نقدم هنا، بروتوكولا للشاشة البروتين خارج الخلية [ميكروارس] للتعرف على التفاعلات رواية مستقبلات-يجند في إنتاجية عالية. كما يصف لنا طريقة لتحسين الكشف عن تفاعلات البروتين البروتين عابر باستخدام مجمعات البروتين-ميكروبيد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يفرز عوامل ومستقبلات غشاء المربوطة وشركائها المتفاعلة الهيئات التنظيمية الرئيسية للاتصالات الخلوية والشروع في إشارات الشلالات خلال التوازن والمرض، وعلى هذا النحو تمثل الأهداف العلاجية الرئيسية. وعلى الرغم من أهميتها، تظل هذه الشبكات التفاعل الممثلة تمثيلاً ناقصاً إلى حد كبير في قواعد البيانات الحالية؛ ولذلك، يكون معظم البروتينات خارج الخلية لا شريك ملزمة موثقة. هذا التناقض يرجع أساسا إلى التحديات المرتبطة بدراسة البروتينات خارج الخلية، بما في ذلك التعبير عن البروتينات الوظيفية، وتقارب ضعف، وانخفاض، تفاعلات البروتين التي كثيرا ما تنشأ بين مستقبلات سطح الخلية. والغرض من هذا الأسلوب وصف طباعة مكتبة بروتينات خارج الخلية بتنسيق ميكرواري للفرز لتفاعلات البروتين البروتين. لتمكين الكشف عن التفاعلات الضعيفة، ويرد وصف أسلوب يقوم على مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام قيد الدراسة. بالإضافة إلى هذا النهج القائم على ميكروبيد مولتيميريزيشن لزيادة مولتيفالينسي، ميكرواري البروتين يتيح الكشف عن قوي لتفاعلات البروتين البروتين عابر في إنتاجية عالية. ويوفر هذا الأسلوب عينة السريع وانخفاض استهلاك--نهجاً للتعرف على التفاعلات الجديدة تنطبق على أي البروتين خارج الخلية. ويرد وصف البروتين ميكرواري الطباعة والفرز بالبروتوكول. هذه التقنية ستكون مفيدة للمحققين التماس وسيلة قوية لاكتشاف تفاعلات البروتين في الفضاء خارج الخلية.
المقدمة
ويصف الأسلوب الذي استعرض هنا طباعة مجموعة من البروتينات خارج الخلية في تنسيق ميكرواري، تليها طريقة لفحص هدفا لمصلحة ضد هذه المكتبة. لقد حددنا مولتيميريزيشن البروتين كخطوة حاسمة للكشف عن التفاعلات التي تتميز بالصلات ملزمة منخفضة. تعزيز الكشف عن هذه التفاعلات، يصف لنا بروتوكول استناداً إلى مولتيميريزيشن البروتين الاستعلام من اهتمام باستخدام ميكروبيدس.
يفرز والمنظمين الرئيسيين للاتصالات الخلوية والإشارات والتفاعل مع المكروية الخلية أعرب عن سطح البروتينات (يطلق عليها مجتمعة البروتينات خارج الخلية) جنبا إلى جنب مع شركائها في التفاعل. ولذلك، أنها ضرورية في تنظيم الكثير من العمليات الفسيولوجية والمرضية. تقريبا ربع المجين البشري (إيتش فايف، 000 البروتينات) ترميز للبروتينات خارج الخلية، التي، نظراً لأهميتها وإمكانية الوصول للأدوية تم تسليمها بشكل منهجي، وتمثل أهدافا رئيسية للمخدرات التنمية1. ونتيجة لذلك، تمثل البروتينات خارج الخلية أكثر من 70% الأهداف البروتين مع العمل الدوائية المعروفة للأدوية المعتمدة على السوق، والمعروفة باسم "البروتين دروجابل". على الرغم من أهميتها ووفرة، شبكات التفاعل (أبي) البروتين البروتين خارج الخلية يظل ناقصاً اللافت للنظر في قواعد البيانات المتاحة. وهذا يعود إلى طبيعة البيوكيميائية المعقدة من البروتينات خارج الخلية، مما يحول دون توصيف استخدام التكنولوجيات المتاحة الأكثر2. أولاً، يصعب بروتينات الغشاء من جعل، هي عملية غالباً ما ينطوي على ظروف قاسية الغسيل والمنظفات؛ ثانيا، غالباً ما تفتقد البروتينات خارج الخلية التعديلات ذات الصلة بوستترانسلاشونال مثل جليكوسيليشن التي غائبة عندما ترد هذه البروتينات في عادة تستخدم أنظمة مغايرة. وأخيراً، التفاعلات بين المستقبلات، مثل مستقبلات المشارك في الخلايا المناعية، وأعرب عن غالباً ما تكون عابرة واتسمت بوشائج منخفضة جداً (كد في ميكرومتر ~ 1 إلى > 100 ميكرومتر النطاق). بالإجمال، طبيعة هذه البروتينات وملزمة تقديم الشركاء الأكثر على نطاق واسع تستخدم التكنولوجيات، مثل تقارب تنقية/قياس الطيف الكتلي (AP/MS) أو خميرة-اثنين-الهجين، غير مناسب للكشف عن التفاعلات في الفضاء خارج الخلية 2 , 3.
في محاولة للتغلب على هذه التحديات التقنية والتعجيل باكتشاف رواية تفاعلات البروتينات خارج الخلية، قمنا بتطوير تغطية عالية بروتين خارج الخلية ميكرواري4،5. [ميكروارس] توفر ميزة توليد الأسطح عالية الكثافة مع كميات صغيرة من العينة، وهي عموما قابلة لدراسات الإنتاجية العالية. وفرت الدراسات ميكرواري البروتين سابقا أفكاراً ذات الصلة في تفاعلات البروتين لعدة نموذج الكائنات، أن كانت تركز أساسا على التفاعلات سيتوسوليك أو البروتين محددة الأسر6،7، 8. وفي المقابل، قد أنجز عمل محدودة للتحقيق في تفاعلات البروتين خارج الخلية باستخدام هذه التكنولوجيا. قمنا بتطوير أسلوب ميكرواري بروتين لتمكين الدراسات عبيس ببناء مكتبة شاملة ومتنوعة جداً من البروتينات يفرزها المنقي والمستقبلات (STM) transmembrane واحد أعرب عن المجالات خارج الخلية المؤتلف (النماء) تنصهر فيها العلامات الشائعة ل تنقية تقارب4. نجاح على شاشات ميكرواري البروتين تعتمد اعتماداً كبيرا على إنشاء مكتبة البروتين ذات جودة عالية. للتعبير عن البروتين كل مكتبة والاستعلام، خلايا الثدييات أو خلايا الحشرات تفضيلي اختيرت كأنظمة تعبير مغايرة، لضمان الصحيح إضافة التعديلات بوستترانسلاشونال مثل سندات glycosylation أو الميثيل. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، حجم الاستبعاد اللوني وضوء الليزر زاوية المتعددة تناثر من التقنيات الشائعة المستخدمة لتقييم نوعية البروتين المؤتلف. مكتبة البروتين ثم رصدت على الشرائح ابوكسيسيلاني وتخزينها في-20 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل. وأوصت تركيزات البروتين تزيد من 0.4 ملغ/مل للبروتوكول هو موضح أدناه. ولذلك، قد تتطلب البروتينات منخفضة-وإذ يعرب عن خطوة تركيز قبل نموذج الطباعة والتخزين. ومع ذلك، مزايا رئيسية لهذا الأسلوب هي حجم صغير البروتين المطلوب (50 ميكروغرام من البروتين كافية لأداء > شاشات 2,000)، جنبا إلى جنب مع استهلاك البروتين الاستعلام الحد الأدنى (20-25 ميكروغرام كل التكرارات الشاشة). استخدام البروتوكول والمعدات الموصوفة هنا، وشريطة توافر المكتبات، يمكن توليد نتائج لاستعلام فردي البروتينات خلال يوم عمل واحد.
تحديا كبيرا في الكشف عن تفاعلات البروتين في البيئة خارج الخلية تنشأ من طبيعتها ضعيفة أو عابر مميز، مما يحول دون تحديد المنهجيات الأكثر استخداماً. ويحسن حساسية للكشف عن البروتين ضعف التفاعلات9،،من1011زيادة اللذة ملزمة إلى حد كبير. استناداً إلى هذا المبدأ قمنا بتطوير أسلوب مولتيميريزي البروتينات الاستعلام (معبراً عنها كالانصهار Fc) استخدام البروتين المغلفة بالخرز4،5. لتجنب أي المنظمة المحتملة من البروتين الاستعلام بوصفها عشوائية، نحن تسمية مناعي البشري غير ذي صلة ز مع Cy5 بدلاً من ذلك وإضافته جنبا إلى جنب مع البروتين الاستعلام الخرز البروتين أ، وبالتالي القضاء على أي القطع الأثرية بسبب تصريف مباشر صبغ لبروتين الفائدة. ونظرا للصلات micromolar عدة مستقبلات المشارك أزواج، يعزز المجمعات متعددي إشارة إلى نسبة الضوضاء، مقارنة بالبروتينات الاستعلام Fc-الانصهار فرزهم كالبروتينات القابلة للذوبان4.
وخلاصة القول، والهدف من هذا البروتوكول وصف إعداد الشرائح ميكرواري يحتوي على مكتبة بروتين خارج الخلية موجودة من قبل للتعرف على التفاعلات مستقبلات-يجند. نقوم بمراجعة الخطوات اللازمة للشرائح الطباعة، متبوعاً ببروتوكول لفحص بروتين تهم ضد المكتبة البروتين خارج الخلية. وعلاوة على ذلك، يصف لنا طريقة للكشف المعززة من أبيس استناداً إلى ميكروبيدس لتحقيق اللذة زيادة من البروتين قيد الدراسة. التكنولوجيا ميكرواري البروتين خارج الخلية الموضحة هنا تمثل نهجاً سريعة وقوية وفعالة للفحص والكشف عن أبي رواية مع انخفاض نسب إيجابية كاذبة، وعن طريق استخدام كميات ميكروغرام فقط من البروتين الاستعلام تحت التحقيق. وقد غذت هذه التكنولوجيا الدراسات المتعددة التي قدمت أفكاراً ذات الصلة في الوظائف الخلوية غير معروف سابقا ومسارات الإشارات لمجموعة متنوعة من مستقبلات12،13، بما في ذلك14من إيمونوريجولاتورس الفيروسية، ويمكن أن يستفاد من دي أورفانيزي أي البروتين خارج الخلية للفائدة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-جيل مكتبة بروتينات البشرية خارج الخلية
- تجميع قائمة من مستقبلات سطح الخلية أو البروتينات يفرز من الفائدة لبناء المكتبة ميكرواري البروتين. الأسر البروتين محددة (على سبيل المثال، فوق عائلة الغلوبولين المناعي) أو البروتينات أعربت بشكل انتقائي وبخاصة الخلية يمكن تحديد أنواع للدراسة.
- لمستقبلات الخلية السطحية، تحديد حدود المجال خارج الخلية (النماء) بتحديد إشارة هضميد ومناطق ترانسميمبراني باستخدام أدوات البرمجيات. بعض ذات الصلة أدوات، متاحة مجاناً على الإنترنت، ويتم الرجوع إليها في الجدول للمواد15،16،،من1718.
- توليف النماء للجينات للفائدة واستنساخ في ناقلات الأمراض ذات الصلة. يمكن تنقية البروتينات يفرزها أو مستقبلات "نماء الطفولة المبكرة لتحقيق الاستقرار والانتساب" تنصهر فيها إلى عدد من العلامات تقارب مشترك من الوسائط مكيفة من الخلايا transfected مع ناقل مناسب، أو من أنظمة تعبير خلية باكولوفيروس الحشرات.
ملاحظة: الأنظمة المستندة إلى خلية الثدييات (مثل HEK/293 أو خلايا تشو) ينصح إلى أقصى حد احتمال طي البروتين السليم، وإضافة التعديلات ذات الصلة بوستترانسلاشونال مثل جليكوسيليشن. - تنقية البروتينات بأساليب تنقية النسب القياسية. وقد وصف الجهود السابقة الإجراءات التلقائية أو شبه الآلية المناسبة لتنقية المئات من البروتينات، التي يمكن أن يكون تحجيم لتوليد مجموعة البروتينات للفائدة9،،من1920، 21.
ملاحظة: يوصي الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، حجم الاستبعاد اللوني (S)، أو الليزر زاوية المتعددة تناثر الضوء (مراكز التسوق) لتقييم أي تجميع غير التساهمية ومراقبة للجودة الشاملة للأعمال التحضيرية البروتين. - ضبط البروتينات إلى ميكروغرام/مل 200 أو 400 كلما كان ذلك ممكناً، وتمييع الأرصدة مع والغليسيرول 80% للتخزين على المدى الطويل في قنينات المبردة في-20 درجة مئوية. وهذه تمثل الأرصدة الرئيسية ويجب أن يكون الوصول إليها إلا عند الضرورة.
- نقل مختبرين لكل البروتين (100 ميكروليتر) إلى 96-جيدا لوحات (لوحات الأسهم) وختم مع إحباط لاصقة وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى ميكرواري إعداد الشرائح. يتم إنشاء لوحات الأسهم لتقليل دورات تجميد أذاب وضمان الاستقرار البروتين.
2-خارج الخلية البروتين ميكرواري الطباعة
- استخدام ميكروارايير قياسية لطباعة الشرائح. أداة تستخدم للبروتوكول هو موضح هنا له قدرة الشرائح 57/تشغيل ويستخدم رأس طباعة عقد دبابيس اكتشاف 48. هذه الدبابيس توليد البقع ~ 100 ميكرومتر قطرها مفصولة بمسافة بقعة إلى بقعة ميكرومتر ~ 350 وتوجه ميكروليتر 0.25 للتحميل. تحت هذا التكوين، حتى البقع 8,000 كل شريحة يمكن استيعابها.
- إنشاء لوحات العمل (384 لوحات جيدا، 10 ميكروليتر عينة/حسنا) من لوحات الأسهم. تنفيذ هذه الخطوة يدوياً قبل الطباعة الشريحة باستخدام في ميكروارايير. ثم، بقعة البروتينات مع دبابيس اكتشاف نوع الريشة على الشرائح ابوكسيسيلاني في الرطوبة 60% (منع جفاف البقع البروتين).
ملاحظة: يمكن رصدها ألبومين المصل البقري المسمى Cy3 (BSA) في التكرارات بين كل عينة البروتين (5 ميكروغرام/مل في الجلسرين PBS/40%) لتصور الصفيف للقناع المناسب (انظر القسم 4). على الرغم من أن أوصى، هذه الخطوة اختيارية. - بعد الطباعة، إزالة الشرائح ميكرواري البروتين من البيئة هوميديفيد ومنعها بين عشية وضحاها مع الحليب 5% في ببست لإلغاء تنشيط السطح.
ملاحظة: هو النهج المفضل لاستخدام هو الموجات فوق الصوتية لتوليد غرامة ضباب لعرقلة الحل الذي يستقر على سطح الشريحة. - تخزين الشرائح في-20 درجة مئوية في الجلسرين 50% لمنع تجمده.
3-إعداد مجمعات الطعم متعددي
ملاحظة: التفاعلات بين البروتينات خارج الخلية غالباً ما تتسم بانخفاض الانتماءات. لتمكين الكشف عن هذه التفاعلات بزيادة اللذة ملزمة، نهجاً متعددي استناداً إلى التقاط البروتين الاستعلام، أعرب كمعلم نادي نماء الطفولة المبكرة، على ميكروبيدس المغلفة بالبروتين كان نمواً4.
- تسمية الناقل مفتش المستخدمة للكشف مع صبغة مونوريكتيفي Cy5 وفصل صبغ مجاناً باستخدام أعمدة الملحي. تحديد الصبغة إلى نسب البروتين عن طريق قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 و 650 نانومتر.
ملاحظة: عادة ما تستخدم نسب البروتين-صبغ بين 2.0 و 4.0. من المستحسن أن تدور يصرف Cy5 في س 100,000 ز لمدة 15 دقيقة لإزالة المجاميع للذوبان المحتملة الناجمة عن عملية وضع العلامات. - تحديد نسبة ميكروبيد للبروتين المثلى بمعايرة البروتين A ضد كمية ثابتة من البروتين الاستعلام. حجم الحد الأدنى تشبع الخرز حيث لا يزال أي البروتين معلم Fc مجاناً، كما تقاس باستخدام مقايسة تنافسية يحددها قياس التداخل بيولايير، يستخدم للفحص.
- تشكل مجمعات ميكروبيد بالبروتين التي تفرخ الاستعلام Fc معلم ومفتش Cy5 مع ميكروبيدس البروتين A والمزيج على المدورة أنبوب في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
- لتشكيل هذه المجمعات، استخدم البروتين الاستعلام بتركيز نهائي من 20 ميكروغرام/مل. لحساب نسبة البروتين الاستعلام ومفتش Cy5 المولى، تقسم الوزن الجزيئي للبروتين الاستعلام بالوزن الجزيئي لمفتش (150,000 دا) وقم بضرب 40 ميكروغرام/مل لتحديد تركيز Cy5-مفتش اللازمة.
- الملحق عينات مع البروتين للذوبان (1 ملغ/مل) مباشرة قبل الحضانة مع ميكرواري الشرائح (انظر القسم 4.2 أدناه) لمنع ملزمة لأي الخرز بالبروتين مجاناً إلى نادي الانصهار البروتينات التي قد تكون موجودة في الصفيف.
ملاحظة: قد تختلف عن حجم الرد النهائي الدائرة محطة أو حضانة التهجين باستخدام. الأجهزة المذكورة في الجدول للمواد يسمح حضانة العينات باستخدام كميات صغيرة نسبيا (~ 200 ميكروليتر كل شريحة).
4-خارج الخلية البروتين ميكرواري الفحص والمعالجة.
ملاحظة: هناك عدد من الشركات المصنعة التي توفر منصات المعالجة التلقائية. إذا لم يتوفر محطة تهجين، يمكن تنفيذ الخطوات التالية يدوياً، وضمان عدم وجود حجم كاف للمخزن المؤقت للحفاظ على الشرائح المغمورة في جميع الأوقات.
- الشرائح في درجة حرارة الغرفة دافئة وشطف مع توين PBS/0.1% 20 (ببست) لإزالة والغليسيرول المتبقية قبل تحميلها على محطة التهجين.
- استخدام بروتوكول الفحص التالية:
- غسل مع ببست لمدة 1 دقيقة.
- تحميل 200 ميكروليتر من البروتين 1 ملغ/مل A في اللبن PBS/5% واحتضان لمدة 30 دقيقة لمنع البروتين أونكومبليكسيد ميكروبيدس من الربط إلى معلم Fc البروتينات التي قد تكون موجودة في ميكرواري.
- غسل خمس مرات مع ببست لمدة 1 دقيقة.
- تحميل 200 ميكروليتر من مجمع حضور البروتين 1 ملغ/مل بالاستعلام: ميكروبيدس واحتضان لمدة 30 دقيقة.
- غسل مع ببست لمدة 1 دقيقة.
- بعد التهجين، شطف الشرائح مع المياه ووضع في أنابيب مخروطية 50 مل الفردية والجاف بالغزل في 900 غ س لمدة 5 دقائق.
- وأخيراً، مسح الشرائح مع الماسح الضوئي ميكرواري المناسبة للكشف عن Cy3 (إذا كان قد تم طبع جيش صرب البوسنة-Cy3) والأسفار Cy5 بإثارة في 532 و 635 نانومتر، على التوالي.
- القيام بتحليل البيانات باستخدام تحليل البيانات ميكرواري المصاحبة لها. يتم تحميل قائمة المصفوفة ذات الصلة (كملف.gal) إلى برنامج استخراج البيانات. وفي هذه المرحلة، الاستفادة من البقع Cy3-جيش صرب البوسنة للبحث عن القطع واستخدام خيارات السيارات لتركيب البرمجيات، متبوعاً بمحاذاة يدوياً من الميزات عند الضرورة. حفظ الملفات كملفات.gpr لمزيد من التحليل.
5-بيانات التحليل
- حفظ البيانات كملفات لائحة برلمان غرينلاند وعملية في البحث والتطوير باستخدام حزمة ليما، يشيع استخدامها لتحليل البيانات ميكرواري4،5.
- خلفية لتجهيزها، تصحيح والتطبيع داخل الشريحة. حيث تتم طباعة كل البروتين في البقع المكررة، الجمع بين كلا القياسات نسخ متماثل لإنشاء درجة واحدة لهذا البروتين في المكتبة.
- حساب الدرجات لكل شريحة، وتحليل النتائج للتقاطع بين المرشحين التهديف عالية بين الشرائح.
- [ميكروارس] مكررة من تشغيل طباعة منفصلة للتحكم لتقلب الشرائح واستخدامها المؤامرات تقاطع تمثل البيانات من كل من الشاشات لاستدعاء يضرب النهائي.
- وأخيراً، أداء مستوى إضافي من تصفية لاستبعاد البروتينات منحل داخل الصفيف. وتحدد هذه الاضبارات غير محددة البروتينات التي تتجاوز عتبة معينة ضرب التردد حسب تعريف المستخدم عبر شاشات مستقلة.
ملاحظة: يرد هذا البروتوكول بالتفصيل في توم et al. عام 20135. في حالتنا الموثق غير محددة تدعو يستند تحديد التراكمي فريسة بلغ معدل، ويتم استخدام عتبة القضاء المبنية على البيانات من 5%.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد في الشكل 1تخطيطي لسير العمل للتكنولوجيا ميكرواري البروتين خارج الخلية. حالما تتوفر ميكرواري الشرائح التي تحتوي على مكتبة البروتين خارج الخلية، يمكن إكمال فحص البروتين الفائدة وتحليل البيانات خلال يوم واحد. العديد من التفاعلات الفيزيولوجية الصلة بين جزءا لا يتجزأ من الغشاء مستقبلات تتسم بالقوة الملزمة ضعيفة جداً (كد في نطاق micromolar). ووضعت لتحسين الكشف عن مثل هذه التفاعلات، أسلوب يستند إلى استعلام البروتين (معبراً عنها كالانصهار Fc) مولتيمير...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يظل عدد كبير من مستقبلات اليتيمة في الجينوم البشري، ويواصل الشركاء المتفاعلة رواية الخروج للبروتينات خارج الخلية مع يغاندس تتسم سابقا. تحديد التفاعلات مستقبلات-يجند في الإنسان والكائنات نموذج أمر ضروري لفهم الآليات التي تملي الاتصالات الخلوية أثناء التوازن، فضلا عن التقلبات التي تؤدي إلى المرض، وذلك إبلاغ جديدة أو محسنة الخيارات العلاجية. ومع ذلك، الكشف عن تفاعلات البروتين خارج الخلية بالتكنولوجيات المستخدمة على نطاق واسع تمثل حاجزاً كبيرا أساسا بسبب التحديات التقنية المرتبطة بالكيمياء الحيوية المستقبلات الخلوية وشركائها...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
، ر. س-ص ونانسي مورغن-M. من الموظفين Genentech والأسهم الخاصة في المجموعة وشركة Genentech/روش.
شكر وتقدير
ونشكر فيلامير كالسيس ويوين كوبي للغاية قراءة المخطوطة. ونحن ممتنون لراندي ين للمشورة التقنية الممتازة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Ultra Pure MB Grade glycerol | USB Corporation | 56-81-5 | تخزين البروتين |
| SeptoMark حجب العازلة | Zeptosens | BB1 ، 90-40 | حجب شرائح المصفوفات الدقيقة العازلة |
| الألبومين مصل البقر | Roche | 03-117-957-001 | التحكم في الشرائح لتركيب القناع (اختياري) |
| ألواح البولي بروبيلين متعددة الآبار | Greiner Bio One | 82050-678 | الآبار لتخزين البروتين |
| Arrayit | MMP384 | طباعة الشرائح | |
| NanoPrint LM60 ، أو جهة اتصال مماثلة microarrayer | Arrayit | NanoPrint LM60 ، أو ما شابه ذلك من microarrayer الاتصال | طباعة الشرائح |
| دبابيس الإكتشاف الدقيقة | Arrayit | دبابيس الإكتشاف | الدقيقة طباعة الشرائح |
| محطة حجب ZeptoFOG | ZeptoFOG | محطة حجب ZeptoFOG ، 1210 | شريحة كتلة بعد طباعة |
| مسحوق الحليب الخالي من الدسم | محلول حجب | ||
| Thermo Fisher LP0031شريحة زجاجية مطلية بالإيبوكسي سيلان | Nextrion Slide E | 1064016 | Microarray شرائح حامل |
| زجاجي ومجموعة رف | منزلق Wheaton | 900303 | Slide Storage |
| Cy5 صبغة أحادية التفاعل | GE Healthcare | PA23031 | Albumin |
| Cy5 صبغة أحادية التفاعل | GE Healthcare | PA25001 | Human IgG وضع العلامات |
| على عمود تحلية المياه Pro-Spin | برينستون فواصل | CS-800 | إزالة الصبغة الحرة |
| لاصقة ختم رقائق الألومنيوم | AlumaSeal | F-384-100 | ختم لوحات مخزون البولي |
| بروبيلين قوارير المبردة | قوارير Corning | 430658 | Master لتخزين مكتبة البروتين |
| ميكروبيدات | البروتين A Miltenyi | 120-000-396 | الاستعلام عن تعدد البروتين |
| البشري IgG | جاكسون Immunoresearch | & نب سب. 009-000-003 | IgG غير ذي صلة لوضع العلامات |
| على البروتين A | Sigma | ؛ P7837 | محطة تهجين |
| ، a-Hyb أو محطة | Miltenyi | مماثلة ، a-Hyb أو ما شابه | ذلك معالجة المصفوفات الدقيقة الآلية (اختياري) |
| الماسح الضوئي GenePix 4000B أو الأجهزة | الجزيئية | المماثلة الماسح الضوئي GenePix 4000B أو ما شابه | ذلك من مسح الشرائح |
| GenePix Pro أو ما يعادله برنامج استخراج البيانات | الأجهزة الجزيئية | GenePix Pro أو ما يعادله من برنامج استخراج البيانات | |
| إشارة معالجة البيانات P4.1 | DTU المعلوماتية الحيوية ، برنامج جامعة الدنمارك | التقنية | عبر الإنترنت أداة التنبؤ لتحديد وجود وموقع مواقع انقسام ببتيد الإشارة |
| TMHMM 2.0 خادم | DTU المعلوماتية الحيوية ، برنامج جامعة الدنمارك | التقنية عبر الإنترنت | التنبؤ بالحلزونات عبر الغشاء في البروتينات |
| Phobius | برنامج مركز ستوكهولم للمعلوماتية الحيوية | عبر الإنترنت | طوبولوجيا الغشاء المشترك ومؤشر ببتيد |
| الإشارة TOPCONS | ستوكهولم | عبر الإنترنت | التنبؤ بطوبولوجيا الغشاء وببتيدات الإشارة |
المراجع
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
- Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
- Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
- Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
- Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
- Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
- Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
- Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
- Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
- Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473(2016).
- Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
- Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
- Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
- Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9(2002).
- Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
- Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
