يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل التعبير الجيني غشائي الخلايا المعرضة للإجهاد باستخدام عدة تدفق مواز-لوحة الدوائر للقص

8.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58478

⸱

أكتوبر 21, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

في هذه المقالة

ملخص

ويرد هنا، سير عمل لتحليل التعبير الثقافة والجينات لخلايا بطانية إجهاد القص السوائل. وشملت ترتيب مادية للسكن ورصد الدوائر التدفق متعددة في بيئة تسيطر عليها، واستخدام الحمض النووي الريبي مرجعية خارجية ل PCR الكمي في الوقت نفسه.

الملخص

يمكننا وصف سير عمل لتحليل التعبير الجيني من خلايا بطانية رهنا بتدفق الصفحي استخدام متعددة رصد تدفق مواز-لوحة الدوائر. خلايا بطانية تشكل البطانة الخلوية الداخلية للأوعية الدموية ومزمن ويتعرض للاحتكاك قوة تدفق الدم يسمى إجهاد القص. في ظل الظروف الفسيولوجية، وظيفة خلايا بطانية حضور مختلف ظروف الإجهاد القص. وهكذا، يمكن أن توفر تطبيق شروط إجهاد القص في نماذج في المختبر مزيد من التبصر في الردود غشائي فيفو. تدفق مواز-لوحة الدائرة المنشورة سابقا بلين et al. 9 يتم تكييفها لدراسة تنظيم الجينات غشائي في وجود وغياب مطرد الاندفاق الصفحي (غير نابض). وتشمل التعديلات الرئيسية في التشكيل للتدفق الصفحي كما عرضت هنا بيئة كبيرة مخصصة للدوائر التدفق المتزامنة البيت، ورصد معدلات التدفق في الوقت الحقيقي، وإدراج إشارة خارجية الحمض النووي الريبي للتطبيع من كمية بيانات PCR الوقت الحقيقي. تقييم العلاجات/شروط متعددة مع تطبيق إجهاد القص، تستخدم دوائر تدفق ومضخات متعددة في وقت واحد داخل حاضنة دافئة وهوميديفيد نفس. يتم قياس معدل التدفق لكل دارة التدفق باستمرار في الوقت الحقيقي لتوحيد شروط الضغط القص في جميع أنحاء هذه التجارب. لأن هذه التجارب قد شروط متعددة، نستخدم أيضا مرجعية خارجية الحمض النووي الريبي التي ارتفعت في وقت استخراج الحمض النووي الريبي لتطبيع استخراج الحمض النووي الريبي وكدنا أول حبلا توليف الكفاءة. هذه الخطوات تقليل التفاوت بين العينات. هذه الاستراتيجية يعملون في خط أنابيب لدينا لتحليل التعبير الجيني مع تجارب إجهاد القص باستخدام الدائرة تدفق مواز-لوحة، لكن أجزاء من هذه الاستراتيجية، مثل الخارجية مرجع المصطلحات الخاصة في الجيش الملكي النيبالي ويمكن بسهولة وفعالية من حيث التكلفة لاستخدامها التطبيقات الأخرى.

المقدمة

خلايا بطانية الأوعية الدموية تشكل البطانة الخلوية الداخلية للأوعية الدموية في نظام القلب والأوعية الدموية المغلقة الأنواع أعلى. وهي تشكل الواجهة بين الدم والأنسجة وتتميز لومينال والأسطح أبلومينال. البطانة هو نظام متنوعة ونشطة، والتكيف الذي ينظم تدفق الدم، والاتجار بالمواد الغذائية، والحصانة، ونمو الأوعية الدموية الجديدة1. في الجسم، وتوجد خلايا بطانية عادة في بيئة حيث يتعرضون للاحتكاك قوة الدورة الدموية، وإجهاد القص2. إجهاد القص منظم هام ل التعبير الجيني غشائي خلية3، وخلايا بطانية محاولة الحفاظ على إجهاد القص داخل نطاق معين2،4. إظهار خلايا بطانية الأوعية الزخرفة في غياب إجهاد القص5 التي يمكن تحسين التروية الأنسجة. الأنماط الإقليمية لتدفق الانزعاج وغيرت القص الإجهاد المرتبطة بالتعبير عن الجينات التحريضية6 وتطوير تصلب الشرايين7،8. وهكذا، النماذج التي تشمل الإجهاد القص مكوناً رئيسيا لفهم تنظيم الجينات بطانية.

يصف لنا طريقة لدراسة تنظيم الجينات في خلايا بطانية الأوعية الدموية تحت إجهاد القص. هذا النظام يستخدم التدفق غير نابض ويقلد مستويات السوائل القص إجهاد وتركيز الأكسجين أن الشروط النموذجية لخلايا بطانية الشرياني. هذا البروتوكول يتضمن تفاصيل عن أساليب لضربة قاضية الجينات باستخدام الإعداد لتطبيق إجهاد القص باستخدام جهاز تدفق مواز-لوحة، وأساليب للمصطلحات الخاصة في إشارة خارجية الحمض النووي الريبي قبل التحليل بالحمض النووي الريبي التدخل ([رني])، المنتسخة العكسية الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-قبكر). هذا الأنبوب يستخدم لدراسة تنظيم الجينات في خلايا بطانية في وجود وعدم وجود إجهاد القص الصفحي ويتضمن تعديلاً لجهاز تدفق مواز-لوحة وصف لين et al. 9-هذا التشكيل خاصة صممت لتيسير تقييم ظروف تجريبية متعددة متزامنة يتيح إجراء مقارنة مباشرة لظروف الإجهاد القص، فضلا عن التطبيع لتحليل الحمض النووي الريبي. وتستخدم وحدة ساخنة كبيرة مع الرطوبة التي تسيطر عليها للسماح لعدة دوائر منفصلة التدفق ومضخات تكون قيد التشغيل في نفس الوقت مع معدلات التدفق التي ترصد لكل تدفق قاعة الجمعية في الوقت الحقيقي. يستخدم تطبيق هذا الإعداد لضربة قاضية الجينات باستخدام [رني] في الإعداد للإجهاد الاندفاق الصفحي/القص، ولكن يمكن تطبيق جوانب من هذا البروتوكول لأي تقييم للتعبير الجيش الملكي النيبالي.

وتشمل نهج مشتركة لتطبيق إجهاد القص لخلايا بطانية موائع جزيئية نظم10ومخروط ولوحة فيسكوميتير11و تدفق مواز-لوحة دائرة12. نظم موائع جزيئية من مختلف الشركات المصنعة كانت مفيدة في دراسة ميتشانوبيولوجي وميتشانوترانسدوكتيون في خلايا متعددة وأنواع الأنسجة ومجموعة متنوعة من المنبهات الفيزيائية الأحيائية. لخلايا بطانية، فقد استخدمت لدراسة خلايا بطانية في العزلة، فضلا عن التفاعل بين خلايا بطانية والاتجار بالمناعة أو ورم الخلايا10. بيد أن هذه النظم أقل ملاءمة لاسترداد عدد كبير من الخلايا9. كل مخروط ولوحة فيسكوميتير وتدفق مواز-لوحة الدوائر السماح باسترداد عدد كبير من الخلايا في مونولاييرس المتلاقية12. هذه النظم يمكن أن تولد مجموعة من القوات وأنماط القص12. الجمعية الدائرة تدفق مواز-لوحة9 له الميزة أن التصوير في الوقت الحقيقي يمكن أن يؤديها من خلال زجاج النافذة لتقييم مورفولوجيا الخلوية في أي وقت. وعلاوة على ذلك، يمكن جمعها في بيرفوساتي تحت ظروف معقمة. لنظام المعروضة هنا، يمكن أيضا رصد التدفق في الوقت الحقيقي، وفي إنشاء قاعة متعددة، مما يسهل الحفاظ على شروط القص بين الدوائر.

للتجارب التمثيلية، وتستخدم الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيك)، التي تمثل نوع خلية بطانية ماكروفاسكولار، وظروف الإجهاد القص نستخدم (1 Pa) تعكس ظروف الشرياني (0.1-0.7 السلطة الفلسطينية). بيد أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها مع أنواع أخرى من الخلايا البطانية وظروف الإجهاد القص يمكن تعديلها وفقا لمسألة تجريبية. على سبيل المثال، يتطلب تقييم الخلايا البطانية البشرية في ظروف نموذج الدورة الدموية الوريدية مستويات أدنى من إجهاد القص (1-6 باسكال) واستخدمت الدراسات نموذج دوران microvascular مستويات الإجهاد القص من 0.4-1.2 السلطة الفلسطينية13 , 14-وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تختلف إجهاد القص حتى بين خلايا بطانية داخل الأوعية الدموية نفس6. يتم استخدام نظام واحد لرصد في التشكيل الحالي، في نفس الوقت الذي يمكن رصد أربع حلقات منفصلة التدفق. للمختبرات التي تحتاج إلى مزيد من الحلقات تدفق، هناك مساحة في بيئة مخصصة لنظام رصد إضافية.

يستخدم qPCR الرايت كوانتيتيشن المطلقة للتعبير الجيني في الإعداد لإجهاد القص. التعبير النسبي للجينات المستهدفة غالباً لمقارنة الحمض النووي الريبي التعبير عبر الشروط. يمكن بعض الأنواع رنا موجودة في كميات منخفضة جداً أو يكون غائبا، مما يعقد القياسات النسبية. على سبيل المثال، يمكن أن تمارس الكشف فضله منذ وقت طويل في خلايا بطانية تأثيرات قوية على أرقام نسخة منخفضة نسبيا لكل خلية5. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي الاختلافات في الكفاءة التمهيدي إلى تفسيراً غير دقيق من استخدام الأسلوب عتبة (Ct) دورة دلتا دلتا لتحليل البيانات. لمعالجة هذا الشاغل، نقوم كوانتيتيشن المطلقة عن طريق توليد منحنى قياسي باستخدام كمية معروفة من بلازميد الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، تكمل تركيب الدنا (كدنا) عملية غير فعالة، ويمكن حساب الفروق في كفاءة كدنا للاختلافات في الحمض النووي الريبي التعبير بين الشروط وبين العينات15. تطبيق إجهاد القص و/أو الكواشف تعداء يمكن أن تؤثر على تكاثر الخلايا والمبرمج والجدوى، أو إضافة المكونات التي قد تتداخل مع توليف الحمض النووي الريبي العزلة و/أو كدنا. لحساب احتمال التحيز من عزل الحمض النووي الريبي وتوليف كدنا، نستخدم المصطلحات خاصة في الجيش الملكي النيبالي تحكم توليفها في المختبر، وأضيف في وقت استخراج الحمض النووي الريبي وتقاس بكل كدنا التوليف عبر RT-قبكر. يسمح هذا التعديل ليس فقط التقنية الاختلافات في توليف الحمض النووي الريبي الاستخراج وكدنا ولكن أيضا يسمح حساب الكميات المطلقة كل خلية، عندما يعرف عدد الخلايا.

يستخدم هذا النظام اتخاذ خطوات إضافية للحفاظ على التشابه أو مراعاة للاختلافات التقنية بين الشروط. نؤكد هذه الخطوات لا سيما بسبب الطبيعة المعقدة لهذه التجارب، التي تنطوي على العديد من الهياكل المادية والظروف التجريبية يمكن أن تؤدي إلى تقلب التجريبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد المراجع الخارجية الجيش الملكي النيبالي

ملاحظة: اختر إشارة خارجية الحمض النووي الريبي غير موجود في الأنواع أو نموذج للفائدة. لأنظمة الثدييات، يمكن استخدام لوسيفراس اليراع الجيش الملكي النيبالي.

  1. استخطاط من مرجعية خارجية الحمض النووي الريبي بلازميد
    1. إعداد مرجعية خارجية الجيش الملكي النيبالي على الأقل 48 ساعة قبل استخراج الحمض النووي الريبي المتوقعة. الحصول على أو تصنيع استنساخ كدنا مرجعية خارجية المختار الجيش الملكي النيبالي، مثل استنساخ كدنا لوسيفراس اليراع في ناقل بلازميد مناسبة للنسخ في المختبر (انظر الجدول للمواد).
    2. أداء هضم إنزيم التقييد (RE) 1 ميكروغرام من بلازميد كامل طول (بلازميد لوسيفراس اليراع من شرطة الأمن العام-لوك + التي قد 4100 bp) كتر واحد باستخدام الطاقة المتجددة (زهوي) في 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب. اختر RE قاطع واحد (تخفيضات بلازميد x 1 فقط) في نهاية 3 'مرجعية خارجية تسلسل الحمض النووي الريبي الذي يترك من 5' عبء أو نهاية غير حادة. لإعداد نموذجي، أداء سبعة ردود استخطاط بلازميد (الخطوات 1.1.4-1-1-7) بالتوازي مع توليد كافية تركيز الحمض النووي الريبي والكمية لإكمال مجموعة واحدة من التجارب أو مشروع واحد.
      1. قياس تركيز بلازميد استخدام كانت أو سبيكتروفلوروميتري.
      2. إعداد أن خليط الطاقة المتجددة في كل أنبوبة: إضافة 4 ميليلتر من زهوي (20,000 وحدة/مل)، 8 ميليلتر من إعادة المخزن المؤقت، x µL بلازميد (1 ميكروغرام)، ويكفي ح2س للتوصل إلى حل مجموع من 80 ميليلتر.
      3. احتضان هذا الخليط RE ح 2 في 37 درجة مئوية. استخدام إعادة وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، كما يمكن أن يؤدي أي تعديلات في زيادة النشاط نجمة أو الانقسام غير محددة الهدف الحمض النووي. إلغاء تنشيط الحرارة رد فعل الخليط لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
      4. إنهاء هضم الطاقة المتجددة مع هطول الأمطار الإيثانول في كل أنبوبة. مباشرة إلى مزيج الطاقة المتجددة، إضافة 4 ميليلتر من 0.5 م يدتا pH 8.0، ميليلتر 8 من م 3 خلات الصوديوم pH 5.2، وميليلتر 184 من الإيثانول 100%. يخلط جيدا وتجميد المخلوط في-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      5. تدور أسفل الخليط عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في قوة الطرد المركزي نسبي (التعاون الإقليمي) من س 16,100 ز.
      6. إزالة المادة طافية مع تلميح جيد، دون لمس بيليه. أيردري بيليه لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في 6 ميليلتر من ح2س (درجة حرارة إلى 37 درجة مئوية) قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 س-10 س.
      7. تأكيد استخطاط بلازميد لوسيفراس عن طريق تشغيل المنتج هضمها على 2% [اغروس] هلام يحتوي على اثيديوم بروميد (أتبر) جنبا إلى جنب مع 1 كيلو بايت + سلم وسلم سوبيركويليد، وقص وتقطيعه بلازميد. فحص الجل والمضي قدما للنسخ في المختبر إذا تبين لين بلازميد قطع عصابة واحدة في ~ 4 كيلو بايت (بلازميد تقطيعه سوف يكون ثلاثة نطاقات؛ الشكل 1).
        تنبيه: أتبر المسببة للسرطان. ويعمل في غطاء الأبخرة كيميائية.
  2. في النسخ المختبر من مرجعية خارجية الحمض النووي الريبي بلازميد
    1. لكل أنبوبة من منتجات بلازميد هضمها، إجراء النسخ في المختبر باستخدام أسلوب نسخ في المختبر (انظر الجدول للمواد). اتبع إرشادات الشركة المصنعة واستخدام بالعاثية المناسبة بوليميريز الحمض النووي الريبي. إذا كان أسلوب التوليف كدنا يتطلب ذيل poly(A)، أو تطبيقات أخرى تتطلب ذيل poly(A)، اختر طريقة النسخ في المختبر الذي يشمل بالإضافة إلى ذيل poly(A) (انظر الجدول للمواد).
    2. الجمع بين كل في المختبر نسخها المنتجات في أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل واحد قبل تنقية.
  3. بوريف إيكاتيون من الجيش الملكي النيبالي من رد فعل النسخ في المختبر
    1. تنقية في المختبر نسخها من المنتجات مع عملية في المختبر نسخ تنظيف كيت (انظر الجدول للمواد). يرجى اتباع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    2. تقييم تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق قياس امتصاص في 260 nm استخدام كانت.
      ملاحظة: يحسب تركيز الجيش الملكي النيبالي باستخدام قانون بير لامبرت. هذا ويذكر أن امتصاص الأحماض النووية (التي تمتص الضوء بشدة على 260 nm) يتناسب مع التركيز. امتصاص 1.0 يساوي 40 ميكروغرام/مل من الحمض النووي الريبي المفرد-الذين تقطعت بهم السبل.
  4. اليقوتينج رصيد الجيش الملكي النيبالي في PCR أنابيب للاستخدام التجريبي
    1. التأكد من تركيز الحمض النووي الريبي 1 ميكروغرام/ميليلتر.
      1. إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي > 1 ميكروغرام/ميليلتر، تضعف الأسهم إلى 1 ميكروغرام/ميليلتر. الكوة 1 ميليلتر في PCR أنابيب وتخزينها في-80 درجة مئوية.
      2. إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي < 1 ميكروغرام/ميليلتر، يمكن أن يؤديها هطول الأمطار إضافية استخدام خلات الأمونيوم م 5 (المتوفرة في مجموعة) وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. إذا كان لا يزال تركيز الحمض النووي الريبي < 1 ميكروغرام/ميليلتر، المضي قدما في اليقوتينج 1 ميليلتر في أنابيب PCR.

2-الشريحة طلاء

ملاحظة: يجب أن تكون الخطوات 2.1-2.10 المنجز ح 24-48 قبل البذر الخلية المتوقعة.

  1. يسخن الفرن إلى 250 درجة مئوية.
  2. استخدام القفازات المعقمة، التفاف كل شريحة زجاجية 2 x مع رقائق الألومنيوم. تجنب لمس سطح الشريحة مباشرة.
  3. خبز الشرائح في الفرن ح 1 في 250 درجة مئوية، والسماح للشرائح لتبرد بدرجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لتدمير أي تلويث الذيفان.
  4. بينما يتم تبريد الشرائح، جعل حل أسهم فيبرونيكتين 1 ملغ/مل بالماء المقطر واحتضان ذلك مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية حل. جعل مختبرين 100 ميليلتر. جانبا مختبرين للاستخدام الفوري وتجميد مختبرين المتبقية للاستخدام في المستقبل.
  5. بسط الغطاء الخارجي من رقائق الألومنيوم قبل وضع الشريحة الزجاجية في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. تنفيذ خطوات 2.6-2.7 و 2.9 في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  6. ضع الشريحة الزجاجية في طبق ثقافة عقيمة خلية 4-بئر مستطيلة.
  7. تمييع فيبرونيكتين حل الأوراق المالية 1: 100 مع الماء المقطر. معطف كل شريحة مع 1 مل من المخفف فيبرونيكتين، قطره قطره، استخدام ماصة. تأكد من أن يتم تغطية الشريحة كله.
  8. احتضان الشرائح الموجودة في العرض حاضنة استنبات الأنسجة في 37 درجة مئوية ح 24-48.
  9. بعد الاحتضان، نضح في فيبرونيكتين عن إمالة الطبق ثقافة الخلية 4-جيدا. تجنب لمس الشريحة مباشرة مع المضخة.

3-خلية البذر على الزجاج الشرائح

  1. عد الخلايا البطانية البشرية في سن مبكرة (مرور 2-5) والبذور ~1.0 × 106 خلايا على كل شريحة الزجاج فيبرونيكتين المغلفة مع 1 مل من وسائل الإعلام (1.0 × 106 خلايا/مل الإعلام). بذور الخلايا 24 ساعة قبل تطبيق الاندفاق الصفحي المتوقعة إذا كان لا معاملة أخرى يتعين القيام بها.
    ملاحظة: تستخدم هذه الأرقام كدليل للتجارب مع ح 24 من التدفق.
    1. ضبط كثافة البذر لتحقيق أحادي الطبقة المتلاقية من الخلايا في وقت الحصاد الخلية واستخراج الحمض النووي الريبي.
  2. السماح للخلايا التقيد بالشريحة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. أضف 3 مل من وسائل الإعلام في كل بئر للطبق ثقافة الخلية لتغطية الشريحة، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ل 24 ساعة مع شركة 5%2.

4-الصغيرة التدخل من الحمض النووي الريبي (siRNA) تعداء

  1. إعداد الخلايا على الشرائح الزجاجية لتجارب siRNA تعداء وتدفق
    1. يتبع البروتوكول في الخطوتين 2 (طلاء الشرائح) و 3 (خلية البذر على الشرائح الزجاجية) لإعداد الشرائح الزجاجية والطلاء لتجارب التدفق.
    2. بذور الخلايا 24 ساعة قبل المعالجة siRNA (48 ساعة قبل تطبيق الاندفاق الصفحي).
    3. بذور الخلايا البطانية البشرية في وسائل الإعلام خالية من المضادات الحيوية في 750,000 إلى 1 × 106 خلايا كل شريحة لتحقيق التقاء 85%-95% في اليوم التالي.
      ملاحظة: يتم استخدام هوفيك في هذا البروتوكول.
  2. إعداد مجمعات كاشف تعداء siRNA-المستندة إلى المادة الدهنية (كل شريحة)
    1. تصميم مخصص سيرناس أو ترتيب premade سيرناس للجين المطلوب من الاهتمام.
      ملاحظة: الخطوات التالية في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
    2. إضافة 6 ميليلتر من siRNA (20 ميكرومتر الأسهم) في ميليلتر 414 من المصل انخفاض المتوسط (انظر الجدول للمواد) وتخلط بلطف بيبيتينج.
    3. تمييع 49.5 ميليلتر من كاشف تعداء مختلطة بلطف على أساس المادة الدهنية (انظر الجدول للمواد) في 130.5 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط.
    4. المزيج بلطف واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    5. الجمع بين سيرناس المخفف وكاشف تعداء على أساس المادة الدهنية وتخلط بلطف واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. المزيج برفق لتجنب تعطيل لمجمعات كاشف تعداء على أساس المادة الدهنية.
      ملاحظة: قد يظهر الحل غائم كنموذج المجمعات.
    6. في حين يتم تشكيل المجمعات، إزالة المتوسطة النمو وتغسل الخلايا 1 x مع انخفاض مصل المتوسطة.
    7. إضافة 2.4 مل من المصل انخفاض المتوسط لكل شريحة.
    8. إضافة 600 ميليلتر من مجمعات كاشف تعداء siRNA-المستندة إلى المادة الدهنية المختلطة بلطف إلى كل لوحة، والصخور لوحة ذهابا وإيابا المزيج. ضمان تركيز siRNA النهائي هو 40 نانومتر. ضمان أن تغطي الشريحة تماما.
    9. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية ح 4.
    10. أضف 1 مل وسائط النمو الخلية خالية من المضادات الحيوية غشائي التي تحتوي على 3 × تركيز المصل البقري الجنين (FBS) العادي دون إزالة الخليط تعداء.
    11. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.

5-حساب معدل تدفق استناداً إلى إجهاد القص المطلوب9

  1. حساب معدل تدفق استناداً إلى تشدد على القص المطلوب وفقا للمعادلة التالية:
    figure-protocol-1
    هنا،
    Q هو معدل التدفق في مل/دقيقة؛
    Τ هو إجهاد القص المطلوب في دينيس/سم2 (1 Pa = دينيس 10/سم2)؛
    w هو عرض الدائرة تدفق لوحة التوازي في سم؛
    h هو ارتفاع تدفق مواز-لوحة الدائرة سم؛
    μ هو اللزوجة من وسائط الإعلام في حزب المحافظين (g/cm·s).
    ملاحظة: تجري تجارب نموذجية إجهاد القص الصفحي (غير-نابض) في سير العمل هذا في τ = 1 السلطة الفلسطينية (دينيس 10/سم2). يمكن أن تقاس باستخدام فيسكوميتير مثل فيسكوميتير مخروط ولوحة μ ويمكن أن تختلف تبعاً لمحتويات الوسائط بما في ذلك المصل وديكستران إضافية9.
  2. ولتحقيق محددة τ (إجهاد القص)، ضبط معدل التدفق و/أو اللزوجة. معدلات تدفق أعلى، قد فصل خلايا ملتصقة من الشريحة. معدلات التدفق عينة مع الدوائر تدفق نموذجية ترد في الجدول 1.

6-إنشاء بيئة مخصصة لرصد النظام ومتعددة تدفق مواز-لوحة الدوائر (الشكل 2)

  1. استخدام وحدة ساخنة كبيرة/حاضنة متعددة الرفوف ووصول الكهرباء الداخلية والأبواب الزجاجية-يشار إلى الشاطئ (البيئة المضمنة مع قابل للتعديل CO2 ) والحرارة – البيت الدوائر التدفق متعددة في وقت واحد للتجارب التي وتتطلب كل من إجهاد القص والمقارنة المباشرة بين اثنين أو أكثر من العلاجات أو النواتج (أي، الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتين).
    ملاحظة: الشاطئ يسمح للرصد المتكرر للدائرة التدفق، بما في ذلك معدل التدفق، دون انقطاع متكرر للبيئة.
  2. ضمان كافية CO2 متاح للتجربة وأن CO2 جهاز العرض بشكل صحيح. ضمان مناسب يتم ملء علبة المياه، حيث لا تكون هناك هوميديفيد الجوية.

7-إنشاء جهاز تدفق مواز-لوحة

ملاحظة: لتصنيع لوحات متوازية، الرجاء راجع لين et al. 9.

  1. اﻷوتوكﻻف التدفق الدائرة لوحات والخزان ويستمتع، وأنابيب، ولويرس لكل إنشاء الدائرة تدفق لوحة التوازي كما هو مبين في الجدول 2.
  2. إنشاء الجمعية حلقة التدفق (الشكل 3).
    1. وضع المناشف المعقمة في السلامة البيولوجية مجلس الوزراء. تجميع النظام حلقة التدفق، أولاً دون تدفق مواز-لوحة الدائرة، في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
    2. تواصل الجمعية الأنابيب بالخزان:
      1. إدراج أنبوب الصلب #14 في حفرة واحدة واثنين #14 أنابيب لينة في الثقوب الأخرى اثنين في عملية النداء الموحد لخزان تدفق. التأكد من أن أحد أنابيب لينة يلامس الجزء السفلي من الخزان كأنابيب تدفق .
      2. ضع 1/16 "اللوير الذكور في نهاية 14 # الصلب أنبوب وإرفاق عامل تصفية عقيمة كتنفيس هواء.
      3. ضع 1/16 "اللوير الإناث في نهاية #14 الناعمة تدفق أنبوب، القادمة من الخزان، ونعلق محبس الحنفية 4-الطريق.
        ملاحظة: لتحليل التعبير الجيني أو دراسات أخرى حيث تحتاج perfusates لم يتم جمعها، ستوبكوكس 2-طريقة يمكن استخدامها بدلاً من ستوبكوكس 4-الطريق في هذا البروتوكول.
      4. ضع 1/16 "اللوير الذكور في نهاية أنبوب تدفق #14 الناعمة، القادمة من الخزان.
    3. توصيل أنابيب تدفق الخزان بأنابيب ضخ: ضع 1/16 "اللوير الإناث في نهاية كل من أنبوب الصلب #13 (مضخة الأنابيب). الاتصال أنبوب تدفق لينة #14 من الخزان إلى أنبوب الصلب #13 بربط 1/16 "لارس الذكور والإناث معا.
    4. توصيل أنابيب ضخ مع الأنابيب 'يستمتع جسر': وضع 1/8 "اللوير الذكور و 1/8" اللوير الإناث في نهاية كل من أنبوب لينة #16. الاتصال 1/16 "اللوير الإناث أنبوب الصلب #13 (في نهاية الأنبوب مضخة التدفق) مع 1/8" اللوير الذكور من أنبوب لينة #16.
    5. تجميع أنابيب ليستمتع تدفق: ضع 3/16 "اللوير الذكور في واحدة من نهاية الأنبوب #25 لينة وكرر هذه العملية للجانب الآخر من يستمتع التدفق. إرفاق نهايات أنابيب لينة #25 مجاناً لكل جانب من يستمتع التدفق.
    6. توصيل أنابيب 'جسر يستمتع' مع أنابيب ليستمتع تدفق: توصيل أنبوب لينة #25 من يستمتع التدفق مع أنبوب لينة #16 'جسر يستمتع' باستخدام 1/8 "اللوير الإناث من جانب #16' يستمتع جسر '3/16 الموضوعة مسبقاً" واللوير الذكور من جانب أنبوب يستمتع لينة #25.
    7. تجميع الأنابيب 'دائرة الجسر':
      1. ضع 1/8 "اللوير الإناث و 1/8" اللوير الذكور في نهاية كل من أنبوب لينة #16 (الأنابيب 'الدائرة جسر').
      2. الاتصال 1/8 "اللوير الإناث' جسر الدائرة 'مع 3/16" اللوير الذكور في أنبوب لينة #25 من نهاية يستمتع التدفق الحر.
      3. في 1/8 "مكان اللوير الذكور (نهاية الحرة) الأنابيب' دائرة الجسر '، محبس الحنفية 4-الطريق.
    8. قم بتوصيل محبس الحنفية 4-الطريق من نهاية الحرة 'دائرة الجسر' محبس الحنفية 4-الطريق من خزان تدفق الأنابيب الناعمة (من الخطوة 7.2.2.3). قم بإغلاق في ستوبكوكس.
    9. إضافة الوسائط إلى الخزان ويستمتع. ل 48-ح التعرض لإجهاد القص، إضافة 35 مل من وسائل الإعلام إلى الخزان ومل 25 إلى يستمتع. ضبط حجم الصوت لوسائل الإعلام استناداً إلى مدة التجربة تدفق وعدد الخلايا في المصنف.
    10. جعل النظام حلقة تدفق المجتمعون إلى المضخة في الشاطئ. وضع أنبوب الصلب #13 (مضخة الأنابيب) في رأس المضخة وتأمينه. فتح في ستوبكوكس.
    11. قم بتشغيل المضخة وزيادة سرعة المضخة ببطء. السماح لوسائل الإعلام تعمم عن طريق نظام حلقة. التحقق من وجود أي تسرب أو انسداد (مثلاً، تراكم الضغط). التأكد من أن وسائل الإعلام هي تتدفق مرة أخرى إلى الخزان.
  3. إنشاء تدفق قاعة الجمعية العامة
    1. ضع 1/8 "اللوير الإناث في نهاية واحدة 16 # لينة أنبوب ونعلق محبس الحنفية 4-الطريق. إرفاق الطرف الحر للأنبوب على الجانب الأيمن من الصفيحة العلوية (تدفق الجانب).
    2. ضع 1/8 "اللوير الذكور في نهاية واحدة 16 # لينة أنبوب ونعلق محبس الحنفية 4-الطريق. إرفاق الطرف الحر للأنبوب على الجانب الأيسر من اللوحة العلوية (الجانبإلى الخارج ).
    3. ضع 1/8 "اللوير الذكور و 1/8" اللوير الإناث في نهاية كل من أنبوب لينة #16 (فقاعة أنابيب فخ). إرفاق الأنابيب فقاعة فخ عن طريق 1/8 "اللوير الذكور. إرفاق محبس الحنفية 4-الطريق إلى الجانب الآخر من الأنابيب عبر 1/8 "اللوير الإناث.
    4. استخدام ملاقط معقمة، نقل الشريحة الزجاجية المصنف الخلية من طبق ثقافة الخلية 4-جيدا للعطلة في أسفل لوحة. ضمان هو مواجهة الجهة المصنفة الخلية من الشريحة الزجاجية.
    5. باستخدام حقنه 10 مل، إضافة 10 مل من وسائل الإعلام الحارة إلى أسفل لوحة داخل الخط الأحمر طوقا حول اللوحة. السماح لوسائل الإعلام للتدفق من خلال الشريحة وتغطية الخلايا. تجنب إضافة الوسائط مباشرة على الشريحة.
    6. بلطف ضع الصفيحة العلوية إلى أسفل لوحة، محاذاة من جانب واحد إلى آخر. تجنب إدخال فقاعات الهواء. برغي اللوحات معا محكم.
    7. إزالة فقاعات الهواء من فخ فقاعة بفتح في محبس الحنفية على الجانب الأيمن من اللوحة (تدفق) والتنظيف بلطف 20 مل الحارة الوسائط باستخدام المحاقن 30 مل. تأكد من مغلق في محبس الحنفية على الجانب الأيسر من اللوحة (التدفق) وأن تتدفق وسائل الإعلام من خلال محبس الحنفية فخ فقاعة (فتح). تجاهل وسائل الإعلام متدفق.
    8. أغلق في محبس الحنفية في فخ فقاعة وفتح في محبس الحنفية على الجانب الأيسر للدائرة (تدفق). رفع الجانب الأيسر (تدفق) من الدائرة بزاوية 45 درجة، وتدفق بلطف 20 مل الحارة الوسائط باستخدام المحاقن 30 مل من الجانب الأيمن (تدفق) من الدائرة لإزالة فقاعات الهواء من الدائرة. يمكن تصور فقاعات من خلال النافذة. تجاهل وسائل الإعلام متدفق.
    9. إغلاق ستوبكوكس على كلا الجانبين للدائرة وكاب. فحص الخلايا بالفحص المجهري.
    10. نقل الدائرة إلى الشاطئ مع نظام حلقة تجميعها مسبقاً.
    11. ببطء تقلل من سرعة المضخة وتوقف المضخة. إغلاق ستوبكوكس على نظام حلقة التدفق لمنع التسرب.
    12. الاتصال الدائرة وحلقة النظام معا عن طريق ستوبكوكس. فتح جميع ستوبكوكس.
    13. بطء زيادة سرعة ضخ وبحث الإعداد لأي تسرب أو انسداد. ضمان وسائط الإعلام يدور في اتجاه واحد، ويعود إلى الخزان.
    14. مكان استشعار التدفق في الأنابيب 'الدائرة جسر' الموجود على الجانب تدفق من الدائرة. تأكد من أن أجهزة الاستشعار هو التوجه بشكل صحيح في اتجاه التدفق.
    15. ضبط سرعة مضخة للحصول على معدل التدفق التي تم حسابها مسبقاً، استناداً إلى إجهاد القص المطلوب.
      ملاحظة: قد تختلف معدل التدفق في الارتفاع والعرض لكل دائرة، وكذلك اللزوجة من وسائط الإعلام.
    16. قم بتشغيل الدبابة2 CO لتحقيق 5% CO2 ووضع علبة مياه داخل الشاطئ.

8-حصاد الخلايا واستخراج الحمض النووي الريبي من الدائرة تدفق

  1. بمجرد اكتمال الفترة الزمنية المطلوبة للتدفق، ببطء تشغيل أسفل سرعة مضخة تمعجية إلى 0 وإيقاف تشغيل الطاقة. بسرعة إغلاق جميع ستوبكوكس مفتوحة وإزالة الدائرة وأنابيب المرفقة مع محبس الحنفية في نهاية كل.
  2. تتخذ الدائرة إلى benchtop نظيفة وفك جميع البراغي لإزالة اللوحة العلوية بلطف. استخدام الملقط إبرة الآنف، إزالة الشريحة الزجاجية من أسفل لوحة ووضعه في طبق استنبات الأنسجة قطر 100 ملم.
  3. تغسل الشريحة مع 10 مل من المحلول الملحي الباردة مخزنة الفوسفات (PBS)-/-وفحص الخلايا تحت مجهر لتأكيد تمسك الخلية والمحاذاة في اتجاه التدفق.
  4. نضح برنامج تلفزيوني من اللوحة ونقل الشريحة إلى طبق قطره نظيفة 100 مم. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل من استخراج الحمض النووي الريبي كيت (انظر الجدول للمواد)، الذي يحتوي على 1/100 من بيتا-ميركابتوثانول، إلى الشريحة.
    تنبيه: إضافة ميركابتوثانول بيتا في غطاء الأبخرة كيميائية.
  5. تتخلص من الخلايا خارج الشريحة باستخدام مكشطة خلية البولي إثيلين البيضاء. إمالة، طبق استنبات الأنسجة، تمكن السائل إلى تجمع في الجزء السفلي، وإزالة الشريحة الزجاجية بالملقط. "الماصة؛" الخلية في أنبوب 1.5 مل وإبقائه على الجليد.
  6. تضعف إشارة خارجية الأسهم الحمض النووي الريبي (لوسيفراس الرنا) إلى 0.0025 نانوغرام/ميليلتر من خلال تمييع المسلسل قبل إضافته إلى النموذج. على سبيل المثال، إذا كان تركيز المخزون 1 ميكروغرام/ميليلتر، إضعاف 1/000 400 من اللازم لتحقيق 0.0025 نانوغرام/ميليلتر. إضافة 10 ميليلتر من إضعاف الجيش الملكي النيبالي لوسيفراس لكل عينة من خلية لعزل الحمض النووي الريبي المتلقين للمعلومات والتحليل.
  7. المضي قدما في البروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، أو تجميد في-80 درجة مئوية حتى تتمكن من المضي قدما في الاستخراج.

9-حساب كفاءة "استخراج الحمض النووي الريبي" وكدنا التوليف

ملاحظة: حساب كفاءة لوسيفراس بعد الرايت قبكر بمقارنة العائد النظرية والتجريبية العائد.

  1. تحديد العائد النظري لوسيفراس الجيش الملكي النيبالي.
    1. تحديد المبلغ الإجمالي لنسخ لوسيفراس أضيف كل عينة. (إضافة 0.025 نانوغرام/عينة = 2.73 × 107 نسخ من لوسيفراس الجيش الملكي النيبالي كل عينة قبل استخراج الحمض النووي الريبي.)
    2. حساب الكتلة الجزيئية من لوسيفراس الجيش الملكي النيبالي باستخدام متوسط كتلة جزيئية كل النوكليوتيدات من 330 غ/مول، وضرب من قبل طول لوسيفراس اليراع الجيش الملكي النيبالي، النيوكليوتيدات 1652.
    3. تقسيم مبلغ لوسيفراس الجيش الملكي النيبالي وأضاف (0.025 نغ) لكل عينة قبل استخراج الحمض النووي الريبي بالكتلة الجزيئية تسفر عن كمية المولى. ثم، أن تتضاعف بعدد أفوجادرو أن تسفر عن النسخ إضافة كل عينة.
    4. حساب العائد النظري لنسخ لوسيفراس لكل رد فعل RT-قبكر باستخدام المعادلة:
      figure-protocol-2
  2. حساب العائد التجريبية لنسخ لوسيفراس لكل رد فعل RT-قبكر باستخدام بلازميد لوسيفراس لإنشاء منحنى قياسي ل RT-قبكر.
  3. حساب كفاءة لوسيفراس (%) باستخدام المعادلة:
    figure-protocol-3

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وأكد استخطاط ناجحة من بلازميد لوسيفراس استخدام إنزيمات تقييد تشغيل منتجات الهضم على [اغروس] هلام (الشكل 1). وأكد حجم المنتج خطية باستخدام الحمض النووي سلالم والمقارنة مع بلازميد تقطيعه.

ونحن قد تكيفت إنشاء الدائرة تدفق مواز-لوحة من لين et al. 9 للتجارب التي تتطلب ظروف/علاجات متعددة مع إجهاد القص أو ظروف الإجهاد القص متعددة. نحن نستخدم بيئة مكرسة، الشاطئ، والتي يمكن أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إجهاد القص هو شرط الفسيولوجية التي ينظم وظيفة بطانية، جزئيا، بالتأثير على الجينات الحالة المستقرة التعبير2،5. نماذج لتنظيم الجينات في مختلف ظروف الإجهاد القص سوف يسهم في مزيد من فهم لوظيفة غشائي. يقوم سير العمل هذا عملي يتضمن دارة تدفق باستخدام دائرة التوازي-لوحة تدفق مقتبس من لين et al. 9 ويمثل التدفق الصفحي، غير نابض. أن البنية العامة صممت لتيسير التجارب التي تتطلب عدة تدفق الدوائر والحد من تقلب التجريبية في هذا الإعداد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

هذا العمل كان يدعمها استوفوا باتاكا 142307 إلى P.A.M. H.S.J.M. مستلم الكندية المعاهد من صحة البحث برنامج التدريب في "زمالة الطب التجديدي". H.S.J.M.، A.N.S.، K.H.K.، M.K.D.، وهي المتلقية "الملكة إليزابيث الثانية الدراسات العليا المنح الدراسية" في مجال العلم والتكنولوجيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ Trypsin-EDTAgibco25300-062
10 مل حقنةBD302995
10 مم 2< / sup> طبق الثقافةSarstedt83.3902
30 مل حقنةBD302832
4-WayStopcocks DiscofixD500
رقائق
BEACHDarwin ChambersMN: HO85 ، SN: 4947549
Cell Scrapers
CO2< / sub> MeterBioSphenix، Ltd.MN: P120 ، SN: 0342
CO2< / sub> SensorBioSphenix، Ltd.MN: C700 ، SN: 52852
الماء المقطرgibco15230-170
ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) -/-gibco14190-144
Endothelial Cell Growth Medium 2Promo CellC-22011
Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement MixPromo CellC-39216
Fibronectin (نقي)11051407001
(0.20 ميكرومتر)Sarstedt83.1826.001
مخمد التدفق وغطاءU من متجر
مقياس التدفق: 400 سلسلة وحدة التحكمTransonic Scisense Inc.T402
مقياس التدفق: 400 سلسلة الأنابيبعبر الصوت Scisense Inc.TS410
خزان التدفق والغطاءU من متجر
T مستشعر التدفقTransonic Scisense Inc.ME4PXL
Isotemp 737F فرنفيشر ScientificFI-737F
J قماشمن القماش
(25 × 75 × 1 مم)Fisherfinest12-544-4
حقيبة تعقيم الورقCardinal Health92713
(محرك اقتصادي Masterflex L / S) كولبارمر7554-90
رأس المضخة (Masterflex L / S سهل التحميل)Cole-Parmer7518-00
مستطيل 4 صحنحراري267061
علمي ملاقط
<قوي>الاسم < / قوي ><قوي> الشركة< / قوي ><قوي>رقم الكتالوج < / strong > التعليقات < strong >
tubing< / قوي>
Masterflex C-Flex L / S 25 الأنابيب الناعمةCole-Parmer06424-25
Masterflex C-Flex L / S 14 الأنابيب الناعمةCole-Parmer06424-14
Masterflex C-Flex L / S 16 الأنابيب الناعمةCole-Parmer06424-16
Masterflex PharMed BPT L / S 13 الأنابيب الصلبةCole-Parmer06508-13
Masterflex PharMed BPT L / S 14 الأنابيب الصلبةCole-Parmer06508-14
Name< / strong>Company< / strong> Catalog Number< / strong>Comments< strong>
Luer < / strong>
3/16" ذكر LuerCole-Parmer45518-08ل # 25 الأنابيب
1/8 "ذكر لوركول بارمر30800-24ل # 16 أنابيب
1/8" أنثى لوركول بارمر30800-08ل # 16
أنابيب 1/16 "ذكر لوركول بارمر45518-00ل # 14 أنابيب
1/16" أنثى لوركول بارمر45508-00ل # 14 أنابيب
<قوية>الاسم< قوي><قوي>الشركة رقم الكتالوجComments
Knockdown recodes
Oligofectamine ReagentInvitrogen12252-011
Opti-MEM I Reduced Serum Mediumgibco31985-070
Name< strong>company< / strong> Catalog NumberComments
In vitro< / em> نسخ < / strong>
Generuler 1kb + سلم الحمض النوويThermo ScientificSM1331
MEGAclear KitAmbionAM1908
مجموعة النسخ mMESSSEGE mMACHINE SP6AmbionAM1340
pSP-luc +PromegaE4471
سلم الحمض النووي فائق الالتفافنيو إنجلاند BioLabs Inc.N0472S
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500
UltraPure Ethidium BromideInvitrogen15585011
XhoI< / em> إنزيم تقييدنيو إنجلاند BioLabs Inc.R0146S
NameCompany Catalog NumberComments
RNA استخراج
Beta-mercaptoethanolSigmaM3148-100mL
RNeasy Mini KitQiagen74104
الألومنيومشركة محلول مرشح Sigma-Aldrichنفخ الزجاج Tنفخ الزجاج J شريحة مجهر مضخة صحن

المراجع

  1. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
  2. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  3. Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  4. Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
  5. Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
  6. Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  7. Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645(2015).
  8. Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
  9. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349(2012).
  10. Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
  11. Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
  12. Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
  13. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  14. DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20(2017).
  15. Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
  16. Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
  17. Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
  18. Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984(2014).
  19. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
  20. Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحليل التعبير الجيني غشائي الخلايا المعرضة للإجهاد باستخدام عدة تدفق مواز-لوحة الدوائر للقص
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.