البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا للشاشة البروتين خارج الخلية [ميكروارس] للتعرف على التفاعلات رواية مستقبلات-يجند في إنتاجية عالية. كما يصف لنا طريقة لتحسين الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين عابر باستخدام مجمعات البروتين-ميكروبيد.

Abstract

يفرز عوامل ومستقبلات غشاء المربوطة وشركائها المتفاعلة الهيئات التنظيمية الرئيسية للاتصالات الخلوية والشروع في إشارات الشلالات خلال التوازن والمرض، وعلى هذا النحو تمثل الأهداف العلاجية الرئيسية. وعلى الرغم من أهميتها، تظل هذه الشبكات التفاعل الممثلة تمثيلاً ناقصاً إلى حد كبير في قواعد البيانات الحالية؛ ولذلك، يكون معظم البروتينات خارج الخلية لا شريك ملزمة موثقة. هذا التناقض يرجع أساسا إلى التحديات المرتبطة بدراسة البروتينات خارج الخلية، بما في ذلك التعبير عن البروتينات الوظيفية، وتقارب ضعف، وانخفاض، تفاعلات البروتين التي كثيرا ما تنشأ بين مستقبلات سطح الخلية. والغرض من هذا الأسلوب وصف طباعة مكتبة بروتينات خارج الخلية بتنسيق ميكرواري للفرز لتفاعلات البروتين البروتين. لتمكين الكشف عن التفاعلات الضعيفة، ويرد وصف أسلوب يقوم على مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام قيد الدراسة. بالإضافة إلى هذا النهج القائم على ميكروبيد مولتيميريزيشن لزيادة مولتيفالينسي، ميكرواري البروتين يتيح الكشف عن قوي لتفاعلات البروتين البروتين عابر في إنتاجية عالية. ويوفر هذا الأسلوب عينة السريع وانخفاض استهلاك--نهجاً للتعرف على التفاعلات الجديدة تنطبق على أي البروتين خارج الخلية. ويرد وصف البروتين ميكرواري الطباعة والفرز بالبروتوكول. هذه التقنية ستكون مفيدة للمحققين التماس وسيلة قوية لاكتشاف تفاعلات البروتين في الفضاء خارج الخلية.

Introduction

ويصف الأسلوب الذي استعرض هنا طباعة مجموعة من البروتينات خارج الخلية في تنسيق ميكرواري، تليها طريقة لفحص هدفا لمصلحة ضد هذه المكتبة. لقد حددنا مولتيميريزيشن البروتين كخطوة حاسمة للكشف عن التفاعلات التي تتميز بالصلات ملزمة منخفضة. تعزيز الكشف عن هذه التفاعلات، يصف لنا بروتوكول استناداً إلى مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام من اهتمام باستخدام ميكروبيدس.

يفرز والمنظمين الرئيسيين للاتصالات الخلوية والإشارات والتفاعل مع المكروية الخلية أعرب عن سطح البروتينات (يطلق عليها مجتمعة البروتينات خارج الخلية) جنبا إلى جنب مع شركائها في التفاعل. ولذلك، أنها ضرورية في تنظيم الكثير من العمليات الفسيولوجية والمرضية. تقريبا ربع المجين البشري (إيتش فايف، 000 الب....

Protocol

1-جيل مكتبة بروتينات البشرية خارج الخلية

1. تجميع قائمة من مستقبلات سطح الخلية أو البروتينات يفرز من الفائدة لبناء المكتبة ميكرواري البروتين. الأسر البروتين محددة (على سبيل المثال، فوق عائلة الغلوبولين المناعي) أو البروتينات أعربت بشكل انتقائي وبخاصة الخلية يمكن تحديد أنواع للدراسة.
2. لمستقبلات الخلية السطحية، تحديد حدود المجال خارج الخلية (النماء) بتحديد إشارة هضميد ومناطق ترانسميمبراني باستخدام أدوات البرمجيات. بعض ذات الصلة أدوات، متاحة مجاناً على الإنترنت، ويتم الرجوع إليها في الجدول للمواد^15،16،،من¹⁷¹⁸.

Results

ويرد في الشكل 1تخطيطي لسير العمل للتكنولوجيا ميكرواري البروتين خارج الخلية. حالما تتوفر ميكرواري الشرائح التي تحتوي على مكتبة البروتين خارج الخلية، يمكن إكمال فحص البروتين الفائدة وتحليل البيانات خلال يوم واحد. العديد من التفاعلات الفيزيولوجية الصلة بين جزءا لا يتجزأ من الغشاء مستقبلات تتسم بالقوة الملزمة ضعيفة جداً (ك_د في نطاق micromolar). ووضعت لتحسين الكشف عن مثل هذه التفاعلات، أسلوب يستند إلى استعلام البروتين (معبراً عنها كالانصهار Fc) مولتيمير.......

Discussion

يظل عدد كبير من مستقبلات اليتيمة في الجينوم البشري، ويواصل الشركاء المتفاعلة رواية الخروج للبروتينات خارج الخلية مع يغاندس تتسم سابقا. تحديد التفاعلات مستقبلات-يجند في الإنسان والكائنات نموذج أمر ضروري لفهم الآليات التي تملي الاتصالات الخلوية أثناء التوازن، فضلا عن التقلبات التي تؤدي إلى المرض، وذلك إبلاغ جديدة أو محسنة الخيارات العلاجية. ومع ذلك، الكشف عن تفاعلات البروتين خارج الخلية بالتكنولوجيات المستخدمة على نطاق واسع تمثل حاجزاً كبيرا أساسا بسبب التحديات التقنية المرتبطة بالكيمياء الحيوية المستقبلات الخلوية وشركائها.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra Pure MB Grade glycerol	USB Corporation	56-81-5	تخزين البروتين
SeptoMark حجب العازلة	Zeptosens	BB1 ، 90-40	حجب شرائح المصفوفات الدقيقة العازلة
الألبومين مصل البقر	Roche	03-117-957-001	التحكم في الشرائح لتركيب القناع (اختياري)
ألواح البولي بروبيلين متعددة الآبار	Greiner Bio One	82050-678	الآبار لتخزين البروتين
	Arrayit	MMP384	طباعة الشرائح
NanoPrint LM60 ، أو جهة اتصال مماثلة microarrayer	Arrayit	NanoPrint LM60 ، أو ما شابه ذلك من microarrayer الاتصال	طباعة الشرائح
دبابيس الإكتشاف الدقيقة	Arrayit	دبابيس الإكتشاف	الدقيقة طباعة الشرائح
محطة حجب ZeptoFOG	ZeptoFOG	محطة حجب ZeptoFOG ، 1210	شريحة كتلة بعد طباعة
مسحوق الحليب الخالي من الدسم	محلول حجب
Thermo Fisher LP0031شريحة زجاجية مطلية بالإيبوكسي سيلان	Nextrion Slide E	1064016	Microarray شرائح حامل
زجاجي ومجموعة رف	منزلق Wheaton	900303	Slide Storage
Cy5 صبغة أحادية التفاعل	GE Healthcare	PA23031	Albumin
Cy5 صبغة أحادية التفاعل	GE Healthcare	PA25001	Human IgG وضع العلامات
على عمود تحلية المياه Pro-Spin	برينستون فواصل	CS-800	إزالة الصبغة الحرة
لاصقة ختم رقائق الألومنيوم	AlumaSeal	F-384-100	ختم لوحات مخزون البولي
بروبيلين قوارير المبردة	قوارير Corning	430658	Master لتخزين مكتبة البروتين
ميكروبيدات	البروتين A Miltenyi	120-000-396	الاستعلام عن تعدد البروتين
البشري IgG	جاكسون Immunoresearch	& نب سب. 009-000-003	IgG غير ذي صلة لوضع العلامات
على البروتين A	Sigma	؛ P7837	محطة تهجين
، a-Hyb أو محطة	Miltenyi	مماثلة ، a-Hyb أو ما شابه	ذلك معالجة المصفوفات الدقيقة الآلية (اختياري)
الماسح الضوئي GenePix 4000B أو الأجهزة	الجزيئية	المماثلة الماسح الضوئي GenePix 4000B أو ما شابه	ذلك من مسح الشرائح
GenePix Pro أو ما يعادله برنامج استخراج البيانات	الأجهزة الجزيئية	GenePix Pro أو ما يعادله من برنامج استخراج البيانات
إشارة معالجة البيانات P4.1	DTU المعلوماتية الحيوية ، برنامج جامعة الدنمارك	التقنية	عبر الإنترنت أداة التنبؤ لتحديد وجود وموقع مواقع انقسام ببتيد الإشارة
TMHMM 2.0 خادم	DTU المعلوماتية الحيوية ، برنامج جامعة الدنمارك	التقنية عبر الإنترنت	التنبؤ بالحلزونات عبر الغشاء في البروتينات
Phobius	برنامج مركز ستوكهولم للمعلوماتية الحيوية	عبر الإنترنت	طوبولوجيا الغشاء المشترك ومؤشر ببتيد
الإشارة TOPCONS	ستوكهولم	عبر الإنترنت	التنبؤ بطوبولوجيا الغشاء وببتيدات الإشارة