طريقة الأوتوراديوغرافية الكمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في فيفو

R. Michelle Saré; Anita Torossian; Michael Rosenheck; Tianjian Huang; Carolyn Beebe Smith

doi:10.3791/58503

مقالة منهجية

طريقة الأوتوراديوغرافية الكمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في فيفو

DOI:

10.3791/58503

⸱

يونيو 28, 2019

R. Michelle Saré¹ , Anita Torossian¹ , Michael Rosenheck¹ , Tianjian Huang¹ , Carolyn Beebe Smith¹

¹Section on Neuroadaptation and Protein Metabolism, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخليق البروتين هو عملية بيولوجية حاسمة للخلايا. في الدماغ، وهو مطلوب للتغيرات التكيفية. قياس معدلات تخليق البروتين في الدماغ سليمة يتطلب اعتبارات منهجية متأنية. هنا نقدم L-[1-¹⁴C]-leucine طريقة أوتوراديوغرافية كمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في الجسم الحي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مطلوب تخليق البروتين لتطوير وصيانة وظيفة الخلايا العصبية وتشارك في التغيرات التكيفية في الجهاز العصبي. وعلاوة على ذلك، يعتقد أن خلل تنظيم تخليق البروتين في الجهاز العصبي قد يكون النمط الظاهري الأساسي في بعض اضطرابات النمو. قياس دقيق لمعدلات تخليق البروتين الدماغي في النماذج الحيوانية مهم لفهم هذه الاضطرابات. تم تصميم الطريقة التي قمنا بتطويرها ليتم تطبيقها على دراسة الحيوانات مستيقظا، تتصرف. بل هو طريقة أوتوراديوغرافيا كمية، لذلك يمكن أن تسفر عن معدلات في جميع مناطق الدماغ في وقت واحد. ويستند الأسلوب على استخدام الأحماض الأمينية التتبع، L-[1-¹⁴C] -ليوسين، ونموذج حركي لسلوك L-ليوسين في الدماغ. اخترنا L-[1-¹⁴C]-ليوسين كما التتبع لأنه لا يؤدي إلى المنتجات الأيضية خارج المسمى. يتم دمجها إما في البروتين أو استقلاب بسرعة لإنتاج ¹⁴CO₂الذي يتم تخفيفه في مجموعة كبيرة من CO₂غير المسمى في الدماغ. كما تسمح الطريقة والنموذج بمساهمة ليوسين غير المسمى المستمد من الانُسِّال الأنسجة يُستمد من الانُسِّما الأنسجة في مجمع السلائف للأنسجة من أجل تخليق البروتين. هذه الطريقة لديها القرار المكاني لتحديد معدلات تخليق البروتين في الخلايا وطبقات neuropil، فضلا عن النوى العصبية تحت المهاد واليورانيوم. وللحصول على بيانات كمية موثوقة وقابلة للاستنساخ، من المهم التقيد بالتفاصيل الإجرائية. هنا نقدم الإجراءات التفصيلية للطريقة الكمية الأوتوراديوغرافية L-[1-¹⁴C]-leucine لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين في الجسم الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخليق البروتين هو عملية بيولوجية هامة مطلوبة للتغيير التكيفي على المدى الطويل في الجهاز العصبي¹. تثبيط تخليق البروتين كتل تخزين الذاكرة على المدى الطويل في كل من اللافقاريات والفقاريات². تخليق البروتين ضروري للحفاظ على المراحل المتأخرة من بعض أشكال التقوية طويلة الأجل (LTP) والاكتئاب على المدى الطويل (LTD)³، بقاء الخلايا العصبية أثناء التنمية⁴، وللصيانة العامة للخلية العصبية ولها اتصالات متشابك⁵. قد يكون قياس معدلات تخليق بروتين الدماغ أداة هامة لدراسة التغيرات التكيفية وكذلك اضطرابات النمو العصبي والاضطرابات المتعلقة بالتعلم والذاكرة.

لقد قمنا بتطوير طريقة لتحديد معدلات تخليق البروتين الدماغي في الجسم الحي في الحيوان مستيقظا الذي يقدم مزايامتأصلة على التقنيات الأخرى التي تقدر معدلات في الجسم الحي السابق أو في المختبر الاستعدادات من أنسجة الدماغ 6. قبل كل شيء هو التطبيق على القياسات في الدماغ سليمة في الحيوان مستيقظا. هذا هو الاعتبار الرئيسي لأنه يسمح القياسات مع بنية متشابك وظيفة في مكان ودون مخاوف حول آثار ما بعد الوفاة. وعلاوة على ذلك، فإن النهج الكمّي الذي نستخدمه يحقق درجة عالية من التعريب المكاني. في حين أن الطاقة من ¹⁴C هو من هذا القبيل أننا لا يمكن توطين التتبع على المستوى دون الخلوي أو الخلوي، يمكننا قياس معدلات في طبقات الخلايا ومناطق الدماغ الصغيرة مثل النوى تحت المهاد، مع ما يقرب من 25 ميكرومتر القرار⁷.

أحد التحديات في قياسات الجسم الحي مع radiotracers هو التأكد من أن تسمية الراديو تقاس هو في نتاج رد فعل الفائدة بدلا من غير رد فعل المسمى السلائف أو غيرها من المنتجات الأيضية الخارجية المسمى⁶. اخترنا L-[1-¹⁴C]-ليوسين كحمض أميني التتبع لأنه إما دمجها في البروتين أو استقلاب بسرعة إلى ¹⁴CO_2،والتي يتم تخفيفها في مجموعة كبيرة من CO₂ غير المسمى في الدماغ الناجمة عن ارتفاع معدل استقلاب الطاقة⁸. وعلاوة على ذلك، أي ¹⁴C غير المدرجة في البروتين موجود في المقام الأول كما الحرة [¹⁴C] -ليوسين، والتي على مدى 60 دقيقة الفترة التجريبية، يتم تطهيرها تماما تقريبا من الأنسجة⁶. ثم يتم تثبيت البروتينات على الأنسجة مع الفورمالين وشطفها في وقت لاحق مع الماء لإزالة أي حر [¹⁴C] -ليوسين قبل التصوير الشعاعي.

وثمة اعتبار هام آخر هو مسألة تخفيف النشاط المحدد لتجمع الأحماض الأمينية السليفة بواسطة الأحماض الأمينية غير المسماة المستمدة من البروتيوليسيا الأنسجة. لقد أظهرنا أنه في الفئران والفئران الكبار، حوالي 40٪ من تجمع ليوسين السلائف لتخليق البروتين في الدماغ يأتي من الأحماض الأمينية المستمدة من انهيار البروتين⁶. يجب أن يتم تضمين ذلك في حساب المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي (rCPS) ويجب تأكيده في الدراسات التي قد تتغير فيها هذه العلاقة. وقد عُرض الأساس النظري وافتراضات الطريقة بالتفصيل في أماكن أخرى⁶. وفي هذه الورقة، نركز على المسائل الإجرائية لتطبيق هذه المنهجية.

وقد استخدمت هذه الطريقة لتحديد rCPS في السناجب الأرض⁹، الأغنام¹⁰، الفئران الركيس¹¹، الفئران¹²^،¹³^،¹⁴^،¹⁵^،¹⁶ ^, ^{17 سنة} ^, ^{18 سنة} ^, ^{19 سنة} ^, ²⁰ ^, ²¹، نموذج الماوس من التصلب الدرني مجمع²²، نموذج الماوس من متلازمة X الهشة²³^،²⁴^،²⁵^،²⁶، الهشة X الفئران premutation²⁷، و نموذج الماوس من فينيلكيتونيوريا²⁸. في هذه المخطوطة، نقدم إجراءات قياس rCPS مع طريقة L-[1-¹⁴C]-leucine في الجسم الحي. نحن نقدم rCPS في مناطق الدماغ من فأر التحكم مستيقظا. كما نثبت أنه في إدارة الجسم الحي للإيزوميسين، وهو مثبط للترجمة، يلغي تخليق البروتين في الدماغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة المعهد الوطني لرعاية الحيوانات واستخدامها في مجال الصحة العقلية، وتم تنفيذها وفقاً للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة بشأن رعاية الحيوانات واستخدامها.

ويرد في الشكل 1عرض عام للبروتوكول.

1. زرع القسطرة جراحيا في الوريد الفخذي والشريان لإدارة التتبع وجمع عينات الدم الشرياني في الوقت المناسب، على التوالي. جراحة كاملة على الأقل 22 ساعة قبل إدارة التتبع. تتطلب الجراحة حوالي ساعة واحدة لإكمالها.

جمع المواد اللازمة: الأدوات الجراحية المعقمة (مقص الجراحية، مقص صغير، ملقط، ثلاثة السنانير الجلد الجراحية)، والمعدات اللازمة للتخدير isoflurane (مرذاذ isoflurane، الزبال الغاز النشط، غرفة التخدير مختومة، التخدير مخروط الأنف)، مرحلة جراحة معقمة، كليبرز الفراء، 70٪ الإيثانول، بيتادين، شاش معقمة، الشريط الجراحي، تدفئة اليد التجارية، المجهر الجراحي، معقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم (المالحة)، الهيبارين المعقمة 100 وحدات USP / مل في 0.9٪ كلوريد الصوديوم (heparinized ملحي)، معقمة خمسة شرائط 20 سم من 6-0 خياطة قابلة للامتصاص، معقمة 25 سم خيوط من PE-8و PE-10 البولي ايثيلين القسطرة مع قطع نهاية واحدة في 45 س، معقمة 1 المحاقن سم مكعب، معقمة 32 الإبر قياس، معدات الكي، معقمة 15-20 سم غير القابل للصدأ جوفاء قضيب فولاذي (قطر داخلي 2.5 مم، قطر خارجي 3 مم)، مخدر موضعي (مرهم بوبيفاكاين وليدوكاين)، وحاوية حيوانية مع إعداد ملحق دوار (30 سم زر حبل الربيع، دوار، جبل دوار وذراع، 20 × 13 سم أسطواني واضح حاوية).
إعداد الحيوان للجراحة.
تأكد من استخدام التقنيات المعقمة والمعقمة المناسبة كما هو مطلوب من قبل مؤسستك.
1. وزن الحيوان. يجب أن يكون الحيوان على الأقل 25 غرام لعملية جراحية ناجحة.
2. ضع الحيوان داخل غرفة زجاج شبكي مغلق وربط الغرفة بجهاز التخدير isoflurane. تعيين معدل التدفق إلى 2.5 لتر / دقيقة للذكور و 3.0 لتر / دقيقة للإناث من 1.5٪ isoflurane في O₂. بعد ما يقرب من 2 دقيقة، تأكد من أن الماوس مخدر بشكل مناسب بسبب عدم وجود رد فعل الانسحاب مع قرصة اصبع القدم.
3. مرة واحدة مخدر، وإزالة الماوس من الغرفة ووضعها في موقف عرضة مع وجهه داخل مخروط الأنف التخدير. إعداد مخروط الأنف لتلقي الغاز من المرذاذ وإعادة الغاز إلى الزبال الغاز. الزبال سوف يلتقط isoflurane في مرشح الفحم.
4. استخدام كليبرز لالحلاقة الفراء بين شفرات الكتف. تأكد من تعقيم المنطقة الحليقة بشكل صحيح، بالتناوب ثلاث مرات بين البيتادين والدعك الإيثانول.
5. الوجه الماوس أكثر في موقف supine الحفاظ على الوجه في مخروط الأنف. الشريط أسفل الساق اليسرى على مرحلة الجراحة واستخدام كليبرز لالحلاقة الفراء من الفخذ الداخلي الأيسر إلى أسفل البطن الأيسر. تأكد من تعقيم المنطقة الحليقة بشكل صحيح، بالتناوب ثلاث مرات بين البيتادين والدعك الإيثانول.
6. حرك تدفئة يدوية متوفرة تجارياً، ملفوفة بالشاش، تحت الفأرة. الصق يأسفل الساق اليمنى على مرحلة الجراحة
أدخل القسطرة في الوريد الفخذي الأيسر.
1. مع مساعدة من المجهر الجراحي، واستخدام مقص الجراحية لجعل شق 1 سم من الجزء الأوسط العلوي من rostrally الفخذ الأيسر نحو خط الوسط، وكشف عن الشريان الفخذي والوريد.
2. سحب الجلد فضفاضة مع السنانير الجلد الجراحية لمزيد من فضح الحويصلات.
3. تطبيق معقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم إلى المنطقة المعرضة للحفاظ على الرطوبة الكافية.
4. استخدام ملقط لتشريح حادة، وفصل النسيج الضام حول قسم صغير من الشريان الفخذي والوريد. بعناية، فصل الشريان والوريد(الشكل 2).
5. استخدام ملقط لخيط حبلا واحدا من خياطة قابلة للامتصاص (ستراند A) تحت كل من الوريد الفخذي والشريان في النقطة الجانبية الأكثر من الشق. سحب خياطة في منتصف الطريق من خلال ذلك ينتهي حتى.
6. عند نقطة أكثر شبهًا إلى الفخذ، استخدم الملقط لخيط خياطة ثانية (Strand B) تحت الوريد الفخذي فقط. ربط بلطف عقدة نصف التي سيتم استخدامها لتقييد تدفق الدم.
7. عند نقطة بين ستراند A وستراند B، استخدم الملقط لخيط خياطة ثالثة (ستراند C) تحت الوريد الفخذي فقط. ربط بلطف عقدة كاملة التي سيتم استخدامها لتقييد تدفق الدم. يجب الحرص على عدم تمزيق الوريد.
8. الساحبة بلطف على ستراند B لتقييد تدفق الدم. استخدم hemostat لسحب Strand B برفق للحفاظ على تدفق الدم المقيد.
9. قطع حفرة صغيرة في المنطقة المحظورة من الوريد الفخذمع مقص صغير وإدراج بعناية نهاية الزاوية من الأنابيب PE-8 (مسح سابقا مع الهيبارين المالحة) نحو ستراند B. بمجرد إدخالها، حرر التوتر في Strand B وإرشاد القسطرة إلى أعلى الوريد. تشديد ستراند B حول الوريد الذي يحتوي على القسطرة.
10. باستخدام Strand C، اربط عقدة إضافية حول القسطرة. تأكد من أن هذه العقدة لا تلتقط الشريان الفخذي.
11. سحب بلطف على برميل حقنة لملء جزئيا الأنابيب مع الدم لضمان أن القسطرة قد تم زرعها بشكل صحيح.
بعد نفس الإجراء، أدخل قسطرة PE-10 في الشريان الفخذي الأيسر.
إجراء جراحي كامل.
1. بمجرد تأمين كل من وين الفخذ وقسطرة الشريان، ربط ستراند A في عقدة حول كل من القسطرة.
2. قطع جميع الغرز الزائدة وإزالة السنانير الجلد. اغسل القسطرة الشريانية بمحلول ملحي مُقَدَّم لمنع التخثر. قم بكوي نهايات كل من القسطرة لإنشاء ختم.
3. ضع الماوس في وضع عرضة وإجراء شق صغير في قاعدة الرقبة وتطبيق المالحة على المنطقة المكشوفة.
4. أدخل قضيب معدني مجوف من شق الرقبة إلى شق الفخذ. ثعبان القسطرة من خلال قضيب جوفاء والخروج من شق الرقبة. إزالة قضيب جوفاء. سيؤدي زرع القسطرة تحت الجلد إلى منع الفئران من إتلاف القسطرة.
5. تطبيق bupivacaine على جانبي الجرح. أغلق الشق الفخذي بخياطة. إضافة مرهم ليدوكائين على الجرح المغلق، خياطة.
6. ثعبان القسطرة من خلال أنبوب جوفاء مرنة 30 سم (حبل الربيع) وخياطة زر الحبل الربيع تحت الجلد. تطبيق bupivacaine على جانبي الجرح. خياطة زر الحبل الربيع تحت الجلد. إضافة مرهم ليدوكائين على الجرح المغلق، خياطة.
7. حرك الماوس إلى حاوية أسطوانية واضحة (ارتفاع 20 سم وقطرها 13 سم) مع جبل دوار وذراع لإيواء الحيوان خلال فترة التعافي. وضع يد أكثر دفئا تحت الحاوية للحفاظ على الحيوان دافئا.
8. المسمار الجزء العلوي من الحبل الربيع إلى دوار وتأمين دوار إلى ذراع دوارتعلق على حاوية أسطواني. تأكد من أن الماوس لديه مجموعة كاملة من الحركة ويمكن الوصول إلى القسطرة.
9. ضع غطاء مشقوق لا يتداخل مع آلية الدوران فوق الضميمة الحيوانية. راجع الشكل 3 للإعداد الكامل.
10. السماح للماوس لاسترداد. ينصح على الأقل 22 ساعة.

2. إعداد L-[1-¹⁴C] محلول ليوسين للحقن و 16٪ (ث / ف) 5-سلفوساليسيليك حمض (SSA) حل ثنائي الهيدرات لعينات البلازما إزالة البروتين. في حل SSA، وتشمل أيضا 0.04 m norleucine و 1 μCi/mL [H³] ليوسين كمعايير داخلية لتحليل الأحماض الأمينية وتحليل تركيز التتبع في كسور البلازما القابلة للذوبان في الأحماض، على التوالي. تخزين SSA تصل إلى شهرين في 4 درجة مئوية.

شراء L-1-¹⁴C]c] leucine (50-60 mCi/mmol)، الذي يباع كحل في 2٪ الإيثانول أو 0.1 N حمض الهيدروكلوريك. حتى تركيز 100 درجة مئوية /مل.

3. إدارة L-[1-¹⁴C] ليوسين عن طريق الوريد وجمع عينات الدم الشرياني.

جمع المواد اللازمة: 18 1.5 مل microtubes لعينات البلازما deproteinizing (إضافة 70 مل من المياه منزوعة الأيونات إلى كل أنبوب)، 17 250مل إدراج قارورة زجاجية (15 إدراج لجمع عينات الدم الشرياني و2 إدراج لجمع الدم الفضاء الميت ليكون إعادة حقنها. للحد من جمع الدم الإضافي وغير الضروري، والصغيرة، ورقيقة إدراج قارورة الزجاج مع قيعان مدبب التي تسمح لأنابيب يمكن الوصول إليها من البلازما الفائقة ينصح)، 2 أنابيب microcapillary (32 × 0.8mm، لقياس الهيماتوكريت)، 1 الهيبارين و أنبوب الطرد المركزي الصغير المغلفة بفلوريد الليثيوم (لمنع التخثر والتحلل، على التوالي)، وhemostats (تغطية النصائح مع أنابيب tygon بحيث المشابك لن تضر أنابيب PE)، ومراقبة الجلوكوز في الدم، محول ضغط الدم، 1 مل المحاقن المعقمة (ل الهبات المالحة)، ومحلول القتل الرحيم المتاح تجارياً (المخفف 1:1 في الماء منزوع الأيونات (للفئران)).
تأكد من أن الحيوان في حالة فسيولوجية طبيعية في بداية التجربة.
1. المشبك الأنابيب الشريانية حوالي 2 سم من النهاية وقطع غيض، وخلق فتحة للدم لتدفق. ثم فك المشبك الأنابيب وجمع الدم الفضاء الميت ((c. 30 مل) لجمع أي المالحة المتبقية و / أو الدم من السحوبات السابقة)، وفي أنبوب منفصل، وجمع عينة التحكم (حوالي 30 درجة مئوية)، عينات الهيماتوكريت (حوالي نصف حجم الأنبوب الشعري)، والجلوكوز عينة (حوالي 20 درجة مئوية).
2. قياس الهيماتوكريت عن طريق توصيل نهاية واحدة مع المعجون مانع التسرب والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 4500 × ز. قياس نسبة حجم الخلايا الحمراء إلى حجم الدم الكلي. إذا كان الحيوان لديه الهيماتوكريت أقل من 30٪، لا تستمر في الدراسة.
3. استخدم جهاز مراقبة جلوكوز الدم المتوفر تجاريًا لقياس مستوى الجلوكوز في قطرة من الدم.
4. عينة التحكم الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 18،000 × ز لفصل البلازما. إزالة البروتين عينات البلازما على النحو التالي: إضافة 5 ميكرولتر من البلازما إلى 70 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات في ميكروتوب 1.5 مل، إضافة 25 ميكرول من محلول SSA 16٪ ودوامة. توضع على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل أن تتجمد على الجليد الجاف.
5. إعادة الدم الفضائي الميت إلى الحيوان من خلال خط وريدي، تليها تدفق ملحي مملح مُسَنَعَد لمنع فقدان الدم الزائد.
6. ربط الخط الشرياني إلى محول ضغط الدم لقياس متوسط ضغط الدم الشرياني.
7. بعد أخذ العينات تأكد من إعادة المشبك الخط الشرياني ودافق الخط مع حجم صغير (50 مل) من المالحة الهيبارين.
إعطاء التتبع عن طريق الوريد وجمع عينات الدم الشرياني في الوقت المناسب.
1. استخدم موصل Y لإرفاق حقنة واحدة مع التتبع (100μCi/kg) وحقنة واحدة مع محلول ملحي معقم 50 مل لطرد الخط الوريدي بعد حقن التتبع. قم بتوصيل موصل Y بالخط الوريدي.
2. بدء الدراسة من خلال البدء في وقت واحد ساعة توقف وحقن التتبع. مسح الخط الوريدي مع المالحة (c. 100mL) مباشرة بعد الحقن.
3. جمع عينات الدم 1-7 باستمرار طوال أول 2 دقيقة من التجربة بنفس الطريقة. بعد جمع العينة السابعة، جمع 30 ميكرولتر الدم الميت الفضاء قبل كل عينة المتبقية. يتم جمع العينات 8-14 في 3 و 5 و 10 و 15 و 30 و 45 و 60 دقيقة على التوالي.
4. معالجة عينات الدم مباشرة بعد جمعها، كما هو موضح لعينة التحكم. إذا كان هناك تأخير، ضع العينات على الجليد. إعادة حقن الدم الفضائي الميت بعناية في الشريان عن طريق القسطرة الشريانية وتدفق مع ملح الهيبارين.
5. في مرحلة ما أثناء التجربة، معالجة ثلاثة معايير داخلية عن طريق إضافة 25 μL 16٪ SSA، 0.04 mM norleucine، و 1 mCi/mL [³H] ليوسين إلى 75 ميكرولتر الماء، دوامة ومكان على الجليد.
6. بعد جمع العينة الرابعة عشرة في 60 دقيقة، حقن ما يقرب من 0.2 مل من B-القتل الرحيم-D في خط وريدي لقتل الحيوان. سجل وقت الوفاة
7. فك الحيوان من جبل دوار وإزالة من الضميمة الحيوانية. إزالة الدماغ بعناية، ووضع على رقائق الألومنيوم، وتجميد على الجليد الجاف. لا تجمد العقول مع النيتروجين السائل كما قد تصدع العقول. تخزين الدماغ والعينات والمعايير الداخلية في -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للمعالجة. يمكن إجراء المعالجة في أي وقت بعد ذلك.

4. تحليل تركيزات ليوسين و L-[1-¹⁴C]ليوسين في عينات البلازما.

ذوبان العينات والمعايير الداخلية على الجليد، دوامة، والطرد المركزي 18،000 × ز لمدة 5 دقائق في 2 درجة مئوية. سوف تحتوي على كسر supernatant الحر المسمى وغير المسمى ليوسين.
نقل 40 ميكرولتر من supernatant إلى قارورة التلألؤ السائل وإضافة كوكتيل التلألؤ. قياس التفكك في الدقيقة (DPM) من ³H و ¹⁴C عن طريق العد التلألؤ السائل ومنحنى التبريد مصممة لفي وقت واحد مزدوج التسمية (3 H و ¹⁴C) العد.
لتحديد تركيزات اللوسين البلازما، استخدم نظام HPLC مع عمود تبادل الكاتيون الصوديوم واشتقاق ما بعد العمود مع الكشف عن العيون الفثالديهايد والفلورومتري.
1. تعيين HPLC إلى المواصفات التالية: الإثارة الفلورمتر من 330 نانومتر وانبعاث 465 نانومتر. المرحلة المتنقلة تتكون من إلورات الصوديوم، الرقم الهيدروجيني 7.40، وإلورات الصوديوم + 5٪ سلفولاني، الرقم الهيدروجيني 3.15. تعيين معدل تدفق المخزن المؤقت من 0.400 مل / دقيقة ومعدل تدفق أداة الاشتقاق إلى 0.300 مل / دقيقة.
2. معايرة النظام مع مجموعة من تركيزات الأحماض الأمينية (بما في ذلك نورليوسين) بين 30 و 500 بمول / 10مل. منحنى المعايرة خطي. تركيزات الأحماض الأمينية من عينات حقن 10 مل اختبار تقع ضمن نطاقات منحنى المعايرة هذا.

5. إجراء التصوير الشعاعي التلقائي الكمي.

إعداد أقسام الدماغ 20 ميكرومتر في سمك للتصوير الشعاعي التلقائي. قسم الدماغ عن طريق cryostat في -20 درجة مئوية.
إذابة جبل أقسام الدماغ التسلسلي على الشرائح المغلفة الجيلاتين. الهواء جاف.
اغسل الشرائح في خمسة تغييرات من 10٪ فورمالين لمدة 30 دقيقة لكل تغيير، تليها تدفق مستمر من المياه منزوعة الأيونات لمدة 1 ساعة.
ترتيب الشرائح في كاسيت فيلم الأشعة السينية (الكاسيت اتّصال تتناسب مع أفلام تصوير الثدي بالأشعة السينية 20X25 سم) جنبا إلى جنب مع مجموعة من [¹⁴C] methylmethacrylate المعايير، والتي تم معايرة سابقا ضد الأنسجة من تركيزات ¹⁴C المعروفة كما وصف²⁹. المعايير يمكن شراؤها تجاريا ولكن ضمان أنها تغطي مجموعة من 2-300 mCi / غرام من الأنسجة ويتم معايرة ضد 20 درجة مئوية سمك الأنسجة. تحت ضوء الأمان الأحمر، ضع قطعة من فيلم التصوير الشعاعي للثدي، مستحلب الجانب إلى أسفل، على رأس الأقسام.
ختم الكاسيت ووضعها في كيس تغيير أسود وتخزينها في خزانة لمدة 40-45 يوما.
تطوير الأفلام وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. ملاحظة: لا ينصح بتطوير الفيلم الآلي لأن الخلفية قد تكون غير متساوية ويمكن أن تؤثر على القياس الكمي.

6. تحليل الصور.

ملاحظة: يوصى ببرنامج متاح تجاريا لتحليل الصور إلى جانب كاميرا CCD ومربع ضوء الفلورسنت مع إضاءة حتى. يتم الكشف عن الكثافات البصرية النسبية في الفيلم مضيئة من قبل كاميرا CCD.

إنشاء منحنى معايرة الكثافة البصرية (OD) ضد تركيز الأنسجة ¹⁴C استناداً إلى ODs من مجموعة من المعايير المعايرة على الفيلم. احتواء هذه البيانات (بما في ذلك الفراغ أو الخلفية) مع معادلة متعددة الحدود. إما معادلة متعددة الحدود من الدرجة الثانية أو الثالثة تناسب بشكل جيد جداً.
لتحليل مناطق الدماغ المحددة، حدد موقع المنطقة ذات الأهمية (ROI) في ستة إلى ثمانية أقسام بالمقارنة مع أطلس الدماغ. تسجيل ODs من بكسل داخل عائد الاستثمار في جميع المقاطع، واستنادا إلى منحنى المعايرة، وحساب تركيز الأنسجة ¹⁴C في كل بكسل. حساب متوسط تركيز الأنسجة ¹⁴C في عائد الاستثمار.

7. حساب rCPS. حساب rCPS في كل عائد استثمار عن طريق المعادلة التالية:

figure-protocol-1

حيث P * (T) هو تركيز الأنسجة المتوسط المرجح من ¹⁴C في عائد الاستثمار،_{C p}(t) و C^*_p(t) هي تركيزات البلازما الشريانية للليوسين غير المسمى والمسمى في الوقت، t، T هو الوقت الذي مات الحيوان ( حوالي 60 دقيقة)، وهو جزء من ليوسين في تجمع السلائف الأنسجة التي تأتي من البلازما. يتم تقييم في تجربة منفصلة ⁶. وقد تم تقييم في WT, Fmr1 بالضربة القاضية, Tsc^+/-, وPKU الفئران ^6,^22,^25,²⁸. إذا كانت التجربة تنطوي إما على تغييرات وراثية أو دوائية قد تؤثر على معدلات تخليق البروتين أو التحلل أو التمثيل الغذائي للليوسين، فينبغي تقييم الليوسين في ظل الظروف الجديدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نعرض تجربة تمثيلية تبين آثار الإدارة المسبقة لمثبط تخليق البروتين على rCPS. وقد أُعطي الأنيسومايسين في محلول ملحي عادي لفأر من النوع البري C57/BL6 للذكور البالغين تحت الجلد (100 ملغم/كغم) 30 دقيقة قبل بدء تحديد الـ rCPS. آثار العلاج الأنيومايسين مقارنة مع الحيوانات التحكم المعالجة بالمركبات تظهر أن rCPS غير قابل للكشفتقريبا في الماوس معالجة الأنسوميسين (الشكل 4). يمثّل هذا معطيات تصديق أنّ ال في [فيفو] [أوتورديوغرفيك] [ل]-[1-¹⁴[ك]-[ليوسين] طريق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم طريقة كمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي (rCPS) في الجسم الحي في الحيوانات التجريبية. هذه الطريقة لها مزايا كبيرة على الأساليب القائمة: 1. يتم إجراء القياسات في الحيوان مستيقظا يتصرف، بحيث تعكس العمليات الجارية في الدماغ يعمل. 2 - وتُبذل القياسات عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي الكمي الذي يتيح القدرة على تحديد الـ rCPS في جميع المناطق والمناطق دون الإقليمية في الدماغ في آن واحد. 3. النموذج الحركي للطريقة يأخذ في الاعتبار إمكانية إعادة تدوير الأحماض الأمينية غير المسماة المستمدة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يعترفوا بـ Zengyan Xia لكتابة الفئران، وتوم بيرلين لمعالجة الأحماض الأمينية والأفلام، وMei Qin لأداء بعض التجارب rCPS. وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث داخل الجدارية من NIMH، ZIA MH00889. كما تم دعم RMS من قبل التوحد يتحدث زمالة ما بعد الدكتوراه 8679 وزمالة FRAXA ما بعد الدكتوراه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الفئران	مختبر جاكسون	003024	Fmr1 < / em> بالضربة القاضية أزواج تربية
Anisomycin	Tocris Bioscience	1290
أنابيب Microhematocrit	Drummond Scientific	1-000-3200-H	أنابيب شعرية
Critoseal Capillary Tube مانع التسرب	Leica Microsystems	معجون مانع التسرب	39215003
قارورة زجاجية إدراج	Agilent	5183-2089	المستخدمة لجمع عينات الدم
Digi-Med Blood Pressure Analyzer	Micro-Med Inc.	محلل ضغط الدم	BPA-400
نظام مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم باير بريز 2	باير بريز	9570A	مقياس الجلوكوز
حقنة محكمة للغاز	شركة هاميلتون	1710	حقنة زجاجية من التوبركولين
HeatMax HotHands-2 تدفئة اليدين	HeatMax	موديل HH2	وسادات الاحترار
Heparin Lock Flush Solution	Fresenius Kabi USA، LLC	504505
شفافة	من الهيبارين الملحي Instech	MTANK / W	حاوية حيوانية
زنبركية حبل	Instech	PS62	أنبوب القسطرة / مرفق القوارض
خطافات دوارة		Instech 375/25	إلى حبل زنبركي
ذراع دوار وجبل	Instech	SMCLA	للدوران والضميمة الحيوانية
الحبل	Instech	VAB62BS / 22	يعلق على الجزء السفلي من حبل الزنبرك
أنبوب من الفولاذ المقاوم	مصنوع في المنزل	N / A	يستخدم لثعبان القسطرة من خلال الماوس
Matrx VIP 3000	Matrx	مبخر 91305430	الأيزوفلوران
شركة Isoflurane	Stoelting Co.	50207	isoflurane / halothane adsorber
Clippers	Oster Finisher	موديل 59
خطافات جلدية	جراحية مصنوعة في المنزل (؟؟)	غير متاح (؟؟)
0.9٪ كلوريد الصوديوم الملحي	APP Pharmaceuticals LLC	918610
ملقط	أدوات العلوم	الدقيقة 11274-20
مقص جراحي	أدوات العلوم	الدقيقة 14058-11
أدوات العلوم الدقيقة للمقص		الدقيق 15000-00
توحيد خيوط جراحية حريرية	AD الجراحية	#S-S618R13	6-0 USP ،
البولي إيثيلين PE-8	SAI Infusion Technologies	PE-8-25
حقنة	Becton Dickinson and Co.	309659	1cc / مل
PE-10 أنابيب البولي إيثيلين	كلاي آدامز	427400
MCID Analysis	Imaging Research Inc.	الإصدار 7.0	تحليل الكثافة البصرية
شرائح مغلفة بالجيلاتين (75 × 25 مم)	FD Neurotechnologies	PO101
Cryostat	Leica	CM1850
Super RX-N فيلم الأشعة السينية الطبية	فوجي	47410-19291
كاسيت فائق (8 × 10 بوصة)	Amersham Pharmacia Biotech	11649
[1-^{14< / sup>C] leucine}	أنبوب Moravek	MC404E
جهاز طرد مركزي دقيق	Sarstedt Aktiengesellschaft & Co.	72.692.005	تستخدم لإزالة البروتين من عينات الدم
ماصة زجاجية باستور	ويتون	357335
الصوف الزجاجي	سيجما ألدريتش	18421
النيتروجين	المعاهد الوطنية للصحة	6830009737285
سائل التلألؤ	CytoScint	882453
عداد الوقود	باكارد ثلاثي الكربوهيدرات	2250CA
محلل الأحماض الأمينية	مختبرات بيكرينغ	بيناكل PCX
وحدة HPLC	Agilent Technologies	1260 Infinity	تشمل 1260 مضخة خامل حيوية
مجهر جراحي	وايلد هيربروج	M650
حمض السلفوساليسيليك	سيجما ألدريتش	MKBS1634V	5-سلفوساليسيليك حمض ثنائي الهيدرات
نورلوسين	سيجما	N8513
1.0 N HCl	Sigma-Aldrich	H9892
[H^{3< / sup>] leucine}	Moraevk	MC672
أنبوب فالكون	Thermo Scientific	339652	50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية
ساعة توقيت	Heuer Microsplit	Model 1000	1/100 min
Vet One		H6438
أبحاث التصوير الدقة للضوء الشمالي		نموذج B95	صندوق إضاءة الفلورسنت
Micro-NIKKOR 55mm f / 2.8	نيكون	1442	CDD

حاوية خطافات زر للصدأ أنابيب غير القابلة للامتصاص مركز إمداد السائل شركة كاميرا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034(2015).
Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

L 14C Leucine

طريقة الأوتوراديوغرافية الكمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في فيفو

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة