Method Article

تحديد وتوصيف النسيجي، وتشريح للماوس الفصوص البروستاتا لفي المختبر كروي 3D نماذج الثقافة

DOI:

10.3791/58397

⸱

September 18th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Urology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, SUNY Upstate Medical University, 3Laboratory of Comparative Pathology, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 4Boulder BioPATH, Inc

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفئران المهندسة وراثيا نماذج مفيدة للتحقيق وآليات سرطان البروستاتا. نقدم هنا بروتوكولا لتحديد وتشريح البروستاتا الفصوص من ماوس الجهاز البولي التناسلي والتفريق بينهم على أساس في علم الأنسجة، وعزل والثقافة خلايا البروستاتا الأولية في المختبر الماغنيسيوم لتحليلات المتلقين للمعلومات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمس) تكون بمثابة نماذج قبل سريرية فعالة للتحقيق في معظم أنواع السرطانات البشرية، بما في ذلك سرطان البروستاتا (PCa). فهم التشريح وعلم الأنسجة البروستاتا الماوس مهم لكفاءة استخدام والتوصيف الصحيح لمثل هذه النماذج الحيوانية. وقد البروستاتا الماوس أربع متميزة أزواج من الفصوص، كل منها خصائصها. يوضح هذا المقال الأسلوب السليم للتشريح وتحديد الماوس الفصوص البروستاتا لتحليل الأمراض. بعد التشريح، خلايا البروستات يمكن كذلك مثقف في المختبر لفهم الميكانيكية. منذ الماوس خلايا البروستات الابتدائية تميل إلى فقدان خصائصها الطبيعية عندما مثقف في المختبر، ونحن مخطط هنا طريقة لعزل الخلايا وتنمو كالثقافات كروي ثلاثي الأبعاد، والتي فعالة للحفاظ على الفسيولوجية خصائص الخلايا. يمكن استخدام هذه الثقافات ثلاثي الأبعاد لتحليل مورفولوجيا الخلايا ومستويات السلوك في ظروف قرب الفسيولوجية، والتحقيق في تعديل وتعريب البروتينات الرئيسية وسبل المشاركة في تنمية وتطور المرض، ويبحث في ردود على العلاج بالعقاقير.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ما فتئت تسعى الأوساط العلمية توضيح الآلية المعقدة للتنمية البشرية السرطان لعدة عقود. حين يبدأ تحديد اللاعبين الرئيسيين المحتملين وأهداف المخدرات مع خلايا المريض ودراسات الأنسجة، تطبيق متعدية الجنسيات مثل هذه النتائج غالباً ما يتطلب استخدام نماذج حيوانية قبل الإكلينيكية. استخدام الفئران المهندسة وراثيا نماذج (جيممس) للسرطانات البشرية نموذج ارتفع مطردا منذ إقامة "الماوس نماذج من البشر سرطانات الكونسورتيوم" (NCI-ممهكك)، لجنة الذي سعى إلى وصف وتوحيد الصفات المميزة للسرطان الماوس نماذج للعلماء في جميع أنحاء العالم1،2. نماذج الماوس تفي بالحاجة إلى الدراسات الميكانيكية في الدراسات ما قبل السريرية لمعظم أنواع السرطان، فهم في التنمية، والتقدم، استجابة للعلاج، واكتسبت مقاومة3.

سرطان البروستات هو السرطان الأكثر شيوعاً التي تحدث في الرجال، والتي تؤثر على الرجال أكثر من 160,000 كل سنة4. أشكال عدوانية من المرض تدعي عشرات آلاف أرواح كل عام. ومع ذلك، هو ما زالت غير مفهومة إليه تطور المرض. ينتج عن هذا نقص خطير في خيارات علاج فعال لسرطان البروستاتا المتقدم والمنتشر، كما يدل على ذلك ارتفاع معدل الوفيات في مرضى سرطان البروستاتا المتقدم4. ومن ثم، هناك حاجة متزايدة لنماذج ما قبل السريرية لدراسة سرطان البروستاتا. ومع ذلك، نظراً للخلافات المتأصلة بين الماوس والبروستاتا البشرية، النمذجة لسرطان البروستاتا في جيمس لم يحظ شعبية حتى تطبيق نظام "التصنيف بار هاربور" في عام 2004، الذي أوجز تغييرات نسيجية في الماوس البروستاتا عند التلاعب بالجينات وتحديد التغيرات الورمية، وعلاقتها بمراحل تطور السرطان في البشر5. من الخصائص الهامة للبروستاتا الماوس التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند دراسة أي نموذج جيمم البروستاتا هو وجود أربع متميزة أزواج من الفصوص: الأمامي والجانبي والبطني والظهريه. يقدم الفصوص اختلافات كبيرة في الأنسجة والجينات نمط التعبير6. يمكن أن يختلف نمط التعبير البروتين بروباسين بين الفصوص في الشباب بعد سن البلوغ الفئران7، التي يجب مراعاتها منذ معظمها صممت النماذج المستندة إلى لجنة المساواة العرقية جيمم مروج المستندة إلى بروباسين باستخدام استدعاء Pb-Cre47. الاختلافات المكانية والزمانية الناتجة في التعبير لجنة المساواة العرقية غالباً ما تؤدي إلى الاختلافات في مواعيد بدء وتطور الورم، فضلا عن الاختلافات في التغيرات الورمية بين الفصوص. ومن ثم، فمن المهم مراعاة لمثل هذه الخلافات أثناء دراسة التنمية ورم في البروستاتا جيمس، والفصوص الفردية قد تحتاج إلى تقييم كل على حدة لتحقيق النتائج استنساخه. ويصف الجزء الأول من هذه المقالة الأساليب المناسبة تشريح البروستاتا ماوس، وتحديد وفصل كل الفص والاعتراف بالفروق في غذائها الفصوص.

بينما تحليل نمو الأورام والأنسجة يمكن أن توفر أفكاراً قيمة في تطوير الورم، أنها لا توفر الكثير من المعلومات عن الآليات الجزيئية. دراسة إليه الورم التنمية والتقدم وغالباً مفيدة لتحليل الخلايا السرطانية في المختبر. تم اقتراح عدة أساليب على مر السنوات التي تنطوي على الثقافات لهذه الخلايا، بما في ذلك تعليق الثقافات والثقافات 3D8 ، وفي الآونة الأخيرة، الثقافات 2D العادية9. بينما يؤدي معظم هذه الأساليب في معدلات البقاء على قيد الحياة وانتشار الخلايا جيدة، ثقافات 3D توفر بيئة الأقرب إلى الظروف الفسيولوجية. في الثقافات 3D أو كروي نمت في مصفوفة خارج الخلية غشاء الطابق السفلي (ECM)، والخلايا لومينال متمايزة تماما عادة ما يكون معدل بقاء منخفضة جداً؛ الخلايا القاعدية والوسيطة (معظمها الخلايا الجذعية) غير قادرة على نشر وإنتاج مجموعات الخلية تسمى الماغنيسيوم10. وهذا يجعلها مناسبة لدراسة سرطان منذ سرطان طلائي يعتقد أنها تنشأ من الخلايا الجذعية (المعروفة شعبيا باسم الخلايا الجذعية السرطانية)11. ويصف الجزء الثاني من هذا البروتوكول طريقة لاستزراع خلايا البروستات الماوس في الثقافات 3D. يمكن استخدامها في المجالات الناتجة عن ذلك لعدة أنواع من التحليلات المتلقين للمعلومات، بما في ذلك دراسة مورفولوجية أورجانويد والسلوك بخلية يعيش التصوير، الفلورة تلطيخ للبروتينات المختلفة، ودراسة الردود على العلاج الكيميائي العلاجات.

عموما، والهدف من هذا البروتوكول بيان الأساليب المثلى لاستخدام نماذج الماوس في سرطان البروستاتا بوصف تقنيات التشريح والتشريح البروستاتا الماوس وتجهيز الأنسجة للثقافات كروي وتحليلها في المختبر .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب الماوس الموصوفة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في البروتوكولات وافق IACUC المؤسسي في جامعة ولاية نيويورك شمال ولاية الجامعة الطبية.

1-تشريح الجهاز البولي التناسلي (UGS)

ملاحظة: يتم عرض التخطيطي في الشكل 1.

  1. Euthanize ماوس C57BL/6 ذكور عمره 3 أشهر باستخدام أسلوب القتل الرحيم استنشاق أول أكسيد الكربون2 أو تقنية أخرى تمت الموافقة عليها.
    ملاحظة: الفئران تتراوح أعمارهم ما بين 3 و 12 شهرا يمكن أن تستخدم بنجاح لهذه التجربة. الفئران الأكبر سنا (> 6 أشهر) سوف يكون على الأرجح المزيد من الدهون حول UGS، التي سوف تحتاج إلى أن يتم مسح. من الصعب غالباً تحديد وفصل الفصوص في الفئران الذين تقل أعمارهم عن 3 أشهر. يمكن استخدام سلالات أخرى للتجربة، كذلك.
  2. ضع الماوس على ظهرها وتأمين الساقين استخدام دبابيس بحيث يتم عرضها على الجانب البطني للحيوان.
  3. رش الإيثانول 70% في البطن للماوس والقضاء عليها نظيفة.
    ملاحظة: حلق شعر البطن قبل تشريح غير مطلوب.
  4. رفع الجلد من البطن، جنبا إلى جنب مع طبقة العضلات، مع زوج من الملقط حادة المتوسطة وشق على شكل Y مقلوب في البطن باستخدام مقص.
    1. أولاً، إجراء شق مستقيم مع زوج من مقص حاد من فوق القضيب للقص (الشكل 2a).
    2. قطع من قاعدة للشق نحو كل إصبع، حتى الفخذين (الشكل 2). أمثال مرة أخرى الجلد على كلا الجانبين، وفي الجزء السفلي لعرض منطقة البطن بكاملها (الشكل 2 ج-ه).
      ملاحظة: يختلف حجم قطع تعتمد على الماوس العمر والحجم. حجم شق مستقيم الأولية قد تتراوح بين 1.5 إلى 4 سم، تبعاً لحجم الماوس.
  5. حرك الأجهزة الأخرى لفضح UGS. رفع ونقل الأمعاء البنى والأصفر (الشكل 2 واو). التقاط منصات الدهون البطن (غير شفاف أبيض الاسفنجية الأنسجة) مع الملقط ونقلها إلى الجانبين (الشكل 2 ز).
    ملاحظة: UGS تتألف من الحويصلات ومجرى البول والبروستاتا، والقناة deferens (الاسهر) والمثانة. يمكن التعرف عليه بزوج مميزة من كامد الأقواس نصف دائري أبيض (وهي الحويصلات)، مع الكيس المثانة مملوءة بسائل يعلق على القاعدة. الأنسجة شفافة يقع الحق بموجب الحويصلات من البروستات.
  6. تحديد موقع في UGS وإيمانا راسخا عقد المثانة البولية مع الملقط حادة، ورفع UGS كامل صعودا من البطن الماوس.
    ملاحظة: إذا كانت المثانة ممتلئة، استنزاف أولاً مع حقنه صغيرة لتوفير أفضل قبضة الملقط والحد من خطر تمزيق المثانة.
  7. الاستمرار في سحب ما يصل على المثانة، الشريحة مقص تحت المثانة والبروستاتا وصولاً إلى العمود الفقري، وجعل قطع. قطع طريق أية اتصالات المتبقية إلى تجويف البطن (الشكل 2 ح و 2 طاء). أن يكون حريصا على عدم قطع قريبة جداً إلى UGS لتجنب قطع عرضي من خلال أي أنسجة البروستاتا.
    ملاحظة: حين جعل القطع تحت UGS، المقص ينبغي إدراج وصولاً إلى الجزء الخلفي الماوس، حيث أن القطع يستقر العمود الفقري، وكذلك. ويؤدي هذا الأسلوب في قطع جميع الصلات القائمة بين UGS وتجويف البطن في قصاصة واحدة، تخفيض الوقت اللازم لاستخراج النسيج من الماوس تقريبا.
  8. إزالة UGS ووضعه في 2-6 مل (ما يكفي لتغطية الأنسجة) الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة (دميم، الجلوكوز عالية) في 6 سم طبق بتري (الرقم 2j وك 2) ونقلها إلى مجهر تشريح (10 X التكبير).
    ملاحظة: تغيير الوسائط تشريح كما هو مطلوب في الخطوات المتبقية.

2-تشريح البروستات

  1. قم بمسح جميع الدهون من كلا الجانبين الظهري والبطني مع زوج من غرامة ملقط ومقص ميكروديسيكشن (الشكل 3a). استخدام الأدوات الجراحية مماثلة لبقية البروتوكول التشريح.
    ملاحظة: الدهون هو كثيرا ما تتداخل تداخلاً وثيقا مع UGS (يمكن تحديد من خلال مظهره الاسفنجية البيضاء)؛ ومن ثم، يجب إجراء هذه الخطوة بعناية لتجنب القطع بطريق الخطأ إيقاف أي أنسجة البروستاتا. يمكن أن يستغرق مدة تصل إلى 10-15 دقيقة لمسح جميع الدهون.
  2. عقد وسحب المثانة مع الملقط وقص في القاعدة مع المقص (الشكل 3b).
  3. ضع الجانب البطني الأنسجة المتبقية أعلى. عقد واحد القناة deferens مع الملقط، تتبع ذلك إلى القاعدة مع مقص، وقص عليه (الشكل 3 جيم)، ثم كرر على الجانب الآخر. إزالة deferens القناة، الآن تاركين وراءهم البروستاتا (شفافة وفيرمينوس)، الحويصلات (كامد وأبيض، نصف دائري)، والإحليل (الأنبوب الأحمر الوردي ومبهمة) (الشكل 3d و 3e).
  4. إدراج الملقط بين القوس الداخلي من الحويصلات وأنسجة البروستاتا الفصوص الأمامية. حدق بعيداً في الحويصلات والبروستاتا وقص أي النسيج الضام كاللازمة (3f الشكل). تتبع الحويصلات إلى قاعدتهم في مجرى البول وإزالتها (الشكل 3 ز وح 3). كن حذراً لا للثقب لهم.
  5. الشروع في تشريح بها الفصوص البروستاتا الفردية.

3. تشريح الإجمالي ميكروديسيكشن الفص البروستاتا والفردية (الشكلان 3i-n، الرقم 4)

  1. الوجه الأنسجة مع زوج من الملقط حادة حيث أنه يواجه الجانب الظهرية، عرض الفصوص الظهرية، الذي سوف تشبه أجنحة الفراشة.
  2. جمع الفصوص الظهرية بالضغط الفص مع الملقط والقص في القاعدة مع المقص (3j الشكل).
  3. اقلب الأنسجة المتبقية إلى الجانب البطني.
  4. جمع الفصوص الجانبية، وصغيرة وعادة التفاف مجرى البول من ناحية، تقع بين الفصوص الأمامية والبطني والظهريه (الشكل 3 ك).
  5. بعد ذلك، جمع الفصوص البطني، التي هي أكبر من الفصوص الجانبية وتكمن في مجرى البول بطنيا (الشكل 3 لتر).
  6. الماضي، حصاد الفصوص الأمامية، أكبر من الأربعة، وخفض والتخلص من مجرى البول (الشكل 3 م).
  7. عملية قطع الأنسجة وفقا للاحتياجات التجريبية. انتقل إلى القسم 4 للأنسجة، أو إلى الباب 5 لثقافة كروي.

4-الفص تحديد الهوية ومورفولوجيا من الهيماتوكسيلين والشرائح ويوزين الملون

  1. إصلاح أنسجة البروستاتا، وتضمين ذلك في البارافين. المضي قدما في تلطيخ الشرائح والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) لعرض وتحديد الفروق في الفصوص البروستاتا استناداً إلى علم الأنسجة، باستخدام خصائص أوجزها أوليفيرا وآخرون. 12 (الشكل 5).

5-تجهيز الأنسجة للثقافة 3D10

ملاحظة: هذا هو المبين في الشكل 6.

  1. المضي قدما في استزراع الفصوص كله البروستاتا أو الفردية وفقا لاحتياجات التجريبية. نقل أنسجة البروستاتا لطبق 10 سم تحتوي على 2-3 مل دميم. مع مشرط، فرم الأنابيب البروستات ناعما بالتساوي قدر الإمكان تحت مجهر التشريح.
  2. متابعة تنفيذ الخطوات المتبقية تحت غطاء زراعة الأنسجة، تحت ظروف معقمة.
  3. نقل قطع الأنسجة جنبا إلى جنب مع دميم إلى أنبوب 15 مل وزيادة الحجم لمل 9 مع دميم. إضافة 1 مل من 10 x كولاجيناز حل الأسهم إلى خليط دميم-الأنسجة ودوامه لمزيج.
    ملاحظة: حل الأسهم كولاجيناز 10 ملغ/مل في المتوسط معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي)، ويكون التركيز النهائي في أنبوب 15 مل 1 ملغ/مل.
  4. ضع الأنبوب على شاكر إصدار أو أنبوب المدورة ح 2 في 37 درجة مئوية، كولاجيناز للحط من المصفوفة خارج الخلية.
  5. الطرد المركزي الأنبوب في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في 2 مل من الحارة 0.05% التربسين أدتا تنشق التصاقات خلية خلية والخلية-مصفوفة. نقل الأنبوب إلى 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: إذا قطع الأنسجة كبيرة جداً مزيج جيد، قص طرف الماصة مع شفرة حلاقة لجعل تتحمل أوسع.
  7. تفكيك أي كتل الأنسجة بيبيتينج مع ماصة P1000 8-10 مرات، ثم تكرار مع ماصة P200.
  8. تحييد التربسين مع 3 مل دميم كاملة. إضافة 500 يو من دنيز الأول ومزيج جيد.
  9. تمرير من خلال حقنه 5 مل 5-10 مرات مع إبرة 18 جرام. ثم يمر عبر 5 مرات بإبرة 20 غ.
  10. كرر الخطوات من 4-8 مرة أخرى إذا كان الحل لا يزال يحتوي على أجزاء كبيرة من الأنسجة.
  11. وضع التصفية تعليق خلية من خلال عامل تصفية 40 ميكرومتر في أنبوب 50 مل. شطف الأنبوب 15 مل مع 5 مل دميم وتمر عبر نفس عامل التصفية. كرر الشطف.
  12. تجاهل عامل التصفية والطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على التدفق عبر في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

6-طلاء واستزراع الخلايا

  1. ريسوسبيند بيليه في 0.5 مل من كامل "البروستاتا الظهارية الخلية النمو المتوسطة" (بريجم). حساب كثافة الخلية باستخدام عداد الخلية أو هيموسيتوميتير، وتمييع الخلايا إلى 5 × 105 خلايا/مل في بريجم كاملة.
    ملاحظة: يمكن أن تتراوح الغلة من البروستاتا كلها ماوس عمره 3 أشهر من 3 × 105-106 خلايا. ومن ثم فمن المهم في البداية ريسوسبيند بيليه في لا يزيد عن 0.5 مل بريجم (كما ذكر أعلاه) حيث أن كثافة الخلايا المطلوب يمكن أن يتحقق، حتى مع انخفاض العائد.
  2. ميكس حجم المطلوب من الخلايا التي تحتوي على الغشاء السفلي ECM في نسبة حجم (60% الغشاء ECM و 40% تعليق خلية) 2:3 ولوحة في لوحة متعددة جيدا أو شريحة الدائرة وفقا لاحتياجات التجريبية.
    ملاحظة: إيمونوستينينج، لوحة على ألواح الزجاج السفلي أو شرائح الدائرة، وتغطي كامل جيدا أو الأوسط من البئر. لوحة حول حافة البئر إذا عد أورجانويدس الناجمة عن ذلك، أو لوحة قطرات عدة في جميع أنحاء البئر إذا كان الطلاء أعلى وحدات التخزين. أن تضع في اعتبارها عدم انتشار أنها سميكة جداً أو ضعيفة جداً. لوحة على الأقل 100 ميليلتر خليط خلايا مصفوفة كل 1 سم2 من طلاء المنطقة؛ على سبيل المثال، في شريحة دائرة مع 2 سم2-المساحة جيدا، وينبغي أن يكون مطلي 200 ميليلتر من خليط مصفوفة-الخلية التي تحتوي على 5 × 104 خلايا.
  3. نقل اللوحة/الشريحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2 مدة 30 دقيقة للغشاء ECM ترسيخ. ثم أضف بريجم كاملة المعالجون مسبقاً لتغطية البئر، مع الحرص على عدم تعكير التوصيل الغشاء إدارة المحتوى في المؤسسة.
  4. إزالة نصف من وسائط الإعلام، وإضافة وسائط جديدة كل 2-3 أيام. تنمو الماغنيسيوم لمدة 5-10 أيام.
  5. المضي قدما في الحصاد (الخطوة 7)، إيمونوستاينينج (الخطوة 8)، و/أو التصوير للتطبيقات المتلقين للمعلومات.

7-الحصاد في المجالات

  1. حصاد المجالات، نضح وسائط الإعلام بعناية دون إزعاج التوصيل جل الغشاء إدارة المحتوى في المؤسسة وإضافة 1 مل من محلول ديسباسي 1 ملغ/مل في بريجم الواحد 100 ميليلتر من الغشاء إدارة المحتوى في المؤسسة.
    ملاحظة: أنه من الأسهل لحصاد الماغنيسيوم إذا كانوا هم مطلي في منتصف البئر أو الحافة (بدلاً من تغطية البئر كله)، التأكد من أنه يمكن إضافة كمية كافية من الحل ديسباسي إلى البئر.
  2. كشط الجزء السفلي من اللوحة مع مكشطة خلية رفع قبالة هلام الغشاء ECM في الحل ديسباسي-بريجم.
  3. ماصة الحل الكامل صعودا وهبوطاً مرة واحدة مع مجموعة واسعة تتحمل 1000 ميليلتر ماصة تلميح أو ماصة 5 مل لتفريق المكونات جل إلى أجزاء أصغر.
    ملاحظة: قطع غيض من تلميح ماصة 1000 ميليلتر مع شفرة حلاقة جعل تلميح تتحمل على نطاق واسع.
  4. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ح 1-2 حتى الغشاء ECM قد حلت تماما.
    ملاحظة: هذا يمكن ضمانها بالتفتيش البصري للجزء السفلي جيدا بينما إمالة لوحة للتأكد من أن يظل لا قطع أكثر من جيل.
  5. جمع تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل.
  6. الطرد المركزي المجالات في ز 250 x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ومتابعة طلبات المتلقين للمعلومات.

8-إيمونوستينينج من الميادين13

ملاحظة: بعد قد نمت الماغنيسيوم للمبلغ المطلوب من الوقت، يمكن حله الغشاء إدارة المحتوى في المؤسسة ومجالات يمكن أن تكون الملون كما هو موضح في كوليسينو et al. 13.

  1. بإيجاز، شطف الثقافات مع برنامج تلفزيوني وإضافة 4% بارافورمالدهيد (PFA) مباشرة إلى سد جل الغشاء إدارة المحتوى في المؤسسة. احتضان لمدة 30-90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع المصافحة ببطء، حتى الغشاء ECM تماما يذوب، الاستعاضة عن منهاج عمل جديدة كل 30 دقيقة.
    ملاحظة: سوف تذوب المكونات جل منهاج عمل بيجين وإصلاح الماغنيسيوم أثناء هذه العملية.
  2. وبعد ذلك، يغسل مع برنامج تلفزيوني 3 مرات وإضافة كلوريد الأمونيوم 50 ملم لمدة 10 دقائق إخماد أي أوتوفلوريسسينسي من منهاج عمل بيجين. كرر يغسل 3 مع برنامج تلفزيوني.
  3. بيرميبيليزي مع المنظفات غير الأيونية 0.1% لمدة 5 دقائق وكتلة مع ببسات (برنامج تلفزيوني، جيش صرب البوسنة 1%، 0.5% Triton X-100) لمدة 30 دقيقة.
  4. احتضان مع جسم الأولية في ببسات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، تليها يغسل 3 مع ببسات وجسم ثانوية في ببسات ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
  5. كرر يغسل مع ببسات ووصمة عار مع DAPI وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، إذا رغبت في ذلك. أغسل مرات 3 أو أكثر مع برنامج تلفزيوني.
  6. إضافة برنامج تلفزيوني مع 200 ملم 1، 4-ديازابيسيكلو [2.2.2] أوكتان (دابكو) أنتيفادي كاشف والشروع في التصوير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن التعرف على الفصوص البروستاتا الماوس وتشريح استخدام مواقعها بالنسبة للحويصلات ومجرى البول. البروستاتا الماوس يتكون من 4 أزواج من الفصوص الواقعة دورسالي وبطنيا إلى الحويصلات ومجرى البول. الشكل 4a و 4b (أعلى) إظهار آراء الظهرية والبطني البروستاتا سليمة، جنبا إلى جنب مع الحويصلات ومجرى البول. تظهر لوحات السفلي (الشكل 4 ج ود 4) الفصوص المختلفة المحددة للهوية. يمكن فصل الفصوص من الفئران صغيرات 3 أ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتلخص هذه الورقة طرق تشريح البروستات الماوس وتحديد الهوية من الفصوص الفردية. ووصف أيضا هو بروتوكول لاستزراع خلايا البروستات الماوس في ثقافة 3D للتحليل في المختبر .

خطوة حاسمة في تشريح البروتوكول هو حصاد UGS كامل من الماوس (1) وفصل الأجهزة الفردية تحت مجهر تشريح. أنسجة البروستاتا صغير جداً وتحيط بها بقية UGS؛ وهكذا، فإنه من المستحيل عمليا حصاد الجهاز مباشرة من تجويف الجسم لدى شراء جميع أزواج أربعة من الفصوص سليمة. ومن ثم فمن المهم أن حصاد UGS كامل من الماوس ومن ثم الانتقال لاستخراج الب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل المنحة من المعهد الوطني للسرطان، R01CA161018 إلى LK.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الأدوات الجراحية للفأر (طقم تشريح الفأر)أدوات الدقة العالميةMOUSEKIT
مجهر
RPMI متوسطThermofisher 11875093
العلمي (DMEM + 10٪ FBS)Thermofisher Scientific11965-084
مصل الأبقار الجنينيThermofisher Scientific10438018
PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)17018029 Thermofisher Scientific10010031
كولاجينازThermofisher Scientificاصنع مخزونا 10x (10 مجم / مل) في RPMI ، وتعقيم المرشح ، وتخزينه عند -20 درجة ؛ C
Trypsin-EDTA (0.05٪) ThermofisherScientific25300054
DNase ISigma-Aldrich10104159001  ROCHE
المحاقن والإبرفيشر Scientific
Fisherbran  مصافي الخلايا المعقمة ، 40 مو ؛ مفيشر Scientific22-363-547
PrEGM BulletKit LonzaCC-3166أضف جميع المكونات ، aliquot وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
مصفوفة غشاء MatrigelThermofisher ScientificCB-40234
Dispase II مسحوقThermofisher Scientific17105041صنع مخزون 10x (10 مجم / مل) في PrEGM ، وتعقيم المرشح ، وتخزينه عند -20 درجة ؛ ج
تشريحالوسيط

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
  2. Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111(2009).
  3. Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
  4. Society, A. C. Cancer Facts and Figures. , (2018).
  5. Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).
  6. Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).
  7. Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
  8. Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
  9. Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
  10. Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
  11. Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
  12. Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
  13. Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
  14. Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).
  15. Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. 2011, 895238(2011).
  16. Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26(2012).
  17. Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Prostate LobesProstate Dissection3D Spheroid CultureCell IsolationTissue DigestionBasement MembraneExtracellular MatrixProstate Epithelial CellsOrganoid FormationBeta Catenin Staining

Related Articles