مقالة منهجية

التحليل الزمني إزفاء النووية إلى هيولى بروتين الفيروس 1 الحلأ البسيط بالفحص المجهري [كنفوكل] إيمونوفلوريسسينت

DOI:

10.3791/58504

⸱

نوفمبر 4, 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Wayne State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ICP0 يخضع إزفاء النووية إلى هيولى خلال هامبورغ-1 العدوى. ولا يعرف الآلية الجزيئية لهذا الحدث. هنا يصف لنا استخدام مجهر [كنفوكل] كأداة لقياس حركة ICP0 في هامبورغ-1 العدوى، الذي يرسي الأساس لتحليل كمي إزفاء ICP0 في الدراسات الميكانيكية في المستقبل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتين الخلية المصابة 0 (ICP0) لفيروس الحلأ البسيط 1 (هامبورغ-1) بروتين مبكر فوري الذي يحتوي على ليجاسى ubiquitin E3 عصابة من نوع. أنها مسؤولة عن تدهور proteasomal المضيف العوامل المقيدة وتفعيل الجينات الفيروسية اللاحقة. ICP0 يحتوي على تسلسل تعريب النووي المتعارف عليه (NLS). أنه يدخل النواة فورا بعد توليف حيثياته وينفذ مهامه الدفاع المضادة المضيف أساسا في النواة. ومع ذلك، لاحقاً في الإصابة، ICP0 يتم العثور على فقط في السيتوبلازم، مما يوحي بحدوث إزفاء النووية إلى هيولى خلال هامبورغ-1 العدوى. يفترض أن يتيح إزفاء ICP0 ICP0 تعدل مهامها وفقا لمواقعها سوبسيلولار في مراحل مختلفة من العدوى. كي تحدد الوظيفة البيولوجية وآلية تنظيمية من ICP0 النووية إلى هيولى إزفاء، قمنا بتعديل أسلوب الفحص المجهري إيممونوفلوريسسينت لرصد الاتجار ICP0 خلال هامبورغ-1 العدوى. ويشمل هذا البروتوكول تلطيخ إيمونوفلوريسسينت، [كنفوكل] مجهر التصوير، والنووية مقابل توزيع هيولى تحليل. والهدف من هذا البروتوكول التكيف مع حالة ثابتة [كنفوكل] الصور التي اتخذت في دورة وقت إلى توثيق كمية الحركة ICP0 في جميع أنحاء العدوى الحال. ونحن نقترح أن هذا الأسلوب يمكن أن يعمم لتحليل كمي النووية مقابل الحصول على التعريب هيولى من البروتينات الفيروسية أو الخلوية الأخرى دون إشراك تكنولوجيا التصوير الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسبب فيروس الحلأ البسيط 1 (هامبورغ-1) مجموعة واسعة من معتدلة إلى شديدة الأمراض الحلئيه بما في ذلك لابياليس الحلأ الحلأ التناسلي، التهاب القرنية stromal والتهاب الدماغ. وبمجرد إصابة، ينشئ الفيروس عدوى مدى الحياة كامنة في الخلايا العصبية ganglia. في بعض الأحيان، يمكن إعادة تنشيط الفيروس بأسباب مختلفة مثل الحمى والإجهاد وقمع المناعة1، مما أدى إلى إصابة القوباء المتكررة. بروتين الخلية المصابة 0 (ICP0) منظم فيروسية أساسية حاسمة للحال والكامنة على السواء هامبورغ-1 العدوى. أنها ترانساكتيفاتيس الفيروس المصب الجينات عن طريق التصدي للمضيف الدفاعات المضادة للفيروسات مضمن الفطرية/2،3. وقد ICP0 بنشاط ليجاسى ubiquitin E3، الذي يستهدف عدة عوامل خلية لتدهور تعتمد على بروتوزوم3. أنه يتفاعل أيضا مع مختلف مسارات الخلية لتنظيم أنشطتها وبعد ذلك إزاحة القيود المضادة للفيروسات المضيف3. ومن المعروف ICP0 لتحديد موقع في المقصورات سوبسيلولار مختلفة كما تنتقل العدوى3،،من45. وقد البروتين إشارة تعريب نووية يسين/ارجينين--الغنية (NLS) الموجود في المخلفات إلى 500 5066. عند توليف حيثياته في وقت مبكر هامبورغ-1 العدوى، يتم استيراد ICP0 فورا إلى النواة. أنها أول مرة اكتشفت في دينامية نووية وصف بنية المجال النووي 10 (ND10)7. نشاط ليجاسى ubiquitin E3 ICP0 يتسبب تدهور البروتينات المنظم ND10، promyelocytic سرطان الدم (الرابطة الإسلامية) البروتين، والبروتين الأرقط 100 كاتشين (Sp100)8،،من910. بعد فقدان البروتينات المنظم، مشتتة الهيئات النووية ND10 وهو موزع ICP0 لملء4،أسرة نواة11.

من المثير للاهتمام، بعد بدء تكرار الحمض النووي الفيروسي، يختفي ICP0 من النواة. إلا يوجد في السيتوبلازم، مما يوحي بحدوث إزفاء النووية إلى هيولى متأخراً في هامبورغ-1 العدوى4،12. ويعني اشتراط تكرار الحمض النووي مشاركة محتملة أواخر protein(s) الفيروسية في تيسير نقل جسد هيولى من هامبورغ-1 ICP04،12. ICP0 الاتجار فيما بين الأقسام المختلفة أثناء الإصابة تمكن على ما يبدو ICP0 تعدل اتصالاتها على مختلف المسارات الخلوية بطريقة مكانية الزمانية، وتنسيق ذلك وظائفها المتعددة لغرامة ضبط التوازن بين الحال والكامن هامبورغ-1 العدوى13. لفهم أفضل لتعدد الوظائف ICP0 وتنسيق مجالات وظيفية ICP0 في جميع أنحاء العدوى الحال، نحن بعناية تشريح الأساس الجزيئي الحيوي إزفاء ICP012. لإجراء الدراسات الميكانيكية سبق الإبلاغ عنها12، المطبقة لدينا أسلوب المصبوغة إيمونوفلوريسسينت لتصور التعريب ICP0 سوبسيلولار في حالة الإصابة مختلفة تحت المجهر [كنفوكل]. كما قمنا بتطوير بروتوكول كمية لتحليل النووية مقابل هيولى توزيع ICP0 باستخدام البرمجيات [كنفوكل]. كان جدولت سكان هامبورغ-1 إصابة الخلايا في مراحل الإصابة وحللت اتجاهات الحركة ICP0، تحت مختلف علاجات البيوكيماوية12. هنا نحن تصف البروتوكول مفصلاً أن إزفاء الوثائق ICP0 في هامبورغ-1 العدوى. ونحن نقترح أنه يمكن اعتماد هذا الأسلوب كوسيلة عامة للدراسة النووية مقابل هيولى نقل جسد للبروتينات الفيروسية أو الخلوية الأخرى، التي يمكن أن تخدم كبديل للتصوير الحي عندما يكون غير قابل للتطبيق نظراً لتقنية التصوير الحي مشاكل مثل تسمية الأسلوب، وكثافة إشارة، أو وفرة البروتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-خلية البذر والإصابة بالفيروسات

  1. في 20 – 24 ساعة قبل الإصابة بالفيروس، البذور 5 × 104 خلايا الرئة الجنينية البشرية (هيل) تنتجها الخلايا الليفية أو خلايا أخرى ينبغي بحثها على شريحة متداخلة مم 11 4-جيدا في النمو المتوسطة (تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع الأبقار الجنين 10% المصل (FBS)). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون (CO2).
    ملاحظة: كل جيد ينبغي أن يكون كونفلوينسي خلية 70-80% في وقت الإصابة.
  2. في اليوم التالي، إزالة المتوسطة النمو وتصيب الخلايا بالفيروسات في المتوسط-199 في طائفة من 4 – 10 بفو/خلية. احتضان الخلايا المصابة بالفيروسات ح 1 في 37 درجة مئوية. الاحتفاظ بالهز الشريحة أثناء فترة الحضانة.
  3. وبعد تفريخ ح 1، إزالة المتوسطة-199 والملحق مع متوسط النمو.
    ملاحظة: يمكن إضافة الأدوية التي تتداخل مع الإصابة بمختلف المراحل في هذه الخطوة، أو قبل امتصاص الفيروسية.
  4. احتضان الخلايا المصابة بالفيروس عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لأطوال مختلفة من فترة الإصابة.

2. تثبيت وبيرميبيليزيشن

  1. وفي الوقت السليم العدوى، بسرعة تغسل الخلايا المصابة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) 3 مرات وإضافة 200 ميكروليتر من 4% بارافورمالدهيد طازج في برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا مع بارافورمالدهيد لمدة 8-10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإصلاح الخلايا في كل بئر.
  2. نضح بارافورمالدهيد وغسل الآبار مع 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات. تماما نضح برنامج تلفزيوني بعد الغسيل 3rd .
  3. إضافة 100 ميكروليتر من السطح غير الأيونية 0.2% لكل بئر بيرميبيليزي الخلايا لمدة 5 – 10 دقائق.
  4. نضح الفاعل غير الأيونية وغسل الآبار مع 200 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني لمدة 3 مرات.

3-إيمونوفلوريسسينت تلطيخ

  1. تماما نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت حظر (ألبومين المصل البقري 1% (BSA) و 5% مصل الحصان في برنامج تلفزيوني) في كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1 أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  2. إضافة تركيز تصميماً تجريبيا لجسم الأولية (الأرنب ICP0 مكافحة جسم [بولكلونل]12) في المخزن المؤقت لحظر واحتضان جسم الأولية في درجة حرارة الغرفة ح 2 أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  3. يغسل مع المخزن المؤقت حظر 3 مرات مع حضانة 10 دقيقة. إضافة مترافق 594 أليكسا الماعز الأرنب المضادة جسم الثانوي (1: 400 المخفف في المخزن المؤقت لحظر) واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة ح 1. ثم يغسل الشرائح 3 مرات مع المخزن المؤقت لحظر عند الفاصل الزمني 10 دقيقة.
  4. وأخيراً غسل الشريحة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني لإزالة بقايا جيش صرب البوسنة ومصل الحصان.
  5. أضف قطره واحدة من المتوسطة تصاعد أنتيفادي مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) جبل الشريحة، وختم ذلك ساترة باستخدام طلاء الأظافر الشفاف.

4-[كنفوكل] التصوير

  1. مع مجهر [كنفوكل]، تعيين الطول الموجي في 590 – 650 نانومتر 594 أليكسا و 410 – 520 نانومتر ل DAPI. حدد تنسيق الصورة في 1024 × 1024 وخط متوسط 8 للحصول على صور عالية الدقة.
  2. تحليل كل بئر على الشريحة 4-البئر تحت المجهر [كنفوكل]. الحصول على الصور الممثل الخلية تحت الهدف X 100، كما هو مبين في الشكل 1 و الشكل 2.
  3. لعد عدد كبير من الخلايا، التقاط صور لحقول متتالية تحت الهدف X 40.
    ملاحظة: يتطلب الصور 5-10 تتراكم الخلايا المصابة ما يزيد على 200 من كل نقطة مرة كل العدوى.
  4. في كل تجربة، والتقاط الصور مع معلمات [كنفوكل] ثابتة لجميع العينات الحاجة إلى مقارنة.

5-تحليل النووية مقابل توزيع هيولى

  1. فتح المشروع مع برنامج التطبيق [كنفوكل]. حدد صورة من خلالها الخلايا بحاجة إلى تكون مبوبة للنووي مقابل هيولى توزيع ICP0.
  2. انقر فوق علامة التبويب "الكمية" من أعلى القائمة وحدد "فرز رويس" من القائمة "أدوات".
  3. رسم خط طولي عبر الخلية يتم تحليلها عن طريق تحديد "رسم خط" من القائمة العلوية.
    ملاحظة: سوف يظهر الرسم البياني تبين كثافة الأسفار على طول الخط لكل من ICP0 و DAPI. في الرسم البياني، الخط الأزرق يمثل DAPI بكسل وعلامات حدود النواة بينما يمثل الخط الأحمر ICP0 بكسل.
  4. استناداً إلى تلوين الخلفية، قم بإعداد عتبة ثابتة لكثافة ICP0 لتحليل التوزيع ICP0 سوبسيلولار في كل تجربة.
    1. كما يتمثل في الشكل 2، إذا كانت الإشارة الحمراء في المتوسط عن العتبة في منطقة نووية لكن عتبة خارج الحدود الزرقاء، وتصنيف إشارة حمراء يقع معظمها في السيتوبلازم.
    2. إذا كانت إشارة حمراء فوق العتبة في جميع أنحاء النواة وتتجاوز حدود الإشارات الزرقاء، المجموعة إشارة حمراء كنواة بالإضافة إلى تعريب هيولى.
    3. إذا كان إشارة حمراء فوق العتبة في النواة ولكن في المتوسط هو أقل من ذلك خارج حدود الإشارات الزرقاء، المجموعة إشارة حمراء كمسلم النووي.
  5. جدولة الخلايا المصابة أكثر من 200 من كل عينة في وقت الإصابة مختلفة والأرض في رسم بياني شريطي لتوضيح حركة ICP0 وفقا للوقت (الشكل 3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لفهم الأساس الجزيئي والوظائف البيولوجية ICP0 الاتجار خلال هامبورغ-1 العدوى، نستخدم أسلوب الفحص المجهري إيمونوفلوريسسينت لتحليل التوزيع ICP0 سوبسيلولار في مراحل مختلفة من العدوى. ويبين الشكل 1 الخلايا الممثل مع التعريب ICP0 المميزة مع تقدم الإصابة. لتحديد مقدار إزفاء النووية إلى هيولى من ICP0، نحن نحلل توزيع ICP0 بالنسبة إلى النواة بتصنيف الخلايا المصابة إلى ثلاث مجموعات: النووية التعريب والتعريب هيولى (التعريب النووية بالإضافة إلى هيولى ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدم هذا البروتوكول لدراسة إزفاء النووية إلى هيولى من هامبورغ-1 ICP0. ICP0 يخضع الاتجار سوبسيلولار خلال هامبورغ-1 العدوى (الشكل 1). من المحتمل يتفاعل ICP0 مع مختلف مسارات الخلية القيام بمهام مختلفة في مواقع مختلفة. وهذا يتيح ICP0 لتهذيب وظائفها المتعددة في شد مع الإنسان المضيف13. ومع ذلك، كيف ينسق ICP0 وظائف متعددة في طريقة مكانية الزمانية لا جيدا درس. مع بروتوكول الفحص المجهري نيون الموصوفة أعلاه، بدأنا بتحليل الأساس الجزيئي إزفاء النووية إلى هيولى ICP0. وحتى ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر الدعم المالي من منحة المعاهد الوطنية للصحة (RO1AI118992) منحت قو هاي. ونحن نشكر مرفق الفحص المجهري، والتصوير وقياس الموارد (MICR) الأساسية في جامعة ولاية وين للدعم التقني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<خلايا > وفيروسات قوية < / قوية >
الليفية الرئوية الجنينية البشرية (خلايا HEL)د. توماس إي شينك (جامعة برينستون)نمت خلايا HEL في DMEM مكملة بمخزون فيروسي FBS
HSV-1 بنسبة 10٪ (سلالة F) مختبرالدكتور برنارد رويزمان مختبر
<قوي >متوسط < قوي>
دولبيكو s النسر المعدل s medium (DMEM)Invitrogen  ; 11965-092
مصل الأبقار الجنيني (FBS)سيجماF0926-500 مل
متوسط-199 (10x)جيبكو11825-015
<قوي > كواشف < / قوي >
4- بئر 11 مم شريحة متداخلةCel-Line / Thermofisher Scientific  ؛ 30-149H-BLACK
16٪ محلول بارافورمالدهايد (وزن / حجم) خال من الميثانولThermo Scientific28908
Triton X-100كواشف فيشرBP151-1C0
مصل الأبقار Abumin (BSA)CalbiochemCAS 9048-46-8
مصل الحصانSigmaH1270
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي مولار Na 2< / sub>HPO4< / sub> ، pH7.4) مختبرالدكتور هايدونغ غو
كلوريد الصوديوم & nbsp ؛          كاشف بيولوجي فيشرBP358-212
KH2PO4                       كاشف فيشرالحيوي BP362-500
KCl                         فيشر العلمية BP366-500
Na2HPO4                         فيشر بيورېكائنBP332-500
مانع المخزن المؤقت (PBS مع 1٪ BSA و 5٪ مصل الحصان)الدكتور هايدونغ جو مختبر
ربيعت المضاد لبرنامج المقارنات الدولية 0 الأجسام المضادةالدكتور هايدونغ جو مختبر
PML (PG-M3) - الفأر أحادي النسيلة IgGسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-966
Alexa Fluor 594-الماعز المضاد للأرانب IgGinvitrogenA11012
Alexa Fluor 488-goat مضاد للفأر IgGinvitrogenA11001
Vectashield Mouting medium معمختبراتH-1200
ماصة باستورفيشر ماركة13-678-20D
طلاء أظافرسالي هانسن
< قوي > معدات < / مجهر
متحد البؤرLeica SP8
برنامج متحد البؤرLeica LAS X مجموعة
برنامج ExcelMicrosoft Excel HERAcell
150i CO2< / sub> حاضنةThermo ScientificOrder Code 51026282
الخلايا DAPI Vector قوي >التطبيقات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  2. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. , 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).
  3. Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
  4. Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
  5. Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
  6. Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
  7. Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
  8. Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
  9. Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
  10. Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
  11. Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
  12. Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
  13. Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection? Future Virology. 13 (6), (2018).
  14. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  15. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  16. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
  17. Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378(2016).
  18. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ICP0 HSV 1 DAPI

مقالات ذات صلة