يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فحص نشاط إندوتوكسين للكشف عن بطانة الدم الكاملة في المرضى الذين يعانون من أمراض خطيرة

9.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58507

⸱

يونيو 24, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesia and Critical Care, Niguarda Hospital, 2University of Milan-Bicocca Medical School

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بموجب هذا بروتوكول لقياس النشاط الإندوتوكسين لعينات الدم البشرية الكاملة في السرير. اختبار نشاط إندوتوكسين هو اختبار بسيط للأداء وقد يكون علامة حيوية مفيدة في المرضى الذين يعانون من أمراض خطيرة مع الإنتان.

الملخص

Lipopolysaccharide، والمعروف أيضا باسم endotoxin، هو عنصر أساسي من البكتيريا سلبية الغرام ويلعب دورا حاسما في تطوير الإنتان وصدمة الصرف الصحي. وقد يؤدي التحديد المبكر لعملية معدية تتطور بسرعة إلى مرض حرج إلى علاج أسرع وأكثر كثافة، مما قد يؤدي إلى نتائج أفضل للمرضى. يمكن استخدام اختبار نشاط الإندوتوكسين (EA) في جانب السرير كعلامة حيوية موثوق بها لبطانة الرحم الجهازية. وقد ثبت مرارا وتكرارا الكشف عن ارتفاع مستويات النشاط endotoxin أن تكون مرتبطة مع زيادة شدة المرض في المرضى الذين يعانون من الإنتان وصدمة الصرف الصحي. يمكن إجراء الإنقاب بسرعة وسهولة الأداء. لفترة وجيزة، بعد أخذ العينات، يتم خلط aliquot من الدم كله مع الأجسام المضادة للاندوتوكسين ومع LPS المضافة. يتم قياس نشاط Endotoxin كانفجار الأكسدة النسبية من العدلات تستعد كما تم الكشف عنها من قبل chemioluminescence. يتم التعبير عن ناتج التقييم على مقياس من 0 (غائب) إلى 1 (الحد الأقصى) ويصنف على أنه "منخفض" (<0.4 وحدة) أو "متوسط" (0.4-0.59 وحدة) أو "مرتفع" (≥ 0.6 وحدة). وترد في هذه المخطوطة المنهجية التفصيلية والأساس المنطقي لتنفيذ هذا التبيّن.

المقدمة

يُيعتبر الليبوبوليساكاريد (LPS)، المعروف أيضًا باسم endotoxin، مكونًا رئيسيًا في بنية غشاء بكتيريا الغرام سلبية (GN). أنها تشكل حوالي 10٪ من جدار الخلية، كونها حيوية لسلامة الغشاء الخارجي والتوازن. وعلاوة على ذلك، بل هو المنشط قوية من الجهاز المناعي الفطري المضيف1،2.

التعرض في المختبر من خلايا الجهاز المناعي الفطرية إلى LPS يؤدي إلى تغييرات في التعبير عن جينات متعددة3. إدارة كميات صغيرة جدا من LPS في المتطوعين الإنسان الأصحاء يؤدي إلى سلسلة من التهاب الجهازية الحادة، في حين أن الإنتان وصدمة الصرف الصحي قد تنشأ مع تركيزات أعلى endotoxin4،5.

الإنتان هو حالة تهدد الحياة والتي، إذا لم يتم التعرف عليها على الفور، يمكن أن يؤدي إلى فشل متعدد الأعضاء والموت. يجب علاج مرضى الصرف الصحي في الوقت المناسب، مع الإنعاش العدواني، والعلاج بالمضادات الحيوية الكافية، والسيطرة المثلى على المصدر، واستراتيجيات دعم الأعضاء الفورية. ويستند تشخيص مسببات الإنتان في المقام الأول على الاعتراف السريري والكشف عن مسببات الأمراض القائمة على الثقافة6. ومع ذلك، قد تستغرق نتائج الثقافات الميكروبية ما يصل إلى 48 ساعة وهي غير حاسمة في ما يصل إلى 30٪ من الحالات7. وقد يؤدي التحديد والتدخل المبكران إلى نتائج أفضل للمرضى. في المرضى الذين يشتبه في الإنتان ، غالبا ما تتخذ القرارات على أساس المعلمات الفسيولوجية والكيميائية الحيوية ، دون علامة واضحة على بطانة الرحم.

قياس نشاط إندوتوكسين (EA) يمكن الحصول عليه او طريق اختبار تجاري (انظر جدولالمواد) في الدم كله. ويمكن استخدامه كعلامة بيولوجية للبطانة السينية الجهازية للتقسيم الطبقي المبكر لشدة المرض، وخاصة في المرضى المعرضين لخطر الإصابة بصدمة الصرف الصحي8. تم استخدام اختبار لتوجيه بوليماكسين B العلاج الهيموبيرفيوجن في تجربة سريرية مزدوجة التعمية التي تم نشرها مؤخرا معشاة التعمية في المرضى الذين يعانون من صدمة الصرف الصحي9. في المرضى الذين يعانون من أمراض خطيرة، وأظهرت الدراسة MEDIC زيادة مستويات EA أن تكون مرتبطة مع خلل الجهاز متعددة، وحدة العناية المركزة (ICU) طول مدة الإقامة، والوفيات10.

وقد وضعت تجارب مختلفة للكشف عن الاندوتوكسين. اختبار ليمولوس الأميبوسيت ليسات (LAL)، إما كاختبار جل جلطة، عكر، أو كروموجينيك، كان حتى الآن الأكثر شيوعا ً المعتمدة لتقدير إندوتوكسين المصل. وهو يقوم على قدرة endotoxin للحث على تخثر الهيمولمفي من سرطان البحر حدوة الحصان ، Limulus polyphemus. ومع ذلك، فإن هذا القول له بعض القيود من حيث الخصوصية. على وجه الخصوص، فإنه يمكن أيضا أن تنشط من قبل المنتجات الميكروبية غير endotoxin، مثل مكونات جدار الخلية الفطرية، ويمكن أن تمنعها مختلف بروتينات البلازما البشرية11.

خلال العقد الماضي تم تطوير قياس EA والتحقق من صحته كعلامة بيولوجية لتدوير بطانة الرحم. بالمقارنة مع اختبار LAL، EA هو أسرع وأسهل لتنفيذ في الإعداد السريري. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن تكون أكثر دقة من LAL في الدم كله، مع زيادة الحساسية والخصوصية، سواء في المختبر وفي الجسم الحي12.

وعلى الرغم من تنفيذه الأولي كأداة تشخيصية مبكرة للتعرف السريع على بكتيريا GN كعوامل تسببية للإنتان، فقد تمت دراسة مستوى EA أيضًا كعلامة حيوية لشدة المرض. في هذا السياق، وقد ثبت أن تكون مفيدة بشكل خاص لتقييم حالة نقص التسريب بسبب الأمراض الحرجة المستمرة، مثل صدمة الصرف الصحي أو متلازمة ما بعد توقف القلب13. في الآونة الأخيرة، منذ تطوير أنظمة تنقية الهيموتنقية، كما تم اقتراح نتيجة إيجابية EA كأداة فحص لتحديد بدقة المرشحين المحتملين لمثل هذا العلاج14. أجرينا مؤخرا دراسة استعادية مراقبة حول انتشار ودلالة سريرية من مستويات عالية في وقت مبكر من EA في 107 المرضى الذين يعانون من صدمة الصرف الصحي. تمشيا مع النتائج الأخيرة الأخرى، وجدنا أن EA هو علامة واعدة من شدة المرض في المرضى الذين يعانون من صدمة الصرف الصحي15.

الهدف من هذه المخطوطة هو وصف طريقة إجراء الفحص EA، سواء في السرير أو في المختبر، ووصف استخدامه المحتمل في سيناريو تمثيلي لصدمة الصرف الصحي. هذه التقنية يمكن الكشف عن نشاط LPS عن طريق قياس انفجار الأكسدة المعززة في العدلات بعد فتيلة من قبل مجمعات من الأجسام المضادة للاندوتوكسين وLPS. يتم الكشف عن زيادة انفجار الجهاز التنفسي عن طريق مقياس الكيميلومين ويعتبر مقدار الضوء المنبعث متناسبا مع كمية الإندوتوكسين في عينة الدم. يتطلب فحص عدد قليل من الكواشف، ويستغرق حوالي 30 دقيقة لأداء ويستخدم أقل من 40 ميكرولتر من الدم كله12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتم تنفيذ البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المتعلقة بمعالجة العينات البيولوجية البشرية واتباع الإجراءات التشغيلية القياسية الحالية لمختبرنا السريري. يتبع استخدام بيانات EA والمعلومات السريرية للمرضى الذين يتم اختبارهم المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحث البشري في مؤسستنا.

1. معدات المختبرات ومحتويات مجموعة الفحص

  1. تخزين مجموعة EA في 2-8 درجة مئوية عندما لا تكون في الاستخدام.
  2. يتكون كل اختبار EA من 5 أنواع مختلفة من الأنابيب؛ استخدام كل واحد لجزء مختلف من الاختبار (انظر القسم 2).
    1. استخدام أنبوب #1 ("التحكم" أنبوب) لقياس النشاط القاعدية من الاندفاع التأكسدي غير محددة من العدلات المريض في غياب جسم مضاد معين.
    2. استخدام أنبوب #2 ("عينة" أنبوب) لقياس انفجار الأكسدة استجابة لمجمع LPS الأجسام المضادة.
    3. استخدام أنبوب #3 ("ماكس" أنبوب) لقياس الاندفاع التأكسدي الأقصى من العدلات المريض استجابة لفائض من endotoxin.
    4. استخدام أنبوب #4 (أنبوب "LPS") كمصدر للإندوتوكسين الخارجية.
    5. استخدام أنبوب #5 ("Aliquot" أنبوب) لتخزين الدم.
      ملاحظة: يتم توفير نسخ مكررة من الأنابيب #1 #2 #3 لما مجموعه 8 أنابيب لاستخدامها في كل عينة من عينات الدم التي يجري اختبارها (يمكن استخدام زجاجة كاشف EA واختبار مراقبة الجودة لجميع الاختبارات الواردة في الحقيبة).
  3. جمع عينات دم المريض في أنابيب معقمة تحتوي على مضادات التخثر EDTA. تخزين عينات الدم في درجة حرارة الغرفة قبل تشغيل اختبار EA.
  4. قبل بدء الاختبار، قم بتشغيل مقياس الكيميلومومتر والحاضنة شاكر. تدفئة الحاضنة إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  5. من الناحية المثالية، بدء معالجة العينة في غضون 30 دقيقة من جمع الدم.

2. إندوتوكسين النشاط التبيّن

  1. قم بإعداد أنابيب اختبار EA لعينة دم كل مريض تحتاج إلى اختبارها. وضع الأنابيب في رفوف أنبوب. ثم قم بإزالة القبعات.
  2. باستخدام كومبيبيت، ماصة حجم 1 مل من كاشف EA من زجاجة إلى أنابيب #1 (أنبوب التحكم)، #2 (أنبوب عينة) #3 (أنبوب ماكس)، كل واحد في مكررة.
    ملاحظة: ماصة أسفل الجانب من الأنبوب لتجنب حل الرش مرة أخرى.
  3. اخلط عينة دم المريض عن طريق عكس أنبوب جمع الدم برفق لمدة 20 مرة. ثم، ماصة 0.5 مل من دم المريض في أنبوب #4 (LPS أنبوب ماكس) #5 أنبوب (أنبوب Aliquot). أنبوب دوامة #4 لمدة 10 s.
  4. وضع رفوف أنبوب مع جميع أنابيب اختبار EA في شاكر حاضنة. أغلق الغطاء والحضانة لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  5. فتح الغطاء وإزالة رفوف أنبوب من شاكر حاضنة. دوامة أنبوب #5 (Aliquot أنبوب). باستخدام طرف معقم، ماصة 40 ميكرولتر من الدم في أنابيب #1 #2، في تكرار.
  6. دوامة أنبوب #4 (LPS أنبوب). باستخدام نفس طرف ماصة، ماصة 40 درجة مئوية من الدم من أنبوب #4 إلى أنبوب #3 (أنبوب ماكس)، في تكرار.
  7. دوامة أنابيب الاختبار النهائي الستة (#1، #2، #3، والتكرارات ذات الصلة)، ثم وضعها مرة أخرى في رفوفها.
    ملاحظة: تأكد من أن جميع الأنابيب هي دوامة لنفس الكمية من الوقت.
  8. وضع رفوف أنبوب مرة أخرى في شاكر الحضانة وإغلاق الغطاء. تعيين شاكر الحضانة في 100 دورة في الدقيقة، ثم بدء الحركة لمدة 14 دقيقة.
  9. إدراج بطاقة رقاقة EA المسمى في مقياس الكيميلومومتر والبدء في الصحافة. بعد الحضانة 14 دقيقة، اتبع التعليمات المعروضة على مقياس الكيميلوم لقراءة أنابيب EA في الترتيب الصحيح.
  10. دوامة بلطف كل أنبوب لمدة 10 s قبل وضعه على حامل عينة من مقياس الكيميلومين. فتح درج عينة ووضع أنبوب #1 في حامل العينة. ثم قم بإغلاق درج العينة وانتظر القراءة وحدة الضوء النسبي (RLU).
  11. كرر الخطوة 2.10 لأنبوب 2 و أنبوب 3.
  12. كرر الخطوة 2.10 للأنابيب المكررة 1 و 2 و 3.
    ملاحظة: حاول تشغيل كافة الأنابيب لنفس المقدار من الوقت أثناء الخطوات 2.10-2.12.
  13. بعد معالجة كافة الأنابيب، لاحظ أنه سيتم حساب نتائج EA وطباعتها تلقائيًا. يتم التعبير عن المستويات كوحدات EA وتمثل متوسط التحديدات المكررة من نفس العينات.
  14. كرر الخطوات من 2.2 إلى 2.13 لكل عينة دم تحتاج إلى اختبار.
  15. بمجرد الانتهاء من الفحص، قم بتخزين أنابيب الاختبار المتبقية وككواش EA عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 30 يومًا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وأدخل رجل يبلغ من العمر 72 عاما إلى قسم الطوارئ في مستشفى حضري أكاديمي. وقبل ذلك ببضعة أيام قدم إلى طبيب الرعاية الأولية يشكو من حرق التبول. وأوصى بإجراء علاج قصير مع فوسفومايسين عن طريق الفم. وشمل تاريخه الطبي ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري من النوع 2 غير المعقد، وتضخم البروستاتا الحميد. وشملت أدويته إينالابريل، أتورفاستاتين، تامسولوسين وميتفورمين.

في ED، كان الخمول، الخلط عندما استيقظ. وكانت درجة حرارته 39.1 درجة مئوية، وكان معد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

صدمة الصرف الصحي لا تزال في الوقت الحاضر المرتبطة بوفيات تصل إلى 40٪، على الرغم من أن هذا المعدل يختلف وفقا للتقارير النظر16. تدعو معظم الخبراء في المجالات إلى الحاجة إلى علامات حيوية جديدة وأفضل من أجل مساعدة الأطباء في التشخيصالمبكر، وتحسين الإدارة، والتنبؤ بالمرضى الذين يعانون من صدمة الصرف الصحي 6.

لا يتطلب إجراء اختبار EA معرفة تقنية سابقة أو معدات مختبرية متطورة، ويمكن لأي مقدم رعاية صحية أن يتعلم بسهولة وسرعة كيفية تشغيله. قد يساعد التحديد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وغطت شركة Estor SpA تكلفة رسوم النشر وإنتاج الفيديو في المجلة. وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

نشكر باولو براغانو وليزا ماتياسين، دكتوراه على استعراضمنهجية بروتوكول التقييم. قدم داريو وينترتون، دكتوراه في الطب مساعدة كبيرة في مراجعة المخطوطة لإتقان اللغة الإنجليزية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة EAASpectrum Medical Inc.EAAST-20مع 20 اختبارا + 1 مراقبة الجودة
Smart Line TLBertholdEAASLLuminometer
Heatr شاكرGRANTES-20شاكر حاضنة صغيرة
VortexerVWR 444-2790أداة دوامة
حزمة

المراجع

  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
  2. Takeda, K. Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors. Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).
  3. Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).
  4. Natanson, C., et al. Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock. The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).
  5. Suffredini, A. F., et al. The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin. The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).
  6. Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).
  7. Gupta, S., et al. Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes. Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).
  8. Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients. Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).
  9. Dellinger, R. P., et al. Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level. The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).
  10. Marshall, J. C., et al. Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study. The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).
  11. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).
  12. Marshall, J. C., et al. Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence. Critical Care. 6 (4), London, England. 342-348 (2002).
  13. Grimaldi, D., et al. High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock. Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).
  14. Klein, D. J., et al. The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 15, 218(2014).
  15. Bottiroli, M., et al. Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study. Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).
  16. Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).
  17. Biagioni, E., et al. Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study. Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).
  18. Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).
  19. Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study. Critical Care. 16 (3), London, England. (2012).
  20. Earley, Z. M., et al. Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation. PLoS One. 10 (7), (2015).
  21. Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. Incidental phenomenon or true pathology? Annals of Surgery. 218 (3), 321(1993).
  22. Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5. Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).
  23. Virzì, G. M., et al. Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin. in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).
  24. Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients. Infection. 42 (3), 521-528 (2014).
  25. Klein, D. J., et al. Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients. Shock. 28 (5), 524-529 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

LPS
فحص نشاط إندوتوكسين للكشف عن بطانة الدم الكاملة في المرضى الذين يعانون من أمراض خطيرة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.