يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ميكرودياليسيس أحماض الأمينية ضادات خلال تسجيلات التخطيط الدماغي في الانتقال بحرية الفئران

11.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58455

⸱

نوفمبر 8, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

في هذه المقالة

ملخص

وهنا يصف لنا أسلوب في فيفو ميكرودياليسيس لتحليل الإصدار اسبارتاتي والغلوتامات في الحصين البطني من الفئران الصرع وغير صرع، في تركيبة مع تسجيلات التخطيط الدماغي. قد ترتبط تركيزات خارج الخلية اسبارتاتي وغلوتامات مع المراحل المختلفة للمرض.

الملخص

ميكرودياليسيس هو تقنية راسخة في علم الأعصاب التي ترتبط تغييرات المواد الفعالة عصبيا نشرها في الفضاء المخ المتداخلة مع السلوك و/أو نتائج محددة لعلم الأمراض (مثل المضبوطات للصرع). عند دراسة الصرع، غالباً ما يقترن تقنية ميكرودياليسيس مع قصيرة الأجل أو طويلة الأجل حتى الفيديو-المخ (EEG) رصد لتقييم تواتر الاستيلاء عفوية وشدته، والتقدم وتجميع. ميكرودياليسيس-التخطيط الدماغي مجتمعة يرتكز على استخدام عدة أساليب وأدوات. وهنا، أجرينا في فيفو ميكرودياليسيس والفيديو المستمر-EEG تسجيل لمراقبة تدفق غلوتامات واسبارتاتي على مر الزمن، في مراحل مختلفة من التاريخ الطبيعي للصرع في نموذج الفئران. ويسمح هذا النهج الموحد الاقتران من التغييرات في الإصدار العصبي بمراحل معينة من تطور المرض والتقدم. أن تركيز الأحماض الأمينية في دياليساتي تحددها اللوني السائل. هنا، يمكننا وصف الأساليب والخطوط العريضة التي ينبغي أن تتخذ التدابير الوقائية الرئيسية واحد خلال في فيفو ميكرودياليسيس-EEG، مع إيلاء اهتمام خاص لعملية جراحية ستيريوتاكسيك، وحفز البوتاسيوم القاعدية وعالية أثناء ميكرودياليسيس، عمق الكهربائي EEG تسجيل وتحليل عالية الأداء اللوني السائل اسبارتاتي والغلوتامات في دياليساتي. وهذا النهج قد تكون مناسبة لاختبار مجموعة متنوعة من المخدرات أو الأمراض الناجمة عن تغيرات التركيزات الفسيولوجية اسبارتاتي والغلوتامات في الدماغ. رهنا بتوافر المقايسة التحليلية المناسبة، قد زيادة استخدامه لاختبار مختلف الجزيئات القابلة للذوبان عند استخدام تسجيل EEG في نفس الوقت.

المقدمة

إلى التبصير بضعف وظيفي لوساطة غلوتامات ضادات وجابايرجيك كبيرة المثبطة أسفر عن المضبوطات عفوية في صرع الفص الصدغي (TLE)، نحن بانتظام رصد تركيزات خارج الخلية GABA1 وبعد ذلك طبعا مستويات الغلوتامات والاسبارتيت2 من ميكرودياليسيس في الحصين البطني من الفئران في نقاط زمنية مختلفة من هذا المرض الطبيعية، أيخلال التنمية والتقدم للصرع. ونحن استغل الطراز pilocarpine TLE في الفئران، الذي يحاكي هذا المرض بشكل دقيق جداً من حيث التغيرات السلوكية والكهربية ونسيجية3،4 ونحن يرتبط تركيز dialysate الأمينية الأحماض بمراحلها المختلفة: المرحلة الحادة بعد الإهانة ابيليبتوجينيك، في مرحلة الكمون، وقت الاستيلاء العفوية الأولى و6،75،فاس المزمنة. تأطير مراحل المرض كان مكن رصد EEG الفيديو الطويلة الأجل ودقة التخطيط الدماغي والسريرية توصيف المضبوطات عفوية. تطبيق تقنية ميكرودياليسيس المرتبطة برصد EEG الفيديو طويل الأجل يسمح لنا باقتراح فرضيات آليا لأمراض الأعصاب TLE. وباختصار، يتيح الأسلوب الموصوفة في هذه المخطوطة الاقتران من التعديلات الكيميائية العصبية داخل منطقة محددة بالدماغ مع التنمية والتقدم للصرع في نموذج حيوان.

الأجهزة المزدوجة، تتكون من عمق القطب محاذياً قنية ميكرودياليسيس، كثيرا ما تستخدم في الدراسات البحثية الصرع حيث ينبغي أن ترتبط التغيرات في الناقلات العصبية، ونواتج الأيض، أو ركائز الطاقة لنشاط الخلايا العصبية. في الغالبية العظمى من الحالات، وهو يستخدم في التصرف بحرية الحيوانات، ولكن يمكن أن تجري أيضا بطريقة مماثلة في البشر، مثلاً، في دراسة معمقة من العقاقير المقاومة مرضى الصرع تمر بعمق مسرى التحقيق قبل الجراحة8. يمكن تنفيذ تسجيل EEG، وجمع دياليساتي على حدة (مثلاً، زرع مسرى في واحد في نصف الكرة وميكرودياليسيس التحقيق في نصف الكرة الغربي الأخرى أو حتى أداء في ميكرودياليسيس في مجموعة واحدة من الحيوانات أثناء أداء التخطيط الدماغي الوحيد في مجموعة أخرى من الحيوانات). على الرغم من ذلك، اقتران أقطاب كهربائية إلى تحقيقات قد مزايا متعددة: أنه يبسط عملية جراحية ستيريوتاكسيك، ويحد من تلف الأنسجة إلى واحد فقط في نصف الكرة (بينما تترك الأخرى، سليمة، كعنصر تحكم لدراسات نسيجية)، وهوموجينيزيس نتائج هذه تم الحصول عليها من نفس المنطقة الدماغ والحيوان نفسه.

من ناحية أخرى، يتطلب إعداد الجهاز قطب كهربائي مسبار ميكرودياليسيس إلى جانب الوقت والمهارات إذا كان الصنع. واحد يمكن أن تنفق مبالغ مالية مرتفعة نسبيا إذا تم شراؤها من السوق. وعلاوة على ذلك، عندما يسبر ميكرودياليسيس (نصائح المسبار هي عادة 200-400 ميكرون في القطر و 7-12 ملم طويلة)9، واقطاب EEG (نصائح القطب عادة من 300-500 ميكرون في القطر، وطويل بما يكفي للوصول إلى هيكل الدماغ لفائدة10) بالإضافة إلى، يمثل الجهاز المحمل كائن ضخمة وثقيلة نسبيا على جانب واحد من الرأس، والتي مزعجة للحيوانات وعرضه لأن تضيع خاصة عندما كان متصلاً بمضخة غسيل الكلي ونظام تسجيل EEG الثابت من الأسلاك. هذا الجانب أكثر صلة بالصرع الحيوانات التي يصعب التعامل معها والتكيف أقل لدورات ميكرودياليسيس. التقنيات الجراحية المناسبة والرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية المناسبة يمكن أن ينتج يزرع طويلة الأمد التي تسبب أدنى إزعاج الحيوان وينبغي اتباعها لتجارب EEG ميكرودياليسيس كومبيناتوري، ،من1011 12.

مزايا وقيود تقنية ميكرودياليسيس قد استعرضت بالتفصيل العديد من علماء الأعصاب. ميزته الأساسية خلال في فيفو نضح تقنيات أخرى (مثلاً، دفع وجذب تدفق سريع أو نضح كأس القشرية) هو قطره صغيرة من التحقيق الذي يغطي منطقة دقيقة نسبيا لفائدة13،14، 15. ثانيا، يقوم الغشاء ميكرودياليسيس حاجز مادي بين الأنسجة وبيرفوساتي؛ ولذلك، المواد الوزن الجزيئي العالية لا عبور ولا تتداخل مع تحليل16،17. وعلاوة على ذلك، حماية الأنسجة من تدفق المضطرب بيرفوساتي18. ميزة هامة أخرى هي إمكانية تعديل تدفق بيرفوساتي لتحقيق أقصى قدر من التركيز أكثر في بيرفوساتي (أيعملية ميكرودياليسيس ويمكن أيضا تعريف رياضيا ويمكن تعديلها تسفر عن ارتفاع 19من تركيزات أكثر في العينة). وأخيراً، قد تستعمل التقنية ضخ الأدوية أو المواد عقاقيري النشط في الأنسجة للفائدة وتحديد أثرها في موقع تدخل20. من ناحية أخرى، قد ميكرودياليسيس وقت قرار محدودة (عادة أكثر من 1 دقيقة بسبب الوقت اللازم لجمع العينات) بالمقارنة مع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية أو البيولوجية؛ هو أسلوب الغازية التي تسبب تلف الأنسجة؛ أنه يعرض للخطر التوازن الكيميائية العصبية داخل الفضاء حول الغشاء بسبب الانحدار تركيز مستمر لجميع المواد القابلة للذوبان الذي يدخل بيرفوساتي جنبا إلى جنب مع أكثر الفائدة. وأخيراً، تقنية ميكرودياليسيس يتأثر عالية بحدود التقنيات التحليلية المستخدمة للتقدير الكمي للمواد في بيرفوساتي9،،من2122،23 . كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) بعد derivatization مع أورثوفثالديالديهيدي لتحليل العينات البيولوجية غلوتامات واسبارتاتي قد تم التحقق من صحتها جيدا24،،من2526 , 27 ومناقشة واسعة النطاق خارج نطاق هذه المخطوطة، ولكن سيتم وصف البيانات المنتجة باستخدام هذه الطريقة بالتفصيل.

عند القيام بشكل سليم ودون إدخال تعديلات على تكوين بيرفوساتي، ميكرودياليسيس يمكن أن توفر معلومات موثوقة حول المستويات القاعدية لإطلاق سراح العصبي. الجزء الأكبر من المستويات القاعدية ومن المرجح نتيجة لامتداد الإرسال من نهايات9. لأنه في كثير من الأحيان عينات بسيطة من العصبي في مساحة إضافية متشابك لا يكفي لتحقيق الأهداف المتمثلة في التحقيق، تقنية ميكرودياليسيس يمكن أن تستخدم أيضا لتحفيز الخلايا العصبية أو لحرمانهم من الأهمية أيونات الفسيولوجية مثل ك+ Ca2 +، أو من أجل استحضار أو منع الإفراج عن العصبي.

غالباً ما يستخدم عالية ك+ التحفيز في بيولوجيا الأعصاب لتحفيز نشاط الخلايا العصبية ليس فقط في الحيوانات مستيقظا ولكن أيضا في الثقافات الابتدائية وأورجانوتيبيك. تعرض نظام صحي العصبي المركزي للحلول مع تركيزات عالية من ك+ (40-100 ملم) تثير افلوكس من العصبية28. يمكن أن يتعرض هذا قدرة الخلايا العصبية على توفير إصدار إضافية استجابة لارتفاع ك+ في الحيوانات الصرع1 في29،أمراض الأعصاب الأخرى30. وبالمثل، Ca2 + الحرمان (التي تم الحصول عليها من بيرفوسينج Ca2 + الحلول مجاناً) يستخدم لوضع الكالسيوم تعتمد على إطلاق سراح معظم أجهزة الإرسال العصبية التي تقاس ميكرودياليسيس. ويعتقد عموما أن Ca2 + تعتمد الإصدار منشأ الخلايا العصبية، بينما تنشأ Ca2 + الإصدار المستقل من إطلاق، ولكن العديد من الدراسات أثارت الجدل حول معنى Ca2 +-قياسات حساسة مثل غلوتامات أو GABA9: وهكذا، إذا كان ذلك ممكناً، فمن المستحسن أن دعم الدراسات ميكرودياليسيس بالدراسات ميكروسينسور، وهذه الأخيرة أعلى القرار المكانية والأقطاب يسمح للحصول على أقرب إلى نهايات31.

فيما يتعلق بالدراسات ميكرودياليسيس في الحيوانات الصرع، من المهم التأكيد على أن البيانات التي تم الحصول عليها من معظم هذه تعتمد على رصد الفيديو أو الفيديو-EEG للمضبوطات، أيحدوث عابرة من علامات أو أعراض غير طبيعية بسبب المفرطة أو متزامن مع نشاط الخلايا العصبية في الدماغ32. وهناك بعض التفاصيل من مضبوطات اليكتروجرافيك في التعامل مع pilocarpine الحيوانات التي ينبغي النظر فيها عند إعداد التجربة. مضبوطات عفوية يتبعها كساد النشاط مع كثرة التخطيط الدماغي المسامير إينتيريكتال3 وتحدث في مجموعات،من3334. شام يشغلها غير صرع الحيوانات قد يحمل نشاط مثل الاستيلاء على35 ولذلك ينبغي أن تكون معايير التقييم تسجيلات التخطيط الدماغي موحدة36 ، وإذا كان ذلك ممكناً، ينبغي أن يكون توقيت الدورات ميكرودياليسيس محددة تحديداً جيدا. وأخيراً، ونحن نوصي بشدة وفقا للمبادئ والمعايير المنهجية لرصد EEG الفيديو في مكافحة القوارض الكبار حددها خبراء الجامعة الدولية ضد الصرع وجمعية الصرع الأمريكية في تقاريرها الأخيرة جداً37 ،38.

وهنا يصف لنا ميكرودياليسيس الغلوتامات واسبارتاتي جنبا إلى جنب مع تسجيلات الفيديو-EEG طويلة الأجل في الحيوانات الصرع وتحليلها في دياليساتي واسطة [هبلك]. وسوف نؤكد على الخطوات الحاسمة من البروتوكول أن المرء يجب العناية لنتيجة أفضل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

عليها جميع الإجراءات التجريبية بجامعة فيرارا رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة ووزارة الصحة الإيطالية (إذن: مارك 246/2012-ب) وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في "المجتمعات الأوروبية" مجلس التوجيه من 24 نوفمبر 1986 (86/609/EEC). ويعدل هذا البروتوكول على وجه التحديد لتصميم غلوتامات واسبارتاتي في دياليساتيس الدماغ الفئران التي تم الحصول عليها تحت السيطرة EEG لدورات ميكرودياليسيس في الفئران الصرع وغير صرع. يمكن استبدال العديد من المواد الموصوفة هنا بسهولة مع تلك التي يستخدمها أحد في المختبر لتسجيلات التخطيط الدماغي أو ميكرودياليسيس.

1-جمعية الجهاز ميكرودياليسيس مسبار قطب كهربائي

  1. استخدم 3-القناة الملتوية اثنين قطب كهربائي (مع على الأقل 20 ملم قطع طول مسرى التسجيل و 10 سم طويلة التأريض الكهربائي) وزوجين من إلى قنية دليل لإعداد الجهاز. انظر أمثلة على القنية القطب والدليل 3-قناة لغسيل الكلي في الشكل 1A-1B.
  2. إزالة (الشكل 1) وإدراج (الشكل 1) قنية دليل المعادن في قنية بلاستيكية وهمية عدة مرات قبل الاستخدام من أجل تخفيف إزالة في الوقت الراهن التبديل للتحقيق ميكرودياليسيس في الحيوان.
  3. ثني الأسلاك الملتوية لتسجيل القطب مرتين (1E الرقم-1F) من أجل محاذاة الأسلاك مع قنية وهمية للدليل وقطع طرف قطب كهربائي (الشكل 1) لتكون أطول من طرف قنية دليل (الرقم 0.5 مم ح 1) باستخدام الفرجار الرقمية.
  4. يكون على استعداد سيركليت السليكون طويلة 1 مم (نقلت 2 مم، سمك 0.3 مم؛ 1I الشكل) وإدراج تلميح قنية دليل وغيض من أقطاب الملتوية في سيركليت السليكون باستخدام الملقط (الرقم 1J). الإصلاح على سفح الدليل رمي قنية مع الغراء البوليمر للعمل السريع أو الراتنج (الشكل 1 K). انظر على سبيل المثال الأجهزة المكتملة في الشكل 1 L و الرقم 2A.
  5. تعقيم الجهاز تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية مبيد للجراثيم ليتعرض 4 حاء بدوره على الجهاز أربع مرات في ذلك كل من الجانبين للضوء ح 1.
    ملاحظة: قد جمعت العديد من المجسات أقطاب وميكرودياليسيس المصنوعة بطريقة مماثلة. الرأس من فوق الزرع وصف للفئران بالأبعاد التالية: 7 مم عرض × عمق 5 مم × طول 10 ملم من الجزء العلوي رمي أخمص القدمين؛ تلميح زرع حوالي 11 مم في الطول، 600 ميكرون في القطر، وجميع الأجهزة أوزان حوالي 330-360 ملغ. الجهاز قد يكون استخدامها مرتين أو ثلاث مرات إذا تركت (ط) مدة كافية للقطب الأرضي في الجمجمة أثناء الجراحة لاستخدام المقبل و (ثانيا) عندما يتم قتل الحيوان، والجهاز تعافي جنبا إلى جنب مع الأسمنت الأسنان ويترك في الأسيتون أوفيرنيغ t، تلك التي قد تكون مصنفة الأسمنت ميكانيكيا، والجهاز غسلها وتعقيمها مرة أخرى.

2-ستيريوتاكسيك جراحة

  1. استخدام ستيريوتاكسيك الجهاز ومسبار كليب حامل (الشكل 2) لغرس الجهاز بعد بالمعايير المعاصرة لعملية جراحية معقمة وخالية من الألم39،،من4041.
    1. تخدير الفئران سبراغ داولي الكبار مع خليط الكيتامين/xylazine (43 مغ/كغ و 7 مغ/كغ، والقائمة) وإصلاحه على الإطار ستيريوتاكسيك. إضافة التخدير إيسوفلوراني (1.4 في المائة في الهواء؛ 1.2 مل/دقيقة) لحقن الكيتامين/xylazine الأولية كما أنها تسمح بالتحكم في عمق التخدير في الوقت. يحلق الفراء على رأس الحيوان.
  2. مسحه على سطح جلد الرأس بالحل القائم على اليود تليها الإيثانول 70% لإعداده لعملية جراحية معقمة39.
    1. زرع الجهاز القنية-القطب دليل على استعداد في الأسبقية (1.1-1.5) إلى الحصين البطني حق استخدام الإحداثيات التالية: شريط الآنف 5.0 ملم، (أ) – 3.4 ملم، ل + + + 4.5 مم، ف مم 6.5 إلى بريجما1،2. اتباع أساليب قياسية للعمليات الجراحية ستيريوتاكسيك10،،من1112.
    2. التأكد من أنها لا تشمل ترسيخ مسامير. عند تركيب على جهاز ستيريوتاكسيك، فهم الجهاز للرأس قنية دليل كهذا قد تكون محاذاة بسهولة لصاحب التحقيق.
  3. ربط الجهاز بالجمجمة مع مالا يقل عن أربعة مسامير غير القابل للصدأ الشد لهم في عظم الجمجمة (1 المسمار في المسمار الأيسر و 1 في لوحات الحق أمامي العظام والمسمار 1 إلى يسار الجدارية والمسمار 1 في لوحات إينتيرباريتال العظام). إضافة قطره غراء الأنسجة لمواصلة إصلاح كل المسمار إلى عظم الجمجمة.
    1. وتغطي نصف المواضيع المسمار مع الأسمنت ميثاكريليك. تعزيز ربط الأسمنت بجعل الأخاديد الضحلة في العظام لزيادة الالتزام.
  4. حالما يتم وضع غيض الجهاز إلى أنسجة المخ، تطور السلك الكهربائي الأرضي حوالي 3 ترسيخ مسامير. تغطي كل محمل مسامير والجهاز مع الأسمنت الأسنان12،،من4243.
  5. مراقبة الحيوانات أثناء الجراحة، وحوالي 1 ساعة بعد ذلك حتى تستقيم ويتحرك القفص. الاحتفاظ بها على لوحة الاحترار لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم. السماح للفئران لاسترداد لمدة 7 أيام على الأقل بعد زرع جهاز.
  6. مراقبة الحيوانات على الأقل مرة واحدة يوميا لمدة 3 أيام بعد عملية جراحية لعلامات الألم أو المعاناة. تعطي الحيوانات مع كريم مضاد حيوي (مع الجنتامايسين 0.1 ٪) القريبة من الموقع قطعي لمنع العدوى ومسكن (ترامادول 5 مغ/كغ، والقائمة) لمدة 3 أيام لمنع الألم بعد الجراحة.

3-الفص الصدغي الصرع التعريفي Pilocarpine والإحالة للحيوانات للمجموعات التجريبية

  1. وبعد أسبوع انتعاش بعد الجراحة، تعيين الحيوانات عشوائياً إلى مجموعات: (ط) مراقبة الحيوانات تلقي الحيوانات المركبة والصرع (ثانيا) التي ستقوم بتلقي بيلوكاربيني. استخدام عدد أكبر نسبيا من الحيوانات للمجموعة الصرع منذ ليس كل من بيلوكاربيني تدار الفئران سوف يصابون بالمرض.
  2. حقن جرعة من ميثيلسكوبولاميني (1 مغ/كغ، والليبي) و 30 دقيقة، وبعد حقنه واحدة من بيلوكاربيني (350 مغ/كغ، والقائمة) للحث على مركز epilepticus (جنوب شرق). حقن ميثيلسكوبولاميني والمركبة (المالحة) على الفئران التحكم. استخدام المحاقن 1 مل مع 25 غ إبرة لجميع الإدارات القائمة.
    1. التحقق بصريا من الحيوانات لتبدأ لديها السلوكية المضبوطات (نقل فيبريسا خلال 5 دقائق، الإيماء رأسه، استنساخ أطرافه) وفي حدود 25 دقيقة لاستنساخ باستمرار جميع الجسم (جنوب شرق).
  3. اعتقال 2 SE ح بعد بداية لوفيات حوالي 25% وفترة كامنة يعني حوالي 10 أيام بإدارة ديازيبام (20 مغ/كغ، والقائمة). مراقبة وتسجيل أي ضبط السلوك بداية فورا بعد الحقن بيلوكاربيني وتستمر على الأقل 6 ح بعد ذلك.
  4. إعطاء المحلول الملحي الحيوانات (1 مل، القائمة) باستخدام المحاقن 1 مل مع حل ز 25 إبرة والسكروز (1 مل، ص. ب.) باستخدام 1 مل المحاقن والإبر ز 17 تغذية مرنة لمدة 2-3 أيام بعد سراج الدين لتعزيز انتعاش الجسم وفقدان الوزن.
    1. استبعاد الحيوانات التي لا تحقق وزن الجسم الأولية خلال الأسبوع الأول بعد بيلوكاربيني سراج الدين من الدراسة (باستثناء مجموعة الحاد قتل 24 ساعة بعد سراج الدين، التي لا يمكن فيها متابعة وزن الجسم ما).
  5. تعيين وظيفة-SE الحيوانات عشوائياً إلى مختلف المجموعات التجريبية (الشكل 3): الحاد المرحلة (ميكرودياليسيس التي يجري فيها 24 ساعة بعد SE)، الكمون (7-9 أيام بعد SE) ومصادرة العفوية الأولى (حوالي 11 يوما بعد SE) (الفترة المزمنة يبدأ حوالي 22-24 يوما بعد سراج الدين، أي حوالي 10 أيام بعد الاستيلاء على الأولى). مراقبة الحيوانات لحدوث الاختلاجات عفوية.
    ملاحظة: استخدام تضمين/استبعاد المعايير التالية لتجارب أخرى في الفئران الصرع: تطوير SE التشنجية داخل ح 1 بعد بيلوكاربيني الإدارة؛ زيادة الوزن في الأسبوع الأول بعد سراج الدين وتحديد المواقع الصحيحة للتحقيق ميكرودياليسيس والقطب.

4-الصرع السلوك الرصد والتحليل

  1. مراقبة طويلة الأمد للسلوك الصرع
    1. ضع الحيوانات في أقفاص تنظيف المنزل حوالي 6 ح بعد pilocarpine الإدارة (أيفي نهاية الملاحظة المباشرة من الباحثين)، وبدء مراقبة الفيديو ح 24.
    2. مواصلة الفيديو ح 24 رصد حتى يوم 5، واستخدام نظام مراقبة فيديو رقمية.
    3. ابتداء من يوم 5، الاتصال على الفئران في أقفاص مستطيلة على الصفحة الرئيسية لنظام تسجيل EEG المربوطة، ومواصلة رصد ح 24 الفيديو.
    4. مجموعة المعلمات على مكبر للصوت المتمركزة خارج قفص فاراداي (معامل التضخيم مجموعة في كل قناة ووفقا لخصوصية إشارة EEG كل حيوان واحد) والبدء التخطيط الدماغي اكتساب مراقبة إشارة EEG التي تنتجها لا صلة لها الكابلات. استخدام العينات معدل 200 هرتز والمنخفضة تمرير تصفية مجموعة إلى 0.5 هرتز.
    5. قم بتوصيل الحيوان الكابلات عقد رئيس الحيوان بين اثنين من أصابعه امتدت من جهة والشد أسفل الموصلات لرمي قطب كهربائي باستخدام اليد الحرة الأخرى. بدء اكتساب.
      تنبيه: تأكد من أن الإشارة خالية من القطع الأثرية. القطع الأثرية المشتركة هي طفرات تتجاوز كثيرا النطاق.
    6. يوم واحد قبل التجربة ميكرودياليسيس، نقل الحيوانات في نظام التخطيط الدماغي المربوطة مجهزة باسطوانات شبكي ميكرودياليسيس. قم بفصل الحيوانات من التخطيط الدماغي الربط النظام في قفص المنزل الشد الموصلات من مسرى دون كبح جماح الحيوان. ضع الحيوان في اسطوانات شبكي عالية.
  2. رصد سلوك الصرع يوميا قبل وأثناء الدورة ميكرودياليسيس
    1. التبديل على مكبر للصوت المتمركزة خارج قفص فاراداي. فتح برنامج التخطيط الدماغي. بدء اكتساب EEG مراقبة إشارة EEG تنتجها الكابلات غير مرتبطة.
    2. قم بتوصيل الحيوان إلى نظام تسجيل EEG المربوطة عقد رئيس الحيوان بين اثنين من أصابعه امتدت من جهة والشد أسفل الموصلات لرمي قطب كهربائي باستخدام اليد الحرة الأخرى. تعيين عامل تضخيم (كسب) على كل قناة من مكبر للصوت وفقا لإشارة القطب حيوان واحد حتى إشارة EEG في الجدول. اسمحوا الحيوان استكشاف القفص الجديد (اسطوانة) على الأقل 1 ح تحت المراقبة المباشرة للباحث.
    3. ملاحظة: تجربة 24 ساعة قبل ميكرودياليسيس، ويتم تخديره الفئران بإيجاز مع إيسوفلوراني لتبديل cannulas دليل للتحقيق ميكرودياليسيس. الاستفادة من هذه اللحظة عندما يتم تخديره من توصيلها إلى نظام تسجيل EEG.
    4. قم بتقصير أو إطالة كابل متدلية وفقا للسلع الأساسية للحيوان. تأكد من أن الكبلات لا تتداخل مع حركات الحيوان والموقف الكذب.
    5. الاختيار لتأطير الصورة الصحيحة لكاميرات الفيديو. بدء تسجيل الفيديو-EEG.
  3. تحديد نشاط التخطيط الدماغي والمضبوطات
    1. استخدام برمجيات لاعب لمشاهدة أشرطة الفيديو. التمرير الفيلم 8 مرات أسرع من اللعب الوقت الحقيقي ويتفرد المضبوطات المعمم (انظر الحيوان إلى الخلف مع رمع فوريليمب أو الحيوان تربية والوقوع مع رمع فوريليمب). تبطئ الفيديو وملاحظة الوقت الدقيق من البداية والنهاية للاستيلاء على السلوكية.
    2. عملية البيانات حسب إحصاء عدد المضبوطات المعمم الملاحظ في ح 24 من سجلات الفيديو والتعبير عنها فيما يتعلق بالاستيلاء على تواتر ومدة يعني قيم جميع المضبوطات التي لوحظت في 24 ساعة.
    3. تعريف مضبوطات EEG كفترات النشاط الانتيابي من الترددات العالية (> 5 هرتز) تميزت > زيادة السعة 3-fold على خط الأساس مع تطور وتيرة سبايك الذي يستمر لمدة أدناها 3 s2،44 أو 28من مماثلة. استخدام برامج التخطيط الدماغي لمعالجة تسجيلات التخطيط الدماغي الخام. تقسيم آثار التخطيط الدماغي إلى كسور ح 1. نسخ الكسور EEG التتبع ملف للتحليل التلقائي سبايك البرمجيات.
    4. تحليل بيانات نشاط التخطيط الدماغي استخدام برامج التخطيط الدماغي والمعلمات المعرفة مسبقاً (4.3.3.). إجراء جميع التحليلات الفيديو في اثنين من المحققين المستقلين مكفوفي لمجموعة الحيوانات تم تحليلها. وفي حالة الاختلاف، جعلها تعيد النظر في البيانات معا للتوصل إلى توافق في آراء45.

5-ميكرودياليسيس

  1. في المختبر الانتعاش مسبار
    1. إعداد التحقيق للاستخدام الأولى وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، في الأكمام الواقية في التعامل.
    2. تشغيل التجربة في ثلاث نسخ: إعداد ثلاثة أنابيب الاختبار 1.5 مل تحميلها مع 1 مل من محلول للمسابقة التي تحتوي على خليط المعايير (2.5 ميكرون من غلوتامات) و 2.5 ميكرون من اسبارتاتي. وضع أنابيب الاختبار تحميل 1.5 مل ثلاثة في مجموعة سخان كتلة إلى 37 درجة مئوية ووضعه على محرض.
      ملاحظة: استخدام نفس الحلول القياسية معايرات اللوني.
    3. ختم أنابيب الاختبار 1.5 مل مع الفيلم البارافين وثقب أنه بالملقط حادة جعل حفرة من حوالي 1 ملم في القطر.
    4. يأخذ التحقيق وأدخله في الثقب في الفيلم البارافين. تزج الغشاء على الأقل 2 ملم تحت مستوى الحل. إصلاح مزيد التحقيق إلى 1.5 مل أنبوبة الاختبار بالفيلم البارافين.
      تنبيه: التأكد من أن هذه المعلومة لا تلمس جدران أنبوب اختبار 1.5 مل.
    5. قم بتوصيل مدخل مسبار المحاقن التي شنت على ضخ المضخة باستخدام محولات FEP-الأنابيب والأنابيب. اختيارياً، يتحمل غرامة استخدام أنابيب البوليثين 0.28 ملم OD معرف ومم 0.61 ومحولات الأنابيب الملونة (محولات أنابيب أحمر وأزرق) للاتصالات.
    6. بدء تشغيل المضخة في 2 ميليلتر/دقيقة واسمحوا السائل تظهر على طرف منفذ. قم بتوصيل منفذ مسبار مل 0.2 جمع أنبوب اختبار باستخدام محولات FEP-الأنابيب والأنابيب.
      ملاحظة: استخدام أنابيب FEP لكافة الاتصالات. قص الطول المطلوب من الأنابيب باستخدام شفرة حلاقة. استخدام محولات أنابيب من لون مختلف لمدخل ومخرج للتحقيق. واسمحوا مضخة تشغيل ل 60 دقيقة الاختيار للتسريبات وفقاعات الهواء. هذه يجب أن لا تكون موجودة.
    7. تعيين المضخة لتدفق معدل 2 ميليلتر الدقيقة والبدء في جمع العينات على الجانب منفذ الأنابيب.
    8. جمع ثلاث عينات بيرفوساتي 30 دقيقة وثلاث عينات متساوية الحجم من الحل في أنبوبة الاختبار 1.5 مل. أخذ العينات متساوية الحجم من أنبوبة الاختبار 1.5 مل كل 30 دقيقة باستخدام ميكروسيرينجي مغمورة في المحلول القياسي في أنبوبة الاختبار 1.5 مل.
    9. تكرار التجربة (5.1.1-5.1.8) إقامة المضخة لتدفق معدل 3 ميليلتر/دقيقة (5.1.7) أن يكون تحقيق انتعاش مقارنة عند استخدام معدلات تدفق نضح مختلفة اثنين.
    10. عند الانتهاء، تتوقف المضخة وشطف الأنبوب بماء مقطر، الإيثانول 70% ودفع الهواء في ذلك. تخزين المسبار في قنينة مملوءة بالماء المقطر نظيفة. أشطف التحقيق بعناية قبل بيرفوسينج في 2 ميليلتر/دقيقة بالماء المقطر قبل التخزين.
    11. تحليل تركيز غلوتامات والاسبارتيت في العينات اللوني (انظر التفاصيل أدناه؛ 6.3).
    12. حساب الاسترداد استخدام المعادلة التالية:
      الاسترداد (%) = (جبيرفوساتي /جدياليسيد الحل) x 100.
  2. دورات ميكرودياليسيس في الانتقال بحرية الفئران
    1. الإجراءات التحضيرية: التحقيق في الإدراج، والاختبار، وضخ ضخ إعداد وبدء
      1. إعداد تحقيقات ميكرودياليسيس لاستخدام الأولى وفقا لدليل المستخدم الصانع وملئها بالحل في المسابقة. قطع حوالي 10 سم قطعة طويلة من أنابيب FEP وتوصيلها إلى cannulas مدخل ومخرج للتحقيق باستخدام أنابيب المحولات ذات ألوان مختلفة.
      2. تأكد من أن الأنبوب اللمسات المحولات مع لا قتلى الفضاء في كافة الاتصالات.
      3. 5.2.1.3-تخدير 24 ساعة قبل التجربة ميكرودياليسيس، بإيجاز الحيوان مع إيسوفلوراني (5% في الهواء) في دائرة التعريفي لحين راقد. إزالة قنية وهمية من دليل استخدام الملقط وعقد رئيس الحيوان بشدة. إدراج التحقيق ميكرودياليسيس، تتمتع بغشاء دياليزينج، في دليل قنية وشركة cannulas ميكرودياليسيس إدراجها في دليل على بواسطة نمذجة الطين.
        تنبيه: لا تدع المسبار اللمس جدران الأكمام مسبار الواقية عند استخراج.
      4. وضع الحيوان في الاسطوانة شبكي والسماح لها باستكشاف أجواء جديدة. الاتصال بنظام تسجيل EEG المربوطة الحيوان كما هو موضح أعلاه (اتبع النقاط 4-2-2 و 4.2.3).
      5. اتبع يقظة والانتقال بحرية حركة الفئران وتوصيل مدخل المسبار المحاقن 2.5 مل مع يتثلم ز 22 إبرة تحتوي على الحل في المسابقة باستخدام محولات الأنابيب. دفع الحل للمسابقة داخل التحقيق إخراج 1 مل من محلول للمسابقة في 10 s دفع المكبس من 2.5 مل حقنه بشكل مستمر. تحقق من وجود قطره السائل التي تظهر على المنفذ. التحقيق الآن جاهزة للاستخدام.
      6. تملأ المحاقن 2.5 مل متصلة بأنابيب FEP بمحولات الأنابيب مع الحل للمسابقة وجبل لهم على مضخة التسريب. بدء تشغيل المضخة في 2 ميليلتر/دقيقة. السماح لها بتشغيل بين عشية وضحاها.
        ملاحظة: استخدام الطول المطلوب من جميع FEP-أنابيب ولكن حساب حجم أنابيب الميت أن تعرف متى ينبغي أن تبدأ في تنشيط ك+ عالية وربط بيانات القياس الكمي بالتغيرات الكيميائية العصبية في دماغ الحيوان. استخدام فقاعة الهواء التي تم إنشاؤها في الأنبوب تحت تدفق العمل لحساب هذه المرة.
    2. جمع عينات من خلال تحفيز EEG تسجيل والبوتاسيوم
      1. تحقق من عدم وجود المضبوطات في ح 3 السابقة لبدء جمع العينات (تسجيلات الفيديو-EEG)، ومواصلة رصد النشاط الاستيلاء أثناء ميكرودياليسيس.
      2. إيقاف المضخة حمل المحاقن مقني FEP-أنابيب يملأ مع الحل للمسابقة. جبل على مضخة مجموعة أخرى من المحاقن 2.5 مل ك+ الحل متصلة أنابيب FEP مع أنابيب المحولات يملأ مع في المسابقة تم التعديل في محلول يحتوي على 100 ملم.
      3. بدء تشغيل المضخة في الدقيقة 2 ميليلتر والسماح لها بتشغيل. لزيادة سرعة ملء الأنبوب، تعيين المضخة في 5 ميليلتر/دقيقة للوقت لملء. التحقق من عدم وجود فقاعات الهواء في النظام. التأكد من أن الأنابيب اللمسات المحولات مع لا قتلى الفضاء في كافة الاتصالات.
      4. اختبار التحقيق إذا كانت جاهزة للاستخدام في الحيوان كما هو موضح أعلاه (5.2.1.5).
        ملاحظة: إذا كان لسبب ما لا يعمل المسبار، تغييره. لهذه الحالات، تبقى بضعة تحقيقات ميكرودياليسيس المعدة جاهزة للاستخدام قرب محطة ميكرودياليسيس-EEG. قطع الكابلات EEG الحيوان وتخدير بإيجاز مع إيسوفلوراني إذا لزم الأمر لتحقيق التغيير.
      5. قم بتوصيل FEP-أنابيب الحقن يملأ مع الحل للمسابقة إلى قنية مدخل للتحقيق في كل الحيوانات وانتظر ظهور انخفاض السائل على طرف المنفذ.
      6. قم بتوصيل منفذ المسبار أنابيب FEP، الأمر الذي يؤدي إلى جمع في أنبوبة الاختبار. إدراج FEP-الأنابيب في أنبوبة الاختبار مغلقة 0.2 مل مع غطاء مثقب. ضمان بقاء الأنبوب في المكان عن طريق تحديد مع قطعة من الطين النمذجة.
      7. الاستمرار في تشغيل المضخة في الدقيقة 2 ميليلتر لمدة 60 دقيقة دون جمع العينات حجته في النظام (العينة صفر).
      8. جمع 5 عينات dialysate على التوالي 30 دقيقة (60 ميليلتر حجم كل منهما) تحت ظروف خط الأساس (التروية مع الحل الطبيعي دجالة). تخزين العينات في الثلج.
      9. حساب الوقت الذي يستغرقه السائل لتمرير من المضخة في رأس الحيوان (هذا يعتمد على حجم القتلى من الأنابيب، أي، وقت فقاعة هواء) والتبديل أنابيب FEP أن يذهب من الحقن التي تحتوي على الحل الطبيعي دجالة بالحقن التي تحتوي على تعديل الحل (100 مم ك+) المسابقة في هذا الوقت دون توقف المضخة. التحقق من عدم وجود فقاعات الهواء في النظام. واسمحوا مضخة تشغيل لمدة 10 دقائق.
        تنبيه: في 10 دقيقة من ارتفاع ك+ التحفيز، تميل الحيوانات لنقل أنفسهم محمومة، وعادة ما يقدم عدد كبير من الكلاب الرطب يهز (التحكم والخروج من الاستيلاء على مجموعة الحيوانات) أو السلوكية نوبات (الصرع الحيوانات)، حتى يكون جاهزاً التدخل من أجل حماية الأنابيب والكابلات من التواء.
      10. بعد 10 دقيقة، تبديل الأنابيب من الحقن التي تحتوي على 100 مم ك+ في المسابقة الحل إلى الحل الطبيعي دجالة والسماح بتشغيل المضخة. عدم إيقاف تشغيل المضخة خلال التغييرات الحل حيث أنه سوف يكون هناك قطره من السائل في نهاية الأنبوب يكون متصلاً بالخط.
      11. من اللحظة التي دياليساتي يحتوي على البوتاسيوم عالية، أي، بعد جمع الموازنة بعد الخامسة dialysate، جمع الكسور دياليساتي كل 10 دقائق (20 ميليلتر) حاء 1 3 جمع عينات dialysate 30 دقيقة إضافية، ووقف مضخة. تخزين العينات في الثلج.
      12. تخزين العينات في-80 درجة مئوية بعد التجربة حتى التحليل [هبلك].
      13. تكرار التجربة ميكرودياليسيس لمدة 3 أيام على التوالي، باستثناء الحادة (24 ساعة) والمجموعة الاستيلاء الأولى، التي ميكرودياليسيس واحدة فقط تنعقد الدورة 24 ساعة بعد سراج الدين أو في غضون 24 ساعة بعد استيلاء العفوية الأولى (الشكل 3).
      14. وعند الانتهاء من كل تجربة، euthanize الحيوان بجرعة مخدر زائدة وإزالة الدماغ لتحقق موضع التحقيق وقطب كهربائي.
  3. إجراءات الوظيفة-ميكرودياليسيس
    1. شطف المسابر المستخدمة ميكرودياليسيس مع الماء المقطر وتخزينها في قنينة مملوءة بالمياه المقطرة النقية حتى الاستخدام التالي.
      ملاحظة: الأغشية التي يعاد استخدامها وقد زادت النفاذية؛ تحقق من استرداد التحقيق قبل استعماله المتكرر.
    2. أشطف ميكرودياليسيس كامل بإعداد (الأنابيب والموصلات والمحاقن) مع الماء المقطر تليها إيثانول 70%. استبدال الإيثانول بالهواء وتخزين المجموعة في بيئة معقمة.
    3. تقسيم العينات dialysate القاعدية إلى 20 ميليلتر الكسور واستخدام جزء واحد فقط من 20 ميليلتر للأحماض الأمينية القاعدية تركيز التحليل. تخزين حجم العينة المتبقية لتحليل إضافي أو المؤكدة في-80 درجة مئوية.
    4. إصلاح العقول في الفورمالين 10% والحفاظ عليها ب تضمين البارافين1. التاج الفرع العقول إلى شرائح ووصمة عار لهم والهيماتوكسيلين ويوزين. دراسة العقل المدبر للتحقيق الصحيح والقطب الموضع1،2.
      ملاحظة: إصلاح العقول في تبريد 2-ميثيلبوتاني وتخزينها في-80 درجة مئوية. استخدام أي الأخرى ثبت تلطيخ على قطاعات النسيج العصبي الذي يسمح لتصور المسالك المسبار وقطب كهربائي.

6-الكروماتوغرافي تحليل غلوتامات واسبارتاتي

  1. إعداد ديريفاتيزينج عامل
    1. مزيج من وحدات كل منها 20:1 (v/v) كاشف أورثوفثالديالديهيدي (أوبا) و 2-mercaptoethanol (5-ME) في القنينة. أغلق القنينة حاجز ضيق كاب والهواء باستخدام.
      تنبيه: تعمل تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية.
    2. دوامة الحل المعدة ووضعه في أوتوسامبلير في منصب لوكيل ديريفاتيزينج.
  2. إعداد عينات دياليساتي
    1. وضع إدراج الزجاج مع الربيع أسفل القنينة أوتوسامبلير البنى 2 مل. إعداد في القنينات لجميع العينات المقاسة في دفعة واحدة.
    2. أخذ عينات الغسيل الكلوي ميليلتر 20 من الثلاجة-80 درجة مئوية والسماح لهم بالذوبان. إزالة 1 ميليلتر من الحل وإضافة 1 ميليلتر من المعايير الداخلية (ق. أ) ل هوموسيريني (50 ميكرومتر) إلى 19 ميليلتر للعينة، ومن ثم العينة تحتوي على 2.5 ميكرون من هو. "الماصة؛" 20 ميكروليتر من عينة الغسيل الكلوي في إدراج الزجاج في قنينة وختم أنه مع حاجز هواء ضيقة.
    3. ضع قارورة تحتوي على العينات في أوتوسامبلير استخدام البرمجيات الكروماتوغرافي لتسمية هذه العينات في مواقفها.
  3. التحليل الكروماتوغرافي العينات لتحديد تركيز غلوتامات والاسبارتيت
    1. تشغيل التحليلات على النظام اللوني السائل مع الكشف عن سبيكتروفلوروميتريك. الكشف عن الأحماض الأمينية بعد 2 دقيقة قبل العمود derivatization مع 20 ميكروليتر من أورثوفثالديالديهيدي/5-mercaptoethanol 20:1 (v/v) إضافة إلى 20 ميكروليتر من عينة.
    2. إعداد النظام لتحليل الأحماض الأمينية. قم بالتبديل في أوتوسامبلير، المضخة، في ديجاسير، الكاشف ووحدة التحكم جنبا إلى جنب مع جهاز الكمبيوتر.
    3. تزج سحب في زجاجات تحتوي على المرحلة المتنقلة وتطهير قنوات المضخة الكروماتوغرافي التي ستستخدم للتحليل.
    4. ابدأ بزيادة تدفق المرحلة المتنقلة التحقق من الضغط على العمود (مثلاً، في بداية 0.2 مل/دقيقة وزيادة التدفق ل 0.2 مل/دقيقة إضافية كل 5 دقائق حتى تحقيق تدفق العمل). السماح للنظام تشغيل العمل في التدفق 0.8 مل/دقيقة على الأقل 1 ح حجته في العمود.
      تنبيه: الضغط غير مستقر يدل على وجود الهواء في النظام. وينبغي أن لا يتجاوز الضغط 25 الآلام والكروب الذهنية.
    5. تعيين المكسب وحساسية عالية وموجات الإثارة والانبعاثات على الكاشف إلى 345/455 نانومتر على التوالي. إعادة تعيين إشارة كاشف (أوتوزيرو).
    6. باستخدام البرمجيات الكروماتوغرافي، إرسال الطريقة للصك. الآن، ينبغي أن يكون اللوني جاهزة لقياس.
    7. فصل العينات dialysate، ارتفعت معيار عينات dialysate، فضلا عن معايير (0.25 ميكرومتر – 2.5 ميكرون اسبارتاتي والغلوتامات في الحل في المسابقة) في العمود الكروماتوغرافي المناسبة. معايرة أسلوب الكروماتوغرافي وإقامة حدود الكشف والتحديد الكمي قبل أي تحليل عينات الغسيل الكلوي.
    8. تنشيط تحليل واحد أو إنشاء تسلسل للعينات تحليلها باستخدام البرمجيات اللوني وتشغيل التسلسل.
      تنبيه: تشغيل نموذج فارغ واحد أو أكثر وعينات قياسية مختلفة ضمن سلسلة عينات دياليساتي من أجل التحكم في دقة الأسلوب.
    9. حالما يتم الحصول تشروماتوجرامس، تحليل لهم مع البرمجيات اللوني. تحقق إدماج قمم الفائدة في هذه المؤامرة المعايرة. استخدام منطقة الارتفاع أو ذروة الذروة للقياس الكمي.
    10. بمجرد الانتهاء من تسجيل العينة ملء العمود والنظام مع مذيب عضوي (مثلاً، الاسيتو الانيتريل 50% في الماء عالي النقاوة) لمنع نموها الشيخوخة والعفن في ذلك.
    11. إيقاف تشغيل النظام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تحقيق الانتعاش

وكان الانتعاش يعني (أي محتوى الأحماض الأمينية يعني في بيرفوساتي كنسبة مئوية من المحتوى الموجود في وحدة تخزين متساوية من الحل القنينة) ± 15.49 0.42% بمعدل تدفق 2 ميكروليتر/min و ± 6.32 0.64 في 3 ميكروليتر/دقيقة الغلوتامات و 14.89 ± 0.36 في المائة بمعدل تدفق 2 ميكروليتر/min و ± 10.13 0.51 في 3 ميكروليتر/دقيقة اسبارتاتي عند استخدام المسبار غشاء كوبروفاني. في حالة استخدام المسبار غشاء ﺍﻟﺍﻛﺭﻳﻟﻭﻧﻳﺗﺭﺍﻟ، كان الانتع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نحن في هذا العمل، يظهر كيف يمكن أن يتم تسجيل الفيديو-EEG مستمر مقرونا ميكرودياليسيس في نموذج تجريبي ل TLE. وتستخدم تقنيات تسجيل الفيديو-EEG لتشخيص المراحل المختلفة لتطور المرض في الحيوانات بشكل صحيح ويتم استخدام تقنية ميكرودياليسيس لوصف التغييرات في الإصدار الغلوتامات التي تحدث في الوقت المناسب (لا تغييرات تم إيجاد اسبارتاتي في دراسة نشرت سابقا2). نوصي بشدة باستخدام الجهاز/زرع واحد للقيام بها في كل الحيوانات على حد سواء للأسباب الواردة في المقدمة.

كلما كان ذلك متاحاً، ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

الكتاب أود أن أشكر Anna بيناشي وباولو رونكون وايليونورا بالما لمساهمتها في المخطوطات المنشورة في الأسبقية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

3 المواد جهاز تكنولوجيا معدات المواد المعدات أنابيب المادية المواد العمود تكوين المقطر
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قنوات القطب الكهربائي الملتويInvivo1 ، بلاستيك واحد ، رونوك ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةMS333 / 3-B / SPC
قنية دليلAgn Tho's ، Lindig & ouml ؛ السويدMAB 4.15.ICمادة
الراتنج KK2 PlastikElettra Sport ، Lecco ، إيطالياKK2مادة
Super Attack gel LoctiteHenkel Italia Srl ، ميلانو ، إيطاليا2047420_71941مادي
إيمالجين كيتامينميريال ، تولوز ، فرنسا221300288 (AIC)محلول
زيلازينسيجما ، ميلانو ، إيطالياX1251مادة
إيزوفلوران البيطريميريال ، تولوز ، فرنسا103120022 (AIC)محلول
ألتادول 50 مجم / مل - ترامادولفورمفيت ، ميلانو ، إيطاليا103703017 (AIC)محلول
جينتالين 0.1٪ CRM - جنتامايسينMSD إيطاليا ، روما ، إيطاليا20891077 (AIC)مادة
البسيط الأسمنت السريع للأسنانKemdent ، Associated Dental Products Ltd ، سويندون ، المملكة المتحدةACR811Material
GlasIonomer CX-Plus CementShofu ، كيوتو ، اليابانPN1167حامل
مشبك مسبارالمواد Agn Tho's ، Lindig & ouml ؛ السويدp / n 100 5001المعدات
Histoacryl® الأنسجة اللاصقة الموضعية الزرقاء، آن أربور ، ميشيغان ، الولايات المتحدة الأمريكيةTS1050044FPمادة
الفاليوم 10 مجم / 2 مل - ديازيبامروش ، مونزا ، إيطاليا019995063 (AIC)مادة
حقنة 1 مل بإبرة 25GVetrotecnica ، بادوفا ، إيطاليا11.3500.05مادة
إبرة تغذية مرنة للفئران 17GAgn Tho's ، Lindig & ouml ؛ السويد7206العشب المادي
Grass Technologies ، Natus Neurology Incorporated ، بليسانتون ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةM665G08(مضخم AS40 ، صندوق الرأس ، كابلات التوصيل ، نموذج Telefactor RPSA S40) الحصول
على البيانات المعيارية و & nbsp ؛ نظام التحليل MP150Biopac, جوليتا, كاليفورنيا, الولايات المتحدة الأمريكيةMP150WSWمعدات
نظام المراقبة بالفيديو الرقميةAverMedia Technologies, فريمونت, كاليفورنيا, الولايات المتحدة الأمريكيةV4.7.0041FDمعدات
الغسيل الكلى المجهري التحقيقAgn Tho's, Lindigö السويدMAB 4.15.1.Cuمسبار
غسيل الكلى المجهريSynaptech ، كولورادو سبرينغز ، كولورادو ، الولايات المتحدة الأمريكيةS-8010
سخان كتلةGrant Instruments ، كامبريدج ، إنجلتراQBD2معدات
النمامCecchinato A ، Aparecchi Scientifici ، ميستري ، إيطاليا711
مضخة ضخUniventor ، Zejtun ، مالطا864معدات
البوليثين غرامة التجويفسميث الطبية الدولية المحدودة ، كين ، نيو هامبشاير ، الولايات المتحدة الأمريكية800/100/100/100محولات
الأنابيب الزرقاءAgn Tho's ، Lindig & ouml ؛ السويد1002المواد
محولات الأنابيب الحمراءAgn Tho's, Lindigö السويد1003مادة
حقنة 2.5 مل مع إبرة 22GChemil ، بادوفا ، إيطالياS02G22غطاء
قارورةCronus ، Labicom ، Olomouc ، جمهورية التشيكVCA-1004TB-100مادة
الحاجزالحراري العلمي ، Rockwoood ، تينيسي ، الولايات المتحدة الأمريكيةالوطنية C4013-60 8 مم TEF / SIL
حاجز مادة إدراج زجاجي مع زنبرك سفليSupelco ، Sigma ، ميلانو ، إيطاليا27400-U
قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكيةللمواد الوطنية العلمية ، Thermo Fisher Scientific ، مونزا ، إيطالياC4013-2
Material Smartline manager 5000 وحدة تحكم النظام ووحدة إزالة الغازاتKnauer ، برلين ، ألمانياV7602معدات
Smartline 1000 مضخة التدرج الرباعيKnauer ، برلين ، ألمانيامعدات V7603
كاشف الطيف الفلوريشيمادزو ، كيوتو ، اليابانRF-551معدات
العمود الكروماتوغرافيKnauer ، برلين ، ألمانيا25EK181EBJمادة
المسبق الكروماتوغرافيKnauer ، برلين ، ألمانياP5DK181EBJمحلول
المرحلة المتنقلة Aعازلة فوسفات الصوديوم 0.1 M ، درجة الحموضة 6.0حل
المرحلة المتنقلة B40٪ 0.1 M عازلة فوسفات الصوديوم ، 30٪ ميثانول ، 30٪ أسيتونيتريل ، درجة الحموضة 6.5
محلول Ringerبالمللي مولار: MgCl 2< / sub> 0.85 ، KCl 2.7 ، كلوريد الصوديوم 148 ، CaCl 2 < / sub >1.2 ، 0.3٪ BSAمحلول
معدل تكوين محلول Ringerفي مللي مولار: MgCl 2< / sub> 0.85 ، KCl 100 ، كلوريد الصوديوم 50.7 ، CaCl 2 < / sub>1.2 ، 0.3٪ محلول BSA
محلول ملحي0.9٪ كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة المعدلة إلى 7.0
محلول السكروزمحلول 10٪ سكروز في محلول الماء

المراجع

  1. Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  2. Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
  3. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  4. Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned? Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
  5. Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
  6. Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
  7. Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
  8. Engel, J. Jr Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
  9. Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
  10. Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82(2013).
  11. Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , 2nd edition, CRC Press/Taylor & Francis. Boca Raton (FL). (2008).
  12. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528(2012).
  13. Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
  14. Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
  15. Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
  16. Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
  17. Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
  18. Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
  19. Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
  20. Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
  21. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
  22. Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
  23. Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
  24. Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
  25. Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
  26. Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
  27. Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
  28. Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
  29. Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
  30. Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
  31. Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
  32. Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
  33. Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
  34. Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
  35. Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
  36. Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
  37. Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 10-27 (2017).
  38. Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, Suppl 4. 28-39 (2017).
  39. Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
  40. Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , London, England. 70-77 (2018).
  41. Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
  42. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
  43. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  44. Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
  45. Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
  46. Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845(2017).
  47. Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
  48. Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
  49. Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
  50. Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
  51. Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
  52. Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
  53. Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
  54. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  55. Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
  56. Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
  57. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
  58. Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
  59. Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
  60. Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
  61. Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
  62. Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
  63. Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
  64. Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
  65. Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
  66. Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
  67. Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239(2017).
  68. Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
  69. Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
  70. Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
  71. Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), Basel, Switzerland. 17981-18008 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ميكرودياليسيس أحماض الأمينية ضادات خلال تسجيلات التخطيط الدماغي في الانتقال بحرية الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.