مقالة منهجية

تقنيات Phenotyping ميكرون-مقياس الذرة حزم وعائية استناداً إلى التصوير المقطعي بالأشعة السينية ميكروكومبوتيد

DOI:

10.3791/58501

⸱

أكتوبر 9, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم طريقة جديدة لتحسين تباين امتصاص الأشعة السينية الذرة الأنسجة مناسبة لفحص التصوير المقطعي ميكروكومبوتيد العادية. استناداً إلى صور الأشعة المقطعية، نقدم مجموعة من مهام سير العمل في تجهيز الصور لمختلف المواد الذرة لاستخراج فعالة تعمل مجهرية من حزم وعائية من الذرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من الضروري أن دقة قياس الهياكل التشريحية الذرة المواد استناداً إلى تقنيات تحليل الصورة الفائق. هنا، نحن نقدم إعداد نموذج 'بروتوكول' لمواد الذرة (أي، الجذعية، ورقة، وجذر) مناسبة للعاديين ميكروكومبوتيد التصوير المقطعي (الصغرى-CT) المسح الضوئي. استناداً إلى صور عالية الاستبانة الأشعة المقطعية الجذعية الذرة وأوراق وجذور، يصف لنا بروتوكولين لتحليل حزم وعائية المظهرية: (1) استناداً إلى صورة الأشعة المقطعية الجذعية الذرة ونبات، قمنا بتطوير خط أنابيب تحليل صورة معينة استخراج تلقائياً 31 والسمات المظهرية 33 من حزم وعائية؛ (2) استناداً إلى سلسلة صورة الأشعة المقطعية لجذر الذرة، علينا إعداد نظام تجهيز صورة للتجزئة (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد للسفن ميتاكسيليم، واستخراج ثنائي الأبعاد (2-d) والسمات المظهرية ثلاثي الأبعاد، مثل الحجم والمساحة للسفن ميتاكسيليم، إلخ بالمقارنة مع القياس اليدوية التقليدية من حزم وعائية المواد الذرة، البروتوكولات المقترحة إلى حد كبير تحسين كفاءة ودقة ميكرون-المقياس الكمي المظهرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعمل النظام بالأوعية الدموية الذرة من خلال مصنع كامل، من الجذر والساق للأوراق، التي تشكل مسارات النقل الرئيسية لإيصال المياه والمغذيات المعدنية والمواد العضوية1. وظيفة هامة أخرى من الأوعية الدموية لتوفير الدعم الميكانيكي لنبات الذرة. على سبيل المثال، ارتباطاً وثيقا التشكل وعدد وتوزيع حزم وعائية في الجذور والسيقان المقاومة السكن لنباتات الذرة2،3. في الوقت الحاضر، دراسات عن التشريحي من حزم وعائية أساسا استخدام التقنيات المجهرية وأولتراميكروسكوبيك لعرض الهياكل التشريحية لجزء معين من جذع، أوراق، أو الجذر، وثم قياس وحساب هذه الهياكل من مصلحة التحقيق اليدوي. ولا شك أن القياس اليدوي لمختلف هياكل مجهرية في ميكرويماجيس على نطاق واسع هو عمل شاقة للغاية وغير فعالة ويحد بشدة من دقة الصفات ميكروفينوتيبيك، نظراً لعدم الموضوعية وعدم تناسق4، 5.

الذرة لا النمو الثانوي، ومحتوى الخلية يتكون أساسا من الماء في أرض الابتدائية. دون أي معالجة مسبقة، عينات جديدة من الذرة الأنسجة يمكن مباشرة مسحها ضوئياً باستخدام جهاز الأشعة المقطعية الصغرى؛ ومع ذلك، نتائج المسح ربما الفقراء والخام. الأسباب الرئيسية التي تتلخص فيما يلي: كثافة التوهين منخفضة (1) من الأنسجة النباتية، أسفر على النقيض منخفضة العدد الذري والضوضاء عالية في الصور؛ (2) المواد النباتية الطازجة المعرضة ليذوي ويتقلص خلال البيئة المسح العادي، كما أفاد دو6. وقد أصبحت المشاكل المذكورة أعلاه القيود الرئيسية لتطوير وتطبيق تكنولوجيا ميكروفينوتيبينج للذرة والقمح، والأرز، وأخرى مونوكوتيليدونس. نقدم لك هنا، في 'بروتوكول إعداد نموذج' بريتريات العينات الجذعية الذرة وأوراق وجذور. يتجنب هذا البروتوكول بالجفاف والتشوه للمواد النباتية أثناء التصوير المقطعي المسح؛ وهكذا، أنها مفيدة لزيادة وقت حفظ العينات النباتية مع نونديفورميشن. وعلاوة على ذلك، يعزز خطوة الصباغة استناداً إلى اليود الصلبة أيضا على النقيض المواد النباتية؛ وهكذا، فإنه يجعل تحسينات كبيرة في نوعية التصوير الجزئي-قيراط وعلاوة على ذلك، قمنا بتطوير برامج معالجة الصورة، اسمه فيسيلبارسير، معالجة الصور المقطعية للذرة السيقان والأوراق. يدمج هذا البرنامج مجموعة من أنابيب تجهيز الصور لإجراء تحليل phenotyping الفائق والتلقائي للصور المقطعية 2-د من الأنسجة النباتية المختلفة. الحزم الوعائية في المقطع العرضي كامل الجذعية الذرة وأوراق يتم الكشف عن واستخراج وتحديد باستخدام أسلوب معالجة الصور تلقائي. نتيجة لذلك نحصل على 31 تعمل مجهرية الجذعية الذرة وتعمل مجهرية 33 نبات الذرة. سلسلة الصور المقطعية جذر الذرة، قمنا بتطوير نظام معالجة الصور لاكتساب الصفات المظهرية ثلاثي الأبعاد للسفن ميتاكسيليم. هذا المخطط أعلى في الكفاءة للحصول على الصور وإعادة الإعمار مقارنة بالأساليب التقليدية.

تشير هذه النتائج إلى أن الصورة تجهيز أنابيب النظر في خصائص التصوير للأشعة السينية العادية الصغيرة-CT توفر وسيلة فعالة ل phenotyping مجهرية من حزم وعائية؛ الغاية هذا يوسع تطبيقات تقنيات الأشعة المقطعية في علم النبات، ويحسن phenotyping التلقائي للمواد النباتية في القرار الخلوي6،7.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-نموذج إعداد بروتوكول

  1. لأخذ العينات، جمع الساق، ليف، والجذر من نباتات الذرة الطازجة وتقسيمها إلى ثلاثة أنواع من مجموعات العينة (كل مجموعة مع تكرار أربعة). ثم قطع منها إلى شرائح صغيرة باستخدام شفرة جراحة على النحو التالي: (1) خفض جزء الأوسط تنبع internode 1-1.5 سم في الطول؛ (2) قطع جزء من العرض الأقصى لنبات 0.5-3 سم في الطول على طول الاتجاه الرأسي مع المنطلق الرئيسي؛ (3) قطع جزء من جذر التاج 0.5 سم في الطول.
  2. لتثبيت القوات المسلحة اﻷنغولية، نقع في الجزء المتعلق بعينه في التوصل إلى حل القوات المسلحة اﻷنغولية (90:5:5 v/v/v، 70% إيثانول: 100% فورمالدهايد: 100% حمض الخليك) على الأقل 3 د.
  3. تنفيذ الإجراء الجفاف في التدرجات متسلسلة الإيثانول الستة (أي، 30%، 50%، 70%، 85%، 95% و 100%)، وتعيين وقت تجهيز كل معامل الإيثانول ك 30 دقيقة.
  4. ضع المواد النباتية في سلال عينة المقابلة مصنعة باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد؛ بعد ذلك، نقل بسرعة سلال عينة إلى خلية نموذج نظام تجفيف نقطة حرجة2 CO. تعيين معلمات التجفيف كما يلي:
    (1) CO2 في: سرعة. حامل الحشو: 100%.
    (2) تهمة: CO2 رسوم تأخير 120 s في الدورة. تبادل السرعة: 5-دورة رقم: 12.
    (3) الغاز بها: الحرارة، سريع. السرعة: بطيئة، 50%.
    1. ووفقا للاختلافات المورفولوجية لجذر الذرة، الجذعية، وأوراق، والتصميم وسلال عينة الطباعة باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد (مثلاً، الشكل 1).
  5. ضع المواد النباتية المجففة (جذر الذرة، ووقف، أو أوراق) في أنبوب 50 مل الطرد مركزي مع 2 غرام اليود الصلبة صبغ المواد النباتية مع بخار اليود متقلبة، وبعد ذلك، وضع الأنابيب في غرفة معتمة ح 4-5.

2-الصغرى-ط م المسح الضوئي البروتوكول

  1. إجراء مسح ضوئي إلى البيانات المقطعية الخام، تعيين ط م المسح الضوئي المعلمات على النحو التالي: 40 كيلو فولت/250 µA (للساق والأوراق) أو 34 كيلوفولت/210 µA (للجذر). تعيين المقابلة فحص النطاقات لأحجام مختلفة وكميات من المواد النباتية المستخدمة، وضبط أحجام بكسل التصوير على النحو التالي: 2، 0 ميكرومتر (لجذر الذرة) و 6.77 ميكرومتر (لوقف الذرة) 10.0 ميكرومتر (بالنسبة لنبات الذرة الصفراء).
  2. لإعادة بناء صور شريحة، تحويل البيانات المقطعية الخام إلى CT شريحة الصور بدقة 2 ك (2,000 x 2,000 بكسل) استخدام برنامج إعادة بناء صورة. وترد تفاصيل أكثر في "دليل المستخدم نريكون" (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).

3-صورة بروتوكول تحليل لصورة الأشعة المقطعية واحدة الجذعية الذرة أو نبات

ملاحظة: استخدم برامج التصوير التلقائي لحزم وعائية إجراء تحليل فينوتيبينج لحزم وعائية داخل الصور المقطعية شريحة الجذعية الذرة ونبات (الشكل 2). يتم وصف الخطوات استخدام البرمجيات كما يلي.

  1. تعيين نوع الجهاز تهيئة خوارزمية مختلفة خطوط الأنابيب. انقر فوق الزر معلمات الأسلوب وحدد الجذعية الذرة أو نبات الذرة في مربع القائمة المنسدلة الأولى.
  2. لاستيراد الصور، انقر فوق الزر إدارة البيانات وتعيين دليل عمل، واستيراد تلقائياً جميع الصور الشريحة في هذا الدليل. حدد واحد أو شريحة متعددة من الصور في صورة خطوط الأنابيب.
  3. تحديد حجم بكسل الفعلي للصورة. انقر فوق الزر معلمات الأسلوب وقم بإدخال حجم بكسل الفعلي للصورة في عنصر تحرير لحجم بكسل.
  4. لحساب فينوتيبينج، انقر فوق الزر حساب فينوتيبينج لاستخراج السمات المظهرية الحزم الوعائية لكل شريحة مختارة الصور تلقائياً.
  5. انقر فوق الزر التحليل الإحصائي لإخراج النتائج كتنسيق ملف TXT أو CSV.

4-صورة تحليل البروتوكول لسلسلة صورة الأشعة المقطعية لجذر الذرة

ملاحظة: تستخدم سلسلة صورة الأشعة المقطعية لجذور الذرة لاستخراج هياكل السفن ميتاكسيليم باستخدام برنامج معالجة الصور ثلاثية الأبعاد. فيما يلي الخطوات الرئيسية.

  1. استيراد الصور أعيد بناؤها من جذور الذرة (في تنسيق ملف BMP) وتحديد معالم تباعد دقيقة (حجم فوكسل [أي، x, y, z]). استخدم أداة غاوسي العودية لتنعيم هذه الصور لتحسين جودة الصورة.
  2. إجراء تقسيم ثلاثي الأبعاد للسفن ميتاكسيليم بضبط معايير الحد الأدنى؛ يقوم هذا بإنشاء تسمية لون موحد لكل سفينة ميتاكسيليم متصلة.
  3. تحسين وتحديد السفن ميتاكسيليم بشكل تبادلي باستخدام مورفولوجيا، أحادي المعامل، وعمليات ملء الفيضانات.
  4. القيام بالتعمير حجم التصور وسطح السفن. استخدام أداة قناع الإحصاءات لعد وقياس السمات المظهرية سفينة في مستويات ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول إعداد نموذج مناسب للمسح الجزئي-الأشعة المقطعية العادية لا يمنع تشوه الأنسجة النباتية، بل يعزز أيضا على النقيض من امتصاص الأشعة السينية. يتم تفحص المواد النباتية pretreated باستخدام نظام الأشعة المقطعية الصغرى إلى صور شريحة عالية الجودة، وأعلى دقة يمكن أن تصل إلى 2 ميكرومتر/بكسل. ويبين الشكل 4 مايكرو-CT الصور الممسوحة ضوئياً الجذعية، ورقة، وجذر، وعلى النقيض من الصورة تحسنا كبيرا بالمقارنة مع النتائج التي تم مسحها ضوئياً من المواد النباتية الطازجة. في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع التطبيق الناجح لتكنولوجيا الأشعة المقطعية في مجالات الطب الحيوي وعلوم المواد، هذه التكنولوجيا قد تم تدريجيا في مجالات علم النبات والزراعة، وتشجيع البحوث في علوم الحياة النباتية كأداة تقنية واعدة . في أواخر التسعينات، استخدمت تكنولوجيا الأشعة المقطعية أولاً لدراسة هياكل المورفولوجية وتطوير نظم جذور النباتات. في العقد الماضي، أصبحت أداة قوية وغير تدميري لعلماء الأحياء النباتية السنكروتروني حركة، وقد استخدمت بنجاح للتعرف على هياكل الأنسجة من العنب الأوعية الدموية8وهيكل الأنسجة من أوراق نبات

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أيد هذا البحث الوطني طبيعة العلم مؤسسة في الصين (No.31671577)، العلم والتكنولوجيا الابتكار الخاص البناء يمول البرنامج من بكين أكاديمية الزراعة والغابات Sciences(KJCX20180423)، البحوث برنامج التنمية للصين (2016YFD0300605-01)، ومؤسسة العلوم الطبيعية بكين (5174033)، بكين بعد الدكتوراه بحوث مؤسسة (2016 ZZ-66)، وأكاديمية بكين للزراعة والحراجة العلوم منحة (KJCX20170404)، ( JNKYT201604).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Skyscan 1172 نظام التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينيةBruker Corporation ، بلجيكاNAلنظام
تجفيف النقطة الحرجة CO2< / sub> (Leica CPD300) شركةLeica Corporation ، ألمانياNAلتجفيف
العينة الإيثانولأيNAلتثبيت FAA
الفورمالديهايدأيNAلتثبيت FAA
خليك حمضأيNAلتثبيت FAA
شفرة جراحيةأيNAلقطع عينة sgements
طابعة ثلاثية الأبعادMakerbot replicator 2 ، MakerBot Industries ، الولايات المتحدة الأمريكيةNAلطباعة سلال عينة من جذر الذرة ، الجذعية ، وأنبوب
الطرد المركزيللأوراق Corning ، الولايات المتحدة الأمريكيةNAضع مواد الجذر أو الجذع أو الأوراق
اليود الصلبأيNAلعينة صباغة
برنامج SkyScan NreconSkyScan NRecon ، الإصدار: 1.6.9.4 ، شركة بروكر ، بلجيكاNAلإعادة بناء الصور
برنامج SselParserVesselParser ، الإصدار: 3.0 ، المركز الوطني للبحوث الهندسية لتكنولوجيا المعلومات في الزراعة (NERCITA) ، بكين ، الصينNAبروتوكول تحليل الصور لصورة التصوير المقطعي المحوسب المفردة لجذع الذرة أو ورقة
ScanIPScanIP، الإصدار: 7.0; Simpleware ، إكستر ، المملكة المتحدةNA3D برامج معالجة
الصور قفازات اللاتكسأيملاقط NA
أيNA

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
  2. Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
  3. Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
  4. Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
  5. Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
  6. Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
  7. Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
  8. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162(2013).
  9. Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
  10. Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
  11. Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
  12. Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
  13. Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
  14. Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
  15. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295(2013).
  16. Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
  17. Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673(2014).
  18. Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26(2015).
  19. Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
  20. Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655(2015).
  21. Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة