يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ميكروهيموررهاجيس الدماغي شبه الحاد الناجم عن حقن ليبوبوليساكتشاريدي في الفئران

6.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58423

⸱

أكتوبر 17, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Shanxi Medical University, 2Department of Neurology, PLA Army General Hospital, 3Department of Neurology, NO 261 Hospital of PLA

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولا للحث والكشف عن كمهس الناجمة عن لبس حقن الفئران سبراغ داولي، التي قد تكون استخدمت في المستقبل التحقيقات للبحث في الآلية المرضية من كمهس.

الملخص

شائعة في المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين ميكروهيمورهاجيس الدماغي (كمهس) وترتبط بالاضطرابات العصبية المختلفة. مسببات كمهس معقدة، وكثيراً ما يلاحظ neuroinflammation كتواجد المشارك. وهنا، يمكننا وصف شبه حادة نموذج الفئران كمهس الناجم عن حقن lipopolysaccharide (LPS)، فضلا عن أسلوب للكشف عن حقن كمهس. "لبس المنهجي" بسيط نسبيا، واقتصادا، وفعالة من حيث التكلفة. ميزة واحدة كبرى لحقن لبس هو استقرارها للحث على التهاب. كمهس الناجم عن حقن لبس يمكن الكشف عنها بواسطة المراقبة الإجمالية وتوضع وتلطيخ ويوزين (أنه)، بيرل تلطيخ البروسية، إيفانز الأزرق (EB) مزدوجة-وضع العلامات والتصوير بالرنين المغناطيسي-قابلية مرجح التصوير (التصوير بالرنين المغناطيسي-SWI) التكنولوجيا. وأخيراً، تناقش أيضا أساليب أخرى لتطوير نماذج حيوانية كمهس، بما في ذلك مزايا و/أو عيوب، في هذا التقرير.

المقدمة

ميكروهيمورهاجيس الدماغية الكلاسيكية (كمهس) تشير إلى الودائع ارتشاح صغيرة من نواتج انحلال الدم مثل هيموسيديرين من خلايا الدم الحمراء في المخ1. وفقا "دراسة مسح روتردام"، يمكن العثور على كمهس في ما يقرب من 17.8% أشخاص الذين تتراوح أعمارهم بين 60-69 سنة و 38.3 في المائة في تلك ما يزيد على 80 عاماً2. انتشار كمهس في كبار السن مرتفع نسبيا، ووجود علاقة بين تراكم كمهس والإدراكية والنفسية العصبية الخلل ثابتة3،4. العديد من النماذج الحيوانية من كمهس ذكرت في الآونة الأخيرة، بما في ذلك نماذج القوارض الناجم عن النوع الرابع كولاجيناز حقن ستيريوتاكسيك5والتطبيق المعدلة وراثيا6، التعرض β-N-ميثيلامينو-L-ألانين7، و8من ارتفاع ضغط الدم، مع كمهس الناجمة عن الالتهابات الجهازية كواحد من الخيارات الأكثر قبولا جيدا. فيشر وآخرون 9 أول من استخدم لبس المستمدة من typhimurium السالمونيلا إلى وضع نموذج ماوس كمهس حاد. وفي وقت لاحق، أفادت نفس المجموعة تطوير طراز الماوس كمهس شبه حادة باستخدام النهج نفسه2.

ويعتبر لبس كحافز تحريضية موحدة عن طريق حقن داخل. أكدت الدراسات السابقة أن حقن لبس يمكن أن يسبب نيوروينفلاميشن كما يتبين من كميات كبيرة من microglia ونماذج التنشيط أستروسيتي في الحيوان2،10. وعلاوة على ذلك، كان ارتباط إيجابي بين التنشيط لتفعيل نيوروينفلاميشن وعدد كمهس المنشأة2،10. استناداً إلى هذه الدراسات السابقة، نحن كانت تطالب بوضع نموذج فأر كمهس بالحقن داخل للبس.

التقدم في الكشف عن التكنولوجيات قد أدت إلى زيادة في عدد التحقيقات للبحث عن كمهس. الأكثر على نطاق واسع وتشمل أساليب الكشف عن كمهس الكشف عن خلايا الدم الحمراء الهيماتوكسيلين ويوزين (أنه) تلطيخ، كشف الحديديك الحديد قبل Blue البروسية تلطيخ9، الكشف عن إيفانز الأزرق (EB) ترسب من الفلورة التصوير، والتصوير بالرنين المغناطيسي-التعرض المرجحة تسلا 7.0 التصوير (التصوير بالرنين المغناطيسي-SWI)10. وتهدف الدراسة الحالية لتطوير طريقة للكشف عن كمهس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها "العناية بالحيوان" واستخدام اللجنة (ACUC) من المستشفى العام في الجيش جيش التحرير الشعبي الصيني.

1-المواد

  1. التحضير للحقن بلبس
    1. إضافة 25 مل ماء المقطر إلى 25 ملغ مسحوق لبس المستمدة من S. typhimurium بتركيز 1 ملغ/مل نهائي. تخزين الحقن في أنبوب عقيم في 4 درجات مئوية.
      تنبيه: لبس السامة.
    2. إعداد حل المجلس التنفيذي 2% في المحلول الملحي 0.9% العادي لإبقاء EB حقن بتركيز العمل.

2-الحيوانات

  1. إدارة لبس لذكور الفئران سبراغ داولي (SD)، الذين تتراوح أعمارهم بين 10 أسابيع (متوسط الوزن: 280 ± 20 g) بالحقن داخل.
    تنبيه: إذا الفئران يتم شراؤها من منظمة أخرى، ثم مرحلة التكيف ينبغي أن لا تكون أقل من 7 أيام.

3-لبس حقن

  1. حقن لبس إينترابيريتونيلي في كل الفئران بجرعة مقدارها 1 مغ/كغ، والعودة على الفئران إلى القفص المنزل.
    ملاحظة: التخدير غير ضروري.
  2. وبعد ست ساعات حقن جرعة نفس لبس بالحقن في الفئران.
  3. ستة عشر ساعة في وقت لاحق بنفس جرعة لبس حقن الفئران.
    تنبيه: حقن الفئران SD مع لبس عند جرعة مقدارها 1 مغ/كغ قد ينتج بمعدل وفيات 5%. ويمكن زيادة معدل وفيات في الفئران الأصغر أو الأكبر سنا أو إناث الفئران الحوامل.
  4. العودة على الفئران إلى اقفاصها بعد حقن لبس وتقديم إعلانية libitum الحصول على الطعام والشراب.
    ملاحظة: سوف يحمل الفئران استجابة التهابات الجهازية متميزة، وبالتالي فمن الضروري أن تظل الأقفاص نظيفة طوال التجربة. الجرذان ينبغي أن يكون كثيرا ما (يوم 2 x) رصد للوزن والمظهر العام والموقف بعد حقن لبس أول. إذا الفئران ابدأ إلى المعرض موقف متحدب، الرغبة في التحرك، فقدان وزن كبير (> 20%)، البورفيرين تلطيخ أن تكون إنسانية euthanized قبل يوم 7 نقطة نهاية الدراسة EB.

4. جمع العينات

  1. حقن EB
    1. سبعة أيام بعد الحقن الأول، تخدير الفئران التي إينترابيريتونيلي وفقا لبروتوكول IACUC المعتمد الخاص بك.
    2. الانتظار 1-2 دقيقة حتى الفئران لا تظهر الردود منعكس القرنية. أداء مم 5 – 8-ثقب القلب عميقة على كل الفئران؛ وينبغي أن تكون نقطة •اجراء 5 مم إلى الهامش الأيسر من القص في الفضاء إينتيركوستالس الثالثة والرابعة.
    3. الانتظار لحين استرداد الدم ويلاحظ ومن ثم ضخ EB بجرعة 0.2 مل/100 جم من وزن الجسم في البطين الأيسر من القلب.
      تنبيه: ثقب القلب وحقن EB ينبغي إمعان إجراء. قد حقنت EB داخل تجويف الصدر أو تامور بدلاً من البطين الأيسر من القلب.
      1. تمتص مرة أخرى مع أنبوب فارغ واستبدال هذا المجلد مع أنبوب EB قبل الحقن للمساعدة على تقليل معدل الفشل (على سبيل المثال-، الحقن إلى القفص الصدري عن طريق الخطأ).
    4. ابق الفئران في موقف ضعيف لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام عينة للكشف عن التسرب EB في تصوير الفلورة، ثم هذه الخطوة قد تكون محذوفة.
  2. المراقبة الإجمالي
    1. أداء القلب بيرفوسيونس استخدام المثلج م 1 الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS) لمسح المفرج الدماغي والعقول.
      1. استخدام مشرط، جعل شق البطن عبر طول الحاجز.
      2. غادر قطع من خلال الأضلاع فقط من خط الوسط القفص الصدري.
      3. فتح تجويف الصدر. استخدام المشابك لفضح القلب وتسهيل تصريف الدم والسوائل الأخرى.
      4. أثناء الضغط بثبات القلب مع الملقط (لا يزال ينبغي أن يكون ضرب القلب)، مباشرة تأمين إدراج إبرة في بروز البطين الأيسر لتوسيع هذا إلى حوالي 5 ملم. الإبرة في هذا الموضع لقط قرب نقطة الدخول.
        تنبيه: لا تمتد مفرطة الإبرة، كما يمكن اختراق الجدار الداخلية وحل وسط تداول الحلول.
      5. الإفراج عن صمام للسماح بتدفق الجليد برنامج تلفزيوني الحل (200-300 مل) بمعدل بطيء وثابت في حوالي 20 مل/دقيقة باستخدام مضخة التروية. إذا الحيوانات يتطلب التثبيت بدلاً من مراقبة الإجمالي، ثم استخدم نفس جرعة المثلج المحلول الملحي 0.9 في المائة.
      6. باستخدام مقص حاد، جعل شق في الحديقة الشتوية، ضمان أن الحل باستمرار تدفق. إذا كان السائل لا تتدفق بحرية أو قادم من الحيوان في آنفة أو فمه، قم بتغيير موضع الإبرة.
    2. الشاشة كمهس بالمراقبة الإجمالي.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام العينة في حساب عدد كمهس بالمراقبة الإجمالي، ثم هذه الخطوة يمكن إهماله.
  3. التثبيت
    1. أداء القلب بيرفوسيونس استخدام المثلج 0.9% المحلول الملحي (200-300 مل) لمسح المفرج الدماغي والعقول.
    2. أداء القلب بيرفوسيونس استخدام المثلج 4% بارافورمالدهيد للتثبيت.
    3. قطع رأس الفئران، وعزل الدماغ، وتزج في الدماغ في محلول السكروز 20% على الأقل من 6 ح.
    4. تغيير الحل إلى السكروز 30% وإصلاح لآخر ح 6.
  4. إعداد 10 مقاطع أنسجة الدماغ مم سميكة استخدام كريوستات.

5-وقال أنه يلطخ

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء استخدام "أنه يلطخ عدة".

  1. يغسل الشرائح في ماء مقطر.
  2. وصمة عار في الحل توضع على 8 كحد أدنى من المياه والصرف الصحي في تشغيل مياه الحنفية لمدة 5 دقائق.
  3. التفريق في الكحول حمض 1% ليغسل س. 30 في إدارة مياه الحنفية لمدة 1 دقيقة.
  4. وصمة عار في 0.2% الأمونيا المائية (لالتشطيب) أو كربونات الليثيوم المشبعة الحل لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة أغسل في إدارة مياه الحنفية لمدة 5 دقائق.
  5. شطف في الكحول 95% (10 الانخفاضات).
  6. كونتيرستين مع الحل ثم لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة.
  7. يذوي من خلال الكحول 95%، اثنين من التغييرات من الكحول المطلق، لمدة 5 دقائق.
  8. واضح في زيلين نفط لمدة 30 ثانية.
  9. جبل استخدام الأسلوب ليو9.
  10. تحليل استخدام مجهر الأسفار برايتفيلد.
    ملاحظة: تظهر خلايا الدم الحمراء صدر من الأوعية الدموية، وهي مكونات كمهس، في الأحمر-البرتقالي تحت أنه يلطخ.

6-بيرل البروسية الأزرق تلطيخ

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء باستخدام مجموعة "أدوات تلوين بيرلز".

  1. تغسل شرائح مع الماء المقطر.
  2. وصمة عار في حل رد فعل مع خليط أجزاء متساوية فيروسيانيد وحامض الهيدروكلوريك لمدة 10 دقائق.
  3. يذوي وواضحة، وجبل، وتحليل الشرائح كما هو موضح في الخطوات 5.7 – 5.10.

7-EB مزدوجة تلطيخ

ملاحظة: هذا الإجراء يتبع الخطوة 4.1.3.

  1. تغسل شرائح مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
  2. احتضان الشرائح مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) الحل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. يغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني حل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل، وتحميل الشرائح مع الحل والغليسيرول برنامج تلفزيوني.
  4. تحليل الصور على مجهر الأسفار. تتم الإشارة إلى ترسب EB بالأسفار الحمراء؛ يتم الإشارة إلى الأنوية الفلورية الزرقاء.

8-التصوير بالرنين المغناطيسي-مؤسسة الرعاية الاجتماعية

  1. إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي على مغناطيس 7-T مجهزة بنظام تدرج بنشاط محمية (16 سم القطر الداخلي).
  2. سبعة أيام بعد العلاج، تخدير الفئران باستنشاق facemask isoflurane % 1.5 – 2.0 باستخدام نظام تخدير إيسوفلوراني.
  3. تطبيق مرهم البيطرية على عيون الفئران لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  4. الحفاظ على الفئران في موقف المعرضة وإجراء فحص التصوير بالرنين المغناطيسي-مؤسسة الرعاية الاجتماعية.
  5. الحصول على فحص SWI المرجح باستخدام تسلسل صدى سبين سريعة باستخدام المعلمات التالية: صدى الوقت (TE) 8 مللي ثانية، تكرار الوقت (TR) 40 مللي ثانية، والوجه زاوية = 12°، مجال الرؤية (FOV) 35 ملم × 35 ملم، اقتناء مصفوفة 384 × 384، للحصول على 1 مم سميكة شرائح.
  6. تحديد كمهس في التصوير بالرنين المغناطيسي-مؤسسة الرعاية الاجتماعية وفقا غرينبرغ et al. 11، التي تشمل المعايير التالية: (1) يبلغ قطرها مم دي وان زيرو، والبقع (2) دائرية ومعزولة، وإشارة منخفضة الكثافة.
  7. في نهاية التجربة، euthanize على الفئران باستخدام الأسلوب جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون (تدفق 6 لتر في الدقيقة) أو 30 في المائة من حجم الحاوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويمكن الكشف عن كمهس باستخدام نهج مختلف. الأساليب الأكثر قبولا جيدا وتشمل ما يلي: (1) إجمالي المراقبة والتقييم من سطح كمهس (كما هو موضح في الشكل 1، اللوحة العلوية)؛ (2) وتلطيخ للكشف عن خلايا الدم الحمراء (هو مبين في الشكل 2 ألف، اللوحة العلوية) أو البروسية تلطيخ الحديد الحديديك كشف المتأتية من تحلل خلايا الدم الحمراء (الشكل 2A، لوحة أقل)؛ (3) EB تضاعف تلطيخ للكشف عن ترسب EB المستمدة من التسرب BBB (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الدراسات البحثية في كمهس زادت في السنوات القليلة الماضية. ومع ذلك، لا تزال الآلية كمهس غير واضحة، مما دفع العلماء وضع النماذج الحيوانية التي تحاكي هذا الشرط على وجه الخصوص. على سبيل المثال، هوفمان et al. وضع الناجمة عن نقص كمهس ماوس نموذج يوضح أن كمهس هي سبب نقص واضطراب autoregulation المخية12. رويتر et al. 5 إنشاء نموذج كمهس في الفئران المعدلة وراثيا APP23، الذي أظهر أن أنجيوباثي اميلويد الدماغي (الجهاز المركزي للمحاسبات) يلعب دوراً رئيسيا في مسببات كمهس....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونحن نشكر "المعلم جيان فنغ ليو" وزملاؤه من جامعة الطب في العاصمة للتوجيه أثناء التصوير بالرنين المغناطيسي. ونشكر أيضا تسنغ جينغ من قسم الأعصاب، مستشفى من ييتشانغ "الشعب الثانية" لتوفير الدعم التقني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
LPSSigma-AldrichL-2630لتحريض الالتهاب
EBSigma-aldrichE2129للكشف عن تسرب EB
الموت DAPIServicbioG1012عد متوسط ل IF
Perl ' s تلطيخ بروسيةSolarbioG1424Kit للتلوين البروسي
HE تلطيخSolarbioG1120ل HE تلطيخ
هيدرات الكلورSigma-Aldrich47335Uللتخدير
ملحي عازل للفوسفات (PBS)SolarbioP1022نوع من المحلول العازل يشيع استخدامه في تجربة
محلولملحي 0.9٪Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co.، Ltd. ، حل الصينللتروية
بارافورمالدهايدSigma-Aldrich158127نوع من المحلول يشيع استخدامه للتثبيت
محلول السكروز 20٪SolarbioG2461نوع من المحلول يشيع استخدامه للتثبيت
محلول السكروز 30٪SolarbioG2460نوع من المحلول يشيع استخدامه للتثبيت
مرهم بيطريSolcoseryl Eye gel ، Bacel ، سويسرالحماية عيون الفئران
محلول مجموعة محلول

المراجع

  1. Sumbria, R. K., et al. A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds. J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).
  2. Vernooij, M. W., et al. Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study. Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).
  3. Pettersen, J. A., et al. Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study. Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).
  4. Xu, X., et al. Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).
  5. Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).
  6. Reuter, B., et al. Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study. Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).
  7. Scott, L. L., Downing, T. G. A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases. Toxins. 10 (1), E22(2018).
  8. Toth, P., et al. Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection. Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).
  9. Liu, S., et al. Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).
  10. Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).
  11. Greenberg, S. M., et al. Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation. Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).
  12. Hoffmann, A., et al. High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb. Plos One. 11 (2), e0148441(2016).
  13. Sumbria, R. K., et al. Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).
  14. Sumbria, R. K., et al. Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).
  15. Mello, B. S. F., et al. Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression. Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).
  16. Souza, D. F. D., et al. Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).
  17. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  18. El-Sayed, N. S., Bayan, Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).
  19. Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease. Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).
  20. Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).
  21. Rosand, J., et al. Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy. Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).
  22. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  23. Kraft, P., et al. Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease. Plos One. 12 (8), e0182822(2017).
  24. Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model. Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ميكروهيموررهاجيس الدماغي شبه الحاد الناجم عن حقن ليبوبوليساكتشاريدي في الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.