC الأقرب خلال مدة الفيلم. (و) (إلى اليسار) تحليل المسافة من ممثل العَدلات إلى أقرب وحدة تحكم المجال في الوقت. يشير الخط الأحمر المنقط إلى عتبة المسافة النظر في أن العَدلات إنشاء جهة اتصال مع وحدة تحكم المجال DC. (حق i-ثالثا) ميكروجرافس المكتسبة في نقاط زمنية مختلفة تمثل هجرة العَدلات (أزرق فاتح) إلى وحدة تحكم المجال DC (أصفر). يتم عرض المسارات الخلية كخط متعدد الألوان يتغير لونها من اللون الأزرق إلى اللون الأحمر لتمثيل الوقت. ويرد إشارة SHG من الكولاجين فيبريلاري باللون الأزرق الداكن. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. في كل الأرقام، تمثل البيانات المقدمة على الأقل ثلاث تجارب مستقلة. وترد نتائج يعني ± إحصاءات التنمية المستدامة. قبل اختبار وولش. ns p > 0.05؛ ف < 0.0001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الفيلم 1: العَدلات والعاصمة الديناميات في القصبة الهوائية أثناء الإصابة بالإنفلونزا. 30 دقيقة الوقت الفاصل بين صورة ثلاثية الأبعاد تظهر ديناميات التفاعل بين العَدلات (أزرق فاتح) والعاصمة (أصفر)، فضلا عن المسارات الخاصة بكل منها فيما يتعلق بشبكة الكولاجين (أزرق داكن) من القصبة الهوائية. يتم الإشارة إلى الممثل العَدلات-DC التفاعلات بالأسهم البيضاء. يتم عرض المسارات الخلية كخط متعدد الألوان يتغير لونها من اللون الأزرق إلى اللون الأحمر لتمثيل الوقت. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

الفيلم 2: تفاعل العَدلات-DC قصيرة الأجل الممثل في القصبة الهوائية أثناء الإصابة بالإنفلونزا. صورة 3D الوقت الفاصل بين 30 دقيقة تبين وجود تفاعل ممثل بين من العَدلات (أزرق فاتح) ووحدة تحكم المجال DC (أصفر) وعلى كل المسارات. يتم عرض المسارات الخلية كخط متعدد الألوان يتغير لونها من اللون الأزرق إلى اللون الأحمر لتمثيل الوقت. إشارة SHG من الكولاجين يظهر باللون الأزرق الداكن. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.