يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تنظيم مسار الإشارات الفطرية النقوي بنشاط باراكاسباسي MALT1

7.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58439

⸱

يناير 7, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Autoimmunity, Transplantation and Inflammation, Novartis Institutes for BioMedical Research

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

MALT1 ينظم الحصانة الفطرية ولكن كيف يحدث هذا وتظل غير محددة. كنا مثبط باراكاسباسي MALT1 انتقائية MLT-827 لكشف مساهمة MALT1 الفطرية مما يشير إلى المتلقين للمعلومات من مستقبلات يكتين مثل مثل عدد القتلى أو نوع ج، مما يدل على أن MALT1 وينظم إنتاج السيتوكينات النقوي، والمتلقين للمعلومات ج-نوع يكتين مثل مستقبلات، بشكل انتقائي.

الملخص

وإلى جانب وظيفته في الخلايا اللمفاوية، وقد عالج العديد من الدراسات، باراكاسباسي MALT1 أيضا دوراً هاما في الخلايا الفطرية المصب مستقبلات التعرف على نمط. أفضل درس من أعضاء الأسرة يكتين مثل مستقبلات ج من نوع ديكتين-1 وديكتين-2 التي تحفز SYK و CARD9-تعتمد على إشارات تتالي مما يؤدي إلى تنشيط NF-κB، بطريقة تعتمد على MALT1. على النقيض من ذلك، مثل عدد القتلى مستقبلات (TLR)، مثل TLR-4، نشر التنشيط NF-κB لكن الإشارات عبر تتالي MYD88/IRAK-تعتمد على. ومع ذلك، ظلت عما إذا كان MALT1 قد تسهم في TLR-4 إشارات غير واضحة. تشير الأدلة الأخيرة مع MLT-827، مثبط قوية والانتقائي للنشاط باراكاسباسي MALT1، إلى أن إنتاج تنف المصب TLR-4 في الخلايا البشرية النقوي مستقلة عن MALT1، بدلاً من إنتاج تنف المصب ديكتين-1، وهو MALT1 يعتمد. هنا، نحن معالجة انتقائية مشاركة MALT1 في التعرف على نمط الاستشعار كذلك، باستخدام مجموعة متنوعة من الإنسان والاستعدادات الخلوية الماوس، والحث على مسارات ديكتين-1، مينكلي أو TLR-4. كما قدمنا أفكاراً إضافية باستكشاف السيتوكينات بعدها تنف-، وعن طريق مقارنة MLT 827 مثبط SYK (Cpd11) ومثبط لايك (AFN700). جماعياً، البيانات المقدمة كذلك الأدلة على MALT1-تبعية مستقبلات يكتين مثل نوع ج – يشير في المقابل إلى إشارات TLR.

المقدمة

نشاط باراكاسباسي MALT1 (المرتبطة بالغشاء المخاطي الأنسجة اللمفاوية سرطان الغدد الليمفاوية إزفاء بروتين 1) قد كشف في 20081،2. ومنذ ذلك الحين، سجلت عددا من الدراسات مساهمتها الحاسمة في مستضد مستقبلات الردود في الخلايا الليمفاوية. نماذج الوراثية في الماوس، فضلا عن دعم بيانات الصيدلة دوراً رئيسيا في خلايا تي تي خلية تعتمد المناعة الذاتية وفي ب-الخلية اللمفاوية إعدادات3،4. في الخلايا الليمفاوية، يحدث التنشيط باراكاسباسي MALT1 لدى الجمعية من CARD11-BCL10-MALT1 مجمع5، التي يتم تشغيلها بواسطة إشارات مستقبلات مستضد الدانية المتلقين للمعلومات من مستقبلات خلية تي أو ب. وهناك أيضا أدلة كثيرة على أن مجمع CARD9-BCL10-MALT1 مماثلة أمر مهم لنشر إشارات المصب ج-نوع يكتين مثل مستقبلات (لشانون)، مثل، ديكتين-1 وديكتين-2 مينكلي في النقوي الخلايا6،7. ديكتين-1 درست جيدا لأن هذا المسار أمر حاسم للمضيف الدفاع ضد الأمراض الفطرية8،9. بيد أن الآثار المترتبة MALT1 في الممرات الشبيهة بحصيلة مستقبلات (TLR)، ظلت مثيرة للجدل10. واستبعد الأدلة الأخيرة في الخلايا البشرية النقوي دوراً مباشرا للنشاط باراكاسباسي MALT1 في تنظيم الإنتاج تنف المصب TLR-411.

في هذا العمل، استخدمنا مختلف إعدادات التجريبية وظروف محفزة في الإنسان وخلايا النقوي الماوس لسبر مسارات الإشارات الفطرية، الاعتماد على مثبطات أداة معينة الدوائي وقياس إنتاج سيتوكين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت التجارب وفقا لمبادئ توجيهية ومعايير "لجنة أخلاقيات البحوث البشرية نوفارتيس".

1-إعداد خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) من المعاطف بافي البشرية

ملاحظة: تلقينا المعاطف بافي من المتطوعين صحية في يوم واحد بعد جمع، في أكياس 50 مل. كانت المقدمة بموجب الموافقة المستنيرة والتي تم جمعها من خلال إينتيريجيونالي بلوتسبيندي شويزيريتشيس Rotes Kreuz. علينا التعامل مع منهم في درجة حرارة الغرفة باستخدام الإجراء أدناه، ما لم يحدد خلاف ذلك.

  1. إعداد زوج معقمة ونظيفة من المقص وكوب 1 لتر مع كيس من بلاستيك (تحت الصفيحة تدفق).
  2. نقل معطف بافي في الكأس وفتحه بعناية مع المقص.
  3. استخدام ماصة 25 مل، إضافة 100 مل حامض الفوسفات مخزنة المالحة المخزن المؤقت/الإيثيلين (برنامج تلفزيوني/يدتا: برنامج تلفزيوني 1 x درجة الحموضة 7.4 تتضمن لا كاكل2 ولا مجكل2، وتستكمل مع 2 مم يدتا pH 8.0).
    ملاحظة: استخدام نفس "الماصة؛" وبعد ببطء بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً، الاستغناء عن 25 مل معطف بافي المخفف إلى 6 أنابيب مخروطية الشكل للطرد المركزي من 50 مل المملوء مسبقاً مع 15 مل تدرج على أساس السكاريد الكثافة.
  4. الطرد المركزي 20 دقيقة في 800 x ز مع تسارع معتدلة (تعيين في 4 من أصل 9) وبدون فرامل للسماح لفصل الخلايا استناداً إلى هذه الكثافة.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي، ستكون ثلاث طبقات مرئية؛ بيليه الذي يحتوي على خلايا الدم الحمراء والمحببة، طبقة العليا من البلازما، والفترات الفاصلة بين عصابة بيضاء تحتوي على خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس).
  5. حصاد الحلبة ببمك باستخدام الماصة 10 مل ونقل إلى أنابيب 50 مل جديدة.
    ملاحظة: اثنين إلى ثلاثة أنابيب 50 مل مطلوبة عادة كل معطف بافي قاتلة. في هذه المرحلة، يلوث بعض البلازما المحتمل ببمكس التي تم جمعها، الذي ينبغي أن يكون له تأثير على الخطوات اللاحقة في تخصيب اليورانيوم.
  6. أعلى يصل إلى 50 مل كل أنبوب باستخدام برنامج تلفزيوني/يدتا والمضي قدما ليغسل المتعاقبة الثلاث مع تناقص وقت الطرد المركزي والسرعة (15 دقيقة في 520 x g, 10 دقيقة في 330 x ز, 8 دقيقة في 150 س ز).
    ملاحظة: في كل خطوة، سكب المادة طافية قبالة في حاوية نفايات سائلة وهو حراكه بيليه الخلية في 50 مل من برنامج تلفزيوني/يدتا (قد يكون تجميع الكريات بعد الغسيل الأولى).
  7. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند بيليه في 25 مل مخزن مؤقت لتحلل المثلج (انظر الجدول للمواد) خلايا الدم الحمراء بالضغط الاسموزي.
  8. احتضان حتى يصبح الحل واضح (دي فايف دقيقة في درجة حرارة الغرفة).
  9. وقف رد الفعل بإضافة 25 مل من فصل المخزن المؤقت (PBS 1 x درجة الحموضة 7.4 تتضمن لا كاكل2 ولا مجكل2، وتستكمل مع 2% غير نشط الحرارة الجنين البقري المصل (FBS) و 1 مم يدتا pH 8.0).
  10. أغسل مرة أخرى في 150 x ز لمدة 8 دقائق.
    ملاحظة: في هذه المرحلة يمكن استخدام ببمكس كعدد سكان الأكبر (راجع الخطوة 3: العلاج ببمكس ووحيدات وظروف تنشيطية) أو تجهيزها لإثراء الوحيدات (راجع الخطوة 2: إعداد وحيدات من ببمكس)، أو المجمدة إلى أسفل للاستخدام اللاحق (راجع الخطوة 5: وحيدات وإجراءات تجميد/ذوبان ببمكس).

2-إعداد وحيدات من ببمكس

  1. ريسوسبيند ببمكس التي تم الحصول عليها في الخطوة 1، 10 في المخزن المؤقت للانفصال والاعتماد عليها تصل إلى 5 × 107خلايا/مل.
  2. نقل تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي مخروطية مل 14 مع غطاء.
  3. إضافة 50 ميليلتر من الوحيدات تخصيب جسم كوكتيل كل مل تعليق خلية، الدوامة، واحتضان 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  4. إضافة 50 ميليلتر من الوحيدات تخصيب حبات الواحد مل خلايا.
    ملاحظة: يجب أن يكون الخرز جيدا فورتيكسيد لضمان التجانس للتعليق.
  5. بعد إضافة الخرز، قريبا من دوامة تعليق خلية واحتضان 5 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. شطف الجزء العلوي من الأنبوب مع فصل المخزن المؤقت حتى يتم ملء الأنبوب تصل إلى 10 مل.
  7. مزيج الحل ببطء من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  8. ضع الأنبوب دون سقف في فصل مغناطيس.
  9. احتضانها ل 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. صب ببطء في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل.
  11. في هذه المرحلة، استخدم وحيدات مباشرة (راجع الخطوة 3: العلاج ببمكس ووحيدات وظروف تنشيطية) أو تمييزها في أناماتور موالمستمدة من نوسيتي داندريتيك جخبرنيs (إيمودكس) (راجع الخطوة 4)، أو تجميدها لأسفل للاستخدام اللاحق (راجع الخطوة 5).

3-ببمكس وعلاجات وحيدات وظروف تنشيطية

  1. عد الخلايا وتمييع لهم في الثقافة المتوسطة (روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) 10% FBS 1 مم بيروفات صوديوم + + + U/mL 100 البنسلين والستربتوميسين (القلم/بكتيريا) β-mercaptoethanol 5 ميكرومتر)، وصولاً إلى 1.25 × 104 خلايا/جيدا.
  2. توزيع 30 ميليلتر من تعليق الخلية الواحدة من صفيحة 384-جيدا جيدا.
  3. إضافة 15 ميليلتر من 4 × حلول مجمع مركزة واحتضان مسبقاً ح 1 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  4. إضافة lipopolysaccharide (LPS) بتركيز نهائي 10 نانوغرام/مل، أو المنضب زيموسان (DZ) بتركيز نهائي من 100 ميكروغرام/مل، أو تبقى في المتوسط العادي.
  5. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  6. تأخذ 10 ميليلتر من المادة طافية لقياس مستويات يفرز تنف-أ (راجع الخطوة 7: قياسات السيتوكينات وقابليتها للبقاء).

4-وحيدات التمايز في إيمودكس و "ظروف تنشيطية"

  1. عد وحيدات (التخصيب في الخطوة 2) والطرد المركزي من تعليق خلية في 520 x ز لمدة 5 دقائق.
  2. "الماصة؛" إيقاف المادة طافية وإضافة الثقافة المتوسطة (ربمي + 10% FBS للحصول على تعليق خلية نهائي 0.4 × 106 خلايا/مل.
  3. إضافة 80 نانوغرام/مليلتر الماشوب البشري إيل-4 + 100 نانوغرام/مليلتر GM-CSF.
  4. الاستغناء عن 5 مل تعليق الخلية الواحدة وكذلك في لوحة 6-جيدا.
  5. احتضان لمدة 7 أيام في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  6. في يوم 7، حصاد الخلايا التي بيبيتينج برفق لتجنب من التفعيل.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 520 x ز لمدة 5 دقائق.
  8. فراغ أسبيراتي وريسوسبيند في 50 مل من الثقافة المتوسطة دون عوامل النمو.
  9. الطرد المركزي في 520 x ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في 1 × 106 خلايا/مل في الثقافة المتوسطة.
  10. الاستغناء عن 100 ميليلتر من تعليق خلية (خلايا5 10) كل من لوحة مسطحة 96-بئر القاع جيدا.
  11. إينكوباتي مسبقاً ح 1 في 37 درجة مئوية بعد إضافة 50 ميليلتر 4 x تتركز الحلول المركبة، إعداد كما هو موضح في الخطوة 8: إعداد المركبات.
  12. إضافة 50 ميليلتر من المحفزات (4 x تتركز)، إعداد كما هو موضح في الخطوة رقم 9.
  13. احتضان 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  14. مزيج كل بئر ونقل الخلايا والمادة طافية (SN) في لوحة الخامس-أسفل 96-جيدا.
  15. زيادة ونقصان لأسفل في 475 x ز لمدة 5 دقائق.
  16. نقل المادة طافية في لوحة أسفل شقة 96-بئر جديدة وختم وتجميد في-20 درجة مئوية إلى استخدامها مرة أخرى.

5-وحيدات وإجراءات تجميد/ذوبان الجليد ببمكس

  1. تجميد
    1. تدور أسفل ببمك أو الوحيدات الخلية الأعمال التحضيرية على 520 x ز لمدة 5 دقائق.
    2. الفراغ نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في تجميد المتوسطة في 1 × 107 خلايا/مل.
    3. الاستغناء عن 1 مل تعليق خلية في كريوتوبيس، ونقل الأنابيب إلى جهاز تبريد محددة (انظر الجدول المواد) ووضعه في-80 درجة مئوية.
  2. ذوبان الجليد
    1. ذوبان الجليد في كريوتوبي وسرعة نقل محتواه في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل تحتوي على 9 مل من الثقافة المتوسطة.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 520 x ز لمدة 5 دقائق.
    3. أسبيراتي فراغ طافية وبيليه الخلية ريسوسبيند في 5 مل من الثقافة المتوسطة. خلايا جاهزة الآن لمواصلة معالجة تجريبية.

6-خلايا الطحال الماوس الإعداد والمعالجة

ملاحظة: وقد أجرينا التضحيات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية والمعايير "منظمة رعاية الحيوان نوفارتيس". الدراسات كانت وافقت لجنة الأخلاقيات التابعة للهيئة الحكومية الدولية الإقليمية (بازل شتات der Veterinäramt كانتوناليس). نحن التضحية الحيوانات isoflurane التعرض المفرط، مع جميع الجهود المبذولة للتقليل من المعاناة.

  1. حصاد الطحال وننأى بالانسجة باستخدام أنبوب مزودة بجهاز طاحونة أنسجة ميكانيكية وشغلها مع 5 مل من البرد ربمي المتوسطة.
  2. استخدام برنامج الطحال الجهاز تفكك لطحن الأجهزة.
  3. تصفية الخلايا عن طريق مصفاة خلية نايلون 100 مم.
  4. نقل التعليق في أنابيب 50 مل والطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 320 x ز.
  5. أسبيراتي فراغ المادة طافية، ريسوسبيند بيليه الخلية في 3 مل من المخزن المؤقت لتحلل المثلج، واحتضان لمدة دقيقة دي تو على الجليد.
  6. إيقاف تحلل بإضافة 7 مل متوسطة ربمي.
  7. تصفية مرة أخرى من خلال مصفاة خلية نايلون 100 ميكرومتر.
  8. تدور أسفل تعليق خلية في 330 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  9. فراغ أسبيراتي المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 11 × 106 خلايا/مل في المتوسط كاملة (RPMI تستكمل مع 10% FBS والقلم يو/مليلتر 100/الخطوة 5 ميكرومتر β-ميركابتوثانول).
  10. لوحة 1 × 106 خلايا/بئر (90 ميليلتر) في لوحة 96-جيدا (مسطحة القاع).
  11. إضافة 5 ميليلتر من 20 x تتركز حل مركب تمييع سابقا في المتوسط ربمي كما هو موضح في الخطوة 8.3: تمييع المسلسل لخلايا الطحال مورين.
  12. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2.
  13. إضافة 5 ميليلتر من 20 x تتركز DZ (التركيز النهائي 30 ميكروغرام/مل) أو 20 x تتركز لبس + IFN-ز (TLR-4) (تركيز النهائي 1 ميكرومتر لبس و 10 نانوغرام/مل IFN-ز).
  14. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  15. أجهزة الطرد المركزي في 330 x ز لمدة 10 دقائق.
  16. نقل سوبيرناتانتس في اللوحات الجديدة، وختم وتجميد في-20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

7-السيتوكينات ومقاييس السلامة

  1. البشرية تنف القياس هترف (Fluorescence حل الوقت متجانسة)
    ملاحظة: البروتوكول يتبع توصيات المورد، بإيجاز أدناه.
    1. 1 ميكس حجم الكاشف المعاد تشكيلها (مكافحة تنف كريبتاتي ومكافحة تنف في XL665) مع 19 حجم المخزن المؤقت لإعادة تشكيل (50 مم الفوسفات المخزن المؤقت pH 7.0، فلوريد البوتاسيوم 0.8 متر (KF)، 0.2% ألبومين المصل البقري (BSA)).
    2. مزيج من الحلين الأجسام المضادة جاهزة للاستخدام 1:1 قبل صرفها الكواشف.
    3. الاستغناء عن 10 ميليلتر من سوبيرناتانتس من الخطوة 3.6 إلى الأبيض 384-جيدا لوحات.
    4. الاستغناء عن 10 ميليلتر لمزيج الأجسام المضادة.
    5. تغطية اللوحة مع السدادة واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    6. قراءة لوحة على قارئ ميكروسكوبية (فلاش 50 – 200).
  2. قياس إيل-23 البشرية قبل هترف (Fluorescence حل الوقت متجانسة)
    ملاحظة: البروتوكول يتبع توصيات المورد، بإيجاز أدناه.
    1. مزيج واحد حجم الكاشف المعاد تشكيلها (مكافحة إيل-23-كريبتاتي-الأجسام المضادة ومكافحة--إيل-23 الضد D2) مع وحدات التخزين 19 من الكشف عن المخزن المؤقت #3.
    2. مزيج من الحلين الأجسام المضادة جاهزة للاستخدام 1:1 قبل صرفها الكواشف.
    3. الاستغناء عن 10 ميليلتر من سوبيرناتانتس من الخطوة 3.6 إلى الأبيض 384-جيدا لوحات.
    4. الاستغناء عن 10 ميليلتر لمزيج الأجسام المضادة.
    5. تغطية اللوحة مع السدادة واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    6. قراءة لوحة على قارئ ميكروسكوبية (50-200 نانومتر فلاش).
  3. البشرية إيل-6، 8 إيل وايل-1β وقياسات تنف-α بواسطة اليكتروتشيميلومينيسسينسي
    ملاحظة: جميع العينات كانت مخففة في 1/150 في مادة 2 (تمييع الأولى: 10 ميليلتر في 150 ميليلتر، ثم 20 ميليلتر في ميليلتر 180). البروتوكول يتبع توصيات المورد:
    1. تضعف من عينات والموحدة في مادة 2.
    2. المضي قدما إلى إضعاف المعيار في مادة 2 استخدام إضعاف إضعاف مسلسل 1/4.
    3. غسل الأطباق ثلاث مرات مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
    4. الاستغناء عن 50 ميليلتر من عينات أو معيار كل بئر.
    5. احتضانها ح 2 في درجة حرارة الغرفة تحت التحريض.
    6. أغسل لوحة أربع مرات مع برنامج تلفزيوني + 0.05% بوليسوربيت 20.
    7. إضافة 25 ميليلتر للكشف عن الأجسام المضادة (60 ميليلتر من كل جسم للنهائي 3 مل) في مادة 3.
    8. احتضانها ح 2 في درجة حرارة الغرفة تحت التحريض.
    9. أغسل لوحة أربع مرات مع برنامج تلفزيوني + 0.05% بوليسوربيت 20.
    10. تجنب فقاعات، إضافة 150 ميليلتر كل بئر من المخزن المؤقت للقراءة (على أساس تريس المخزن المؤقت الذي يحتوي على تريبروبيلاميني، تضعف x 2 في ddH20) مادة التفاعل المشترك لتوليد الضوء في تحديدكم اليكتروتشيميلومينيسسينسي.
    11. قراءة اللوحة (بدون تأخير) على قارئ لوحة متعدد.
  4. ماوس تنف القياس بإليزا بعد البروتوكول المورد
    1. تمييع المادة طافية 1:1 في مقايسة مخفف (جاهزة للاستخدام تحتوي على البروتين المخزن المؤقت).
      1. إعداد الكواشف وعينات، وتخفيف القياسية كما هو موضح في هذه المجموعة. إضافة 50 ميكروليتر من تحليل مادة لكل بئر.
      2. إضافة 50 ميكروليتر من المعيار، أو السيطرة، أو العينة الواحدة وكذلك.
    2. المزيج بلطف التنصت على الإطار لوحة لمدة 1 دقيقة.
    3. تغطية قطاع لاصقة المقدمة واحتضانها ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
    4. نضح كل جيدا ويغسل مع 400 ميكروليتر/البئر (كرر هذه الخطوة خمس مرات في المجموع).
    5. بعد الغسيل النهائي، إزالة أي العازلة غسيل المتبقية بواسطة يسفط.
    6. عكس اللوحة ولطخة ضد مناشف ورقية نظيفة.
    7. إضافة 100 ميكروليتر من الماوس تنف-α المتقارن لكل بئر. وتغطي بشريط لاصق جديد.
    8. احتضانها ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
    9. كرر التطلع/الغسيل كما هو الحال في الخطوة 7.4.4.
    10. إضافة 100 ميكروليتر من الركازة الحل لكل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
    11. إضافة 100 ميكروليتر من حمض الهيدروكلوريك المخفف (إيقاف الحل) لكل بئر. اضغط برفق لوحة لضمان خلط دقيق.
    12. قياس الكثافة الضوئية في 450 نانومتر (مع الطول الموجي تصحيح مبلغ 560 نانومتر) باستخدام قارئ ميكروسكوبية (إلى القيام بذلك في 30 دقيقة).
  5. بقاء الخلية
    1. بعد إزالة سوبيرناتانتس من الاستعدادات PBMC أو الوحيدات، تقييم إمكانية بقاء الخلية استخدام جهاز على استعداد لاستخدام ريسازورين الحل (مؤشر الأكسدة والاختزال) أضيف مباشرة إلى تعليق الخلية بتركيز نهائي 10%.
    2. احتضانها ح 1 إلى 2 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
    3. قراءة الأسفار في 590 نانومتر (540 الإثارة nm) باستخدام قارئ ميكروسكوبية.

8-مجمع إعداد

  1. تمييع المسلسل إيمودكس
    1. تمييع الحل MLT 827 الأسهم (10 ملم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في المتوسط تصل إلى 8 ميكرومتر في دفعة واحدة (4 x مركزة).
    2. إجراء ستة-الخطوة 1:5 إضعاف مسلسل، باستخدام متوسط + 0.08 في المائة [دمس]. استخدام نفس المتوسطة + 0.08 في المائة [دمس] حل لحالة مركبة (لا مركب).
  2. جرعة وحيدة اختبار إيمودكس
    1. تمييع الحلول الأسهم MLT-827، و AFN700، و Cpd11 في المتوسط للوصول إلى 4 ميكرومتر في دفعة واحدة (4 x مركزة).
  3. تمييع المسلسل لخلايا الطحال مورين
    1. تمييع حل MLT 827 10 ميكرون (التي تم الحصول عليها من حل أسهم 10 ملم بعد إضعاف الذهاب واحد في المتوسط) إلى 0.01 ميكرومتر، مع تركيز 0.1% نهاية [دمس].
    2. خطوات تمييع، تأخذ 2 ميليلتر من كل تمييع، إضافة 38 ميليلتر ربمي، وبيبيت 5 ميليلتر في البئر.
      ملاحظة: وتجري جميع العلاجات في ثلاث نسخ.

9-محفزات إعداد

  1. زيموسان المستنفد (DZ)
    1. إضافة 2 مل الماء المعقم خالية من الذيفان إلى 10 مغ من dz.
    2. دوامة مجانسة الحل الأسهم، دوامة المسبقة أيضا كل استعمال.
    3. الكوة مختبرين الحل ومخزن في-20 درجة مئوية.
  2. تريهالوسي--6.6-ديبيهيناتي (مجلس التجارة والتنمية)
    1. إضافة 100 ميليلتر من [دمس] إلى 1 مغ مجلس التجارة والتنمية، الحرارة عند 60 درجة مئوية في حمام مائي ل 15 – 30 ثانية.
    2. دوامة وإضافة 900 ميليلتر من برنامج تلفزيوني العقيمة، دوامة مرة أخرى فورا.
    3. الحرارة لمدة 10 – 15 دقيقة في 60 درجة مئوية ومجانسة فورتيكسينج قبل كل استعمال.
    4. يبقى الحل في 4 درجات مئوية.
    5. إجراء تخفيف المسلسل وإعداد جرعة واحدة أما بالنسبة للمجمع MLT-827.
      ملاحظة: لمجلس التجارة والتنمية يحتاج إلى أن يكون أعدت في [دمس]، تركيز [دمس] 1% نهائي حاضرا أثناء تنشيط الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في الخلايا النقوي، التبديلات MALT1 إشارات التنشيط المصب عدة مستقبلات يكتين مثل ج-نوع، مثل ديكتين-1 وديكتين-2 مينكلي6. هذه المسارات تعتمد على المستقبلات المحتوية على عزر (هيم) أيتام (مثل، ديكتين-1) أو أيتام المحتوية على فكرة مستقبلات المشارك (مثل، FcRγ، ديكتين-2 ومينكلي) أن تجنيد وتفعيل كيناز SYK (الشكل 1). وهذا يؤدي إلى تنشيط البروتين كيناز ج isoform، إلا وهي PKCδ، الذي فوسفوريلاتيس CARD9، مما تسبب في تشكيل معقدة CARD...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا العمل، استخدمنا إعدادات تجريبي بسيط لدراسة مسارات إشارات في الإنسان والماوس الخلايا الفطرية، واستجواب الاعتماد على وظيفة بروتيوليتيك MALT1. التوسع في العمل السابق11، أظهرت الدراسة أن يتحكم MALT1 باراكاسباسي نشاط إنتاج سيتوكين مستقبلات يكتين مثل التي يسببها ج-نوع، بما في ذلك تنف-α. في المقابل، كان 4 المستحثة TLR تنف-α مستقلة عن MALT1 في كل الأنواع. مجتمعة، هذه البيانات إثبات مساهمة أساسية وانتقائية MALT1/بناء الثقة سيجنالوسومي المصب مستقبلات يكتين مثل نوع ج، التي تم كشف النقاب عن سابق الدراس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونحن نشكر السفير على تصريح (ترخيص رقم 4334770630127) استنساخ هنا الشكل 2 ألف من أونتيرينير et al. (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 وميكرو ؛ م مصفاة خلية النايلونسيجماCLS431752
14 مل أنبوب فالكونBD فالكون352057
15 مل أنبوب فالكونفالكون352090
50 مل أنبوب فالكون352070
6 ألواح آباركوستار3516
96 لوح مسطح القاع جيدا ، مع غطاء تبخر منخفضكوستار3595
96 بئر V-bottom لوحةكوستار734-1798
كلوريد الأمونيوم - NH4< / sub>ClSigmaA9434
مخفف الفحص RD1-W ELISAR & D895038مخفف
صفيحة دقيقة لثقافة الخلايا ، 384 بئر ، أسودGreiner781986
مستنفد ZymosanInvivogentlrl-dznالآن: tlrl-zyd
ثنائي ميثيل سلفوكسيدSigmaD2650DMSO
EDTA-Na 2< / sub>SigmaE5134حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ثنائي الصوديوم ملح ثنائي الهيدرات
ELISA muTNF- &R & DSMTA00
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
gentleMACS C tubesMACS Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS dissociatorMACS Miltenyi Biotec130-093-235
GM-CSFNovartis-Heat-Tearated
Fetal Fibro SerumGibco10082FBS
HTRF هو IL-23CisBio62HIL23PEG
HTRF في TNF- & ألفا ؛CisBio62TNFPEC
HTRF إعادة تشكيل المخزنCisBio62RB3RDE50mM عازلة الفوسفات, درجة الحموضة 7.0, 0.8M KF, 0.2٪ BSA
IFN-γR & DL4516
IL-4Novartis-Isoflurane
AbbottForene
Liposaccharides (LPS)SigmaL4391LPS المستخدمة في العينات البشرية
عديدات السكاريد الدهنيةSigmaL4516LPS المستخدمة في عينات الفئران
محلول التحللعصاميالصنع155 ملي مولار NH4Cl ، 10 ملي مولار KHCO3 ، 1 ملي مولار EDTA ، درجة الحموضة 7.4
MagnetStemcell18001
Microplate ، 384 مجموعةGreiner784075
Monocytesجيدا Stemcell19059
Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 & deg ؛ C حاوية التجميدNalgene5100-0001(يحتوي على Propanol-2)
PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl 2< / sub > [-] MgCl 2< / sub>Gibco10010ملحي مخزن بالفوسفات
Penicillin / StreptomycinGibco15140بيكربونات البوتاسيوم القلم / البكتيريا العقدية
- KHCO3< / sub>SigmaP9144
محلول PrestoBlueInvitrogenA13262Resazurin لتقييم الجدوى
Propanol-2Merck1.09634
قراءة المخزن المؤقتMesoScale DiscoveryR92TC-3المخزن المؤقت القائم على Tris يحتوي على ثلاثي بروبيلأمين
وسط تجميد ثقافة الخلاياجيبكو12648-010وسط التجميد
معهد روزويل بارك التذكاري المتوسط (RPMI) مع GlutamaxGibco61870+ 10٪ FBS ل iMoDCs
+ 10٪ FBS + 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم + 100 U / مل قلم / بكتيريا + 5 & micro ؛ M & beta ؛ ميركابتو إيثانول ل PBMCs البشرية والخلايا الوحيدة
+ 10٪ FBS + قلم / بكتيريا + 5 & micro ؛ M & beta ؛ -mercaptoethanol لخلايا الطحال الفئران
الفصل عازلةفصل ذاتية الصنع-PBS درجة الحموضة 7.4 + 2٪ FBS + 1 ملي مولار EDTA درجة الحموضة 8.0
بيروفات الصوديومجيبكو11360
تريهالوز -6،6-ديبيهيناتإنفيفوجينtlrl-tdbTDB
توين 20سيجماP7949بولي سوربات 20
فائق النقاء 0.5 م EDTA درجة الحموضة 8.0Invitrogen15675حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك
Viewseal مانع التسربGreiner BioOne676070
V-PLEX لوحة الالتهابات 1 مجموعة HumanMesoScale DiscoveryK15049Dمقايسة متعددة الإرسال الكهروكيميائية (IL-1 & beta ؛ TNF- & alpha ؛ IL-6 ، IL-8)
& بيتا ؛ ميركابتو إيثانولجيبكو31350
فالكون فحص المؤقت تخصيب بيضاء جهاز تبريد محلول

المراجع

  1. Coornaert, B., et al. T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20. Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).
  2. Rebeaud, F., et al. The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation. Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).
  3. Jaworski, M., Thome, M. The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).
  4. Meininger, I., Krappmann, D. Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome. Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).
  5. Qiao, Q., et al. Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly. Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).
  6. Gross, O., et al. Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity. Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).
  7. Chiffoleau, E. C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets. Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
  8. Taylor, P. R., et al. Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection. Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).
  9. Lanternier, F., et al. Primary immunodeficiencies underlying fungal infections. Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).
  10. Thome, M. Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation. Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).
  11. Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-α production downstream of TLR-4 in myeloid cells. Immunology Letters. , 48-51 (2017).
  12. Strasser, D., et al. Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-δ to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity. Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).
  13. Jaworski, M., et al. Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity. The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).
  14. Yu, J. W., et al. MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses. PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).
  15. Bardet, M., et al. The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition. Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).
  16. Thoma, G., et al. Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).
  17. Bauer, B., Steinle, A. HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch. Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).
  18. Gringhuis, S. I., et al. Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2. PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).
  19. Dufner, A., Schamel, W. W. B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model. Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6(2011).
  20. Phelan, J. D., et al. A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma. Nature. , In press (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مسار Dectin-1تأشير TLR-4مثبط SYK Cpd11مثبط IKK AFN700مركب MLT-827الخلايا الوحيدة النواتية في الدم المحيطيقياس TNF Alphaبروتوكول التخفيف المتسلسل
تنظيم مسار الإشارات الفطرية النقوي بنشاط باراكاسباسي MALT1
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.