يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

أسلوب في فيفو لدراسة سلامة حاجز الدم-الخصية الماوس

10.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58512

⸱

ديسمبر 2, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Nanjing Medical University, 2Center for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم سلامة حاجز الدم-الخصية عن طريق حقن الاينولين-فيتك في الخصيتين. هذا هو أسلوب فعال في فيفو لدراسة سلامة حاجز الدم-الخصية التي يمكن أن تتأثر بالعناصر الوراثية والبيئية.

الملخص

الحيوانات المنوية هو تطوير spermatogonia إلى المني ناضجة في الخصي للخصية. ويدعم هذه العملية تقاطعات خلية سيرتولي على حاجز الدم-الخصية (الفيرمونت)، وهو أشد الحاجز الأنسجة في جسم الثدييات ويعزل ظهارة سيمينيفيروس في مقصورات اثنين، القاعدية وأدلومينال. BTB يخلق المكروية فريدة من نوعها للخلايا الجرثومية في الانقسام الاختزالي أنا/الثاني ومن أجل تطوير بوستميوتيك لوحظت في المني عن طريق سبيرميوجينيسيس. هنا، يمكننا وصف مقايسة موثوق بها رصد سلامة BTB الماوس الخصية في فيفو. BTB سليمة كتل نشر مترافق FITC الاينولين من القاعدية لحجرة قمي للخصي. هذا الأسلوب مناسبة لدراسة الجينات المرشحين أو الفيروسات أو السموم البيئية التي قد تؤثر على دالة BTB أو السلامة، مع إجراء سهل واشتراط الحد أدنى من المهارات الجراحية مقارنة بالأساليب البديلة.

المقدمة

وتعتبر الثدييات الحيوانات المنوية عملية التنظيم تضم spermatogonial الذاتي تجديد والتمايز من خلال سبيرماتوسيتيس في المني فرداني عن طريق الانقسام، والانقسام، وسبيرميوجينيسيس، خلالها مثيرة تحدث التغييرات البيوكيميائية والمورفولوجية. يتم نقل الخلايا الجرثومية النامية تدريجيا من قاعدة أنبوب seminiferous نحو التجويف. وينظم هذه العملية خلية خلية الاتصالات بين الخلايا الجرثومية وخلايا سيرتولي1،2. تشكيل خلايا سيرتولي مجاورة BTB الذي يقع قرب القاعدة لأنبوب سيمينيفيروس. الفيرمونت جسديا يقسم الظهارة القاعدية وحجرة أدلومينال. خلال مراحل الثامن-التاسع دورة الظهارية، ترحيل سبيرماتوسيتيس بريليبتوتيني/leptotene من المقصورات القاعدية عبر الفيرمونت، دخول المقصورات أدلومينال3. ولذلك، وظيفة BTB توفير المكروية إيمونوبريفيليجيد لإنهاء الانقسام وسبيرميوجينيسيس4،،من56. خلافا للدم-الأنسجة حواجز أخرى (مثلاً، حاجز الدم في الدماغ) التي تتكون فقط من تقاطعات ضيق (TJs)، BTB شكلتها أربعة تقاطعات مختلفة (TJs التخصصات ectoplasmic وتقاطعات الفجوة، والمتوسطة المستندة إلى خيوط desmosomes) بين Sertoli الخلايا1،7.

واستخدمت العديد من الدراسات الفئران المعدلة وراثيا، وحالات العدوى بالفيروس، وسميات البيئية للتحقيق في آليات BTB السلامة7،،من89. تعطيل BTB يدفع ضعف الحيوانات المنوية والحيضيه أو العقم. منذ تشكيل BTB وسلامة تأكدت أن تتأثر الاتصالات بين خلايا سيرتولي8، نموذجا في المختبر استناداً إلى الثقافة الأولية من خلايا سيرتولي معزولة وقد استخدمت لدراسة الفيرمونت. ومع ذلك، لا يمكن دقة تقليد هذا النموذج BTB ديناميات فيفو. وعلاوة على ذلك، تم إنشاء لا ثقافة المشارك هذه الخلايا الجرثومية مع خلايا سيرتولي كما يمكن أن يعكس جميع المكونات الهيكلية والوظيفية ذات الصلة من10،BTB11.

وبصفة عامة، في فيفو BTB سلامة فحوصات عادة استناداً إلى جزيئات صغيرة، مثل وصلة لوبيس سولفو-دائرة الصحة الوطنية--LC-البيوتين ومترافق FITC inulin (الاينولين-فيتك). عادة، يتم حظر نشر البيوتين أو الاينولين-فيتك من حجرة القاعدية بهيكل الفيرمونت. ولذلك، نحن قادرون على استخدام هذا الأسلوب لتقييم مدى الضرر BTB مقارنة مع مجموعات المراقبة. بينما يمكن أن يثير الشبهة BTB مع أنواع معينة من المنبهات، مثل المعاملة مع (كدكل2) كلوريد الكادميوم12، يصبح BTB موجوداً للجزيئات الصغيرة، الذي أدخل حجرة أدلومينال في نهاية المطاف كمؤشرات.

أوائل في فيفو BTB سلامة مقايسة ينطوي على حقن البيوتين أو الاينولين-فيتك في حبل الوريد، الذي ينطوي على جراحة، والغازية، ومعقدة وتستغرق وقتاً طويلاً. إلى جانب ذلك، كالمواد مراسل منتشر عبر الجسم كله عن طريق الدورة الدموية، يقتصر تركيز المحلية البيوتين أو الاينولين-فيتك في الخصي. وعلاوة على ذلك، قد حمل التعرض للمنهجية ردود فعل المناعة. نقدم هنا، بسيطة وفعالة في فيفو BTB سلامة مقايسة تمكين الحقن المباشر قاسمة صغيرة من الاينولين فيتك في إينتيرستيتيوم للخصية. استخدام الفلورية وسم الأسلوب، عملية المصبوغة مريحة، كما الأجسام المضادة الثانوية غير مطلوبة. وهنا، هو تصور عملية صبغة الفلورسنت الدخول في الخصية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع التجارب على الحيوانات المؤداة أقرتها لجنة جامعة نانجينغ الطبية. وأبقى تحت ظروف كبيرة التي تسيطر عليها الفئران الذكور C57BL/6 وزودت بالغذاء والماء.

1-الأعمال التحضيرية

  1. Microinjection الشعيرات الدموية
    1. استخدام microinjection الشعيرات الدموية مع القطر الخارجي، ديميتر الداخلية، وطول من 1.0 مم و 0.8 ملم 10.0 سم، على التوالي.
    2. سحب الزجاج الشعيرات الدموية مع ساحبة شعرية (الشكل 1A). اختبار وقم بضبط الإعدادات حسب الجهاز ساحبة الشعرية الذي يتم استخدامه.
    3. كسر نصائح ماصة بالملقط للحصول على الشعيرات الدموية ليبلغ قطرها 50 ميكرومتر في التلميح.
      ملاحظة: قد تكون النصائح وقتاً طويلاً لاختراق في الخصية.
    4. شحذ الحافة بزاوية 30 درجة باستخدام بيفيلير ميكروبيبيتي (الشكل 1).
  2. الكواشف
    1. تحضير الصوديوم بينتوباربيتال 1%: حل بينتوباربيتال الصوديوم 100 مغ في 10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) (الخطوة 2.3.3).
    2. إعداد 10 ملغ/مل الاينولين-فيتك: حل الاينولين-فيتك 1 ملغ في 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني (الخطوة 2.1.6).
    3. إعداد بارافورمالدهيد 4%: حل بارافورمالدهيد (PFA) ز 4 في 100 مل من برنامج تلفزيوني (الخطوة 2.3.3).
    4. إعداد السكروز 30%: حل السكروز الجيل الثالث 3g في 10 مل من برنامج تلفزيوني (الخطوة 2.3.4).
    5. إعداد 0.1% كلوريد الكادميوم: حل كلوريد الكادميوم ملغ 10 في 10 مل من برنامج تلفزيوني (الخطوة 2.1.1).

2-أساليب

  1. إعداد التخدير وبريسورجيري
    1. وزن عمرها 8 الأسبوع C57BL/6 ذكور الفئران وحساب الجرعة اللازمة من كدكل2. علاج مجموعة من الفئران (n = 3) مع كدكل2 (يتعلق 5 مغ/كغ، القائمة) لمد 3 قبل الجراحة. التعامل مع مجموعة أخرى من الفئران الذكور C57BL/6 8 عاماً في الأسبوع (n = 3) مع برنامج تلفزيوني كعنصر التحكم.
    2. إجراء عمليات جراحية تحت ظروف معقمة باستخدام المحاقن المعقمة وابرة ومقص وملقط.
    3. إعداد حل العامل التخدير الطازجة. الجرعة المطلوبة من التخدير 70 ملغ من الصوديوم بينتوباربيتال/كغ وزن الجسم. في المتوسط، يزن ماوس C57BL/6 الكبار في 8 أسابيع عمر ~ 25 زاي، الذي يقابل ميكروليتر 175 1% بينتوباربيتال الصوديوم (ملغ 1.75 في الماوس).
      ملاحظة: يتم حل بينتوباربيتال الصوديوم في المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS). الحل هو تصفية بواسطة 0.22 أم وحدة التصفية قبل استخدامها.
    4. تنظيف المنطقة للجراحة مع الإيثانول 75% وتغطية المنطقة بمنشفة نظيفة أنسجة.
    5. قم بتشغيل سخان ترموستاتي وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
    6. إعداد حل عملي الاينولين-فيتك (10 مغ/مل) في اليوم لعملية جراحية.
  2. إجراء العمليات الجراحية
    1. وزن عمرها 8 الأسبوع C57BL/6 ذكور الفئران وحساب الجرعة اللازمة للتخدير.
    2. إجراء حقن داخل الصوديوم بينتوباربيتال استخدام المحاقن المعقمة 1 مل. ضع الماوس في قفص نظيف.
    3. مراقبة استجابة منعكس العين ونمط التنفس من الماوس للتأكد من أن ذلك يتم تحت التخدير الكامل.
      ملاحظة: عادة، 10-15 دقيقة ضرورية حتى يتم تخديره الماوس عميق، مع الافتقار التام إلى استجابة قرصه أخمص القدمين والحفاظ على التنفس بطيء وثابت.
    4. حرك الماوس إلى منطقة العملية وتغطية منطقة العين مع ورقة الأنسجة رطبة لتجنب جفاف أثناء التخدير (الشكل 2A).
    5. حلق شعر البطن لها مع آلة حلاقة وتطهير منطقة الجراحة مع الإيثانول 75%.
    6. مع مقص حاد، جعل شق جلد 1 سم فوق الغدد بريبوتيال لفضح جدار البطن. رفع جدار البطن بالملقط الصغيرة وشق 0.5 سم لفضح التجويف الصفاقى (الشكل 2).
    7. استخدام الملقط للبحث عن منصات الدهون حول البربخ والخصية. بعناية سحب منصات الدهون لفضح الخصية المرفقة وضوح (الشكل 2 و 2D). عادة ما تعمل على الخصية واحدة في وقت واحد.
      ملاحظة: تجنب لمس منصات الدهون والخصية بيديه.
    8. ضع ورقة (9 سم في القطر) تحت منصات الدهون والخصية (الشكل 2).
    9. حقن ماصة microinjection فيتك الاينولين وتوصيله إلى وحدة ميكرومانيبولاتور (الشكل 1). برفق إدراج ماصة microinjection تحت albuginea الغلالة وتحميل ما مجموعة 20 ميكروليتر من الاينولين فيتك في إينتيرستيتيوم للخصية (الشكل 2E و 2F).
      ملاحظة: بعناية كساد ماصة microinjection لتجنب نقله.
    10. رصد حركة الاينولين-فيتك في الخصية (الشكل 2).
    11. فورا مرة أخرى الخصية في تجويف البطن بعد انتهاء الحقن.
    12. كرر الإجراء في الخصية كونترالاتيرال. يتم حقن هذه الخصية مع 20 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني كعنصر تحكم.
    13. إغلاق الجلد خياطة الجروح جراحية وتحريك الماوس إلى لوحة حرارة من سخان ترموستاتي (الشكل 1B). إدارة جرعة مقدارها 1 مغ مسكن (البوبرينورفين) كل 1 كغم من وزن الجسم عن طريق الحقن تحت الجلد.
  3. الحصاد في الخصيتين وإعداد الأجزاء المجمدة
    1. euthanize الماوس المستلم بخلع عنق الرحم وفقا لرعاية الحيوان 40 دقيقة بعد الحقن، واستخدام المبادئ التوجيهية.
    2. استخدام زوج من مقص حاد لجمع الخصيتين. وضع الخصيتين في 1 مل من برنامج تلفزيوني المثلج لإزالة أي تلوث الدم.
    3. إصلاح الخصيتين في بارافورمالدهيد 4% (PFA) في 4 درجات مئوية على 12-24 h. تجاهل 4% منهاج عمل بيجين وغسل الأنسجة 3 x مع 1.5 مل من برنامج تلفزيوني 1% عند درجة حرارة الغرفة.
    4. يذوي الأنسجة في السكروز 30% بين عشية وضحاها. وضع في الخصية في الإطار التضمين وتغطية الأنسجة بدرجة الحرارة المثلى قطع مجمع (OCT). بعد أن يتم تجميد OCT، ملء هذا الإطار التضمين مع أكتوبر حيث أن الخصية كلها يمكن أن تكون مغطاة باكتوبر.
    5. قطع المقاطع العرضية 5 ميكرومترات-سميكة، المجمدة الخصيتين في كريوستات في-20 درجة مئوية، والسماح لهم بالانضمام إلى شرائح المجهر.
      ملاحظة: إعادة تجميد الأنسجة المضمنة في الثلج الجاف قد يزيد صلابة للقطع.
  4. طلب الصورة
    1. ضع الشرائح في مربع هوميديفيد. الحارة الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    2. تغسل الأجزاء 3 x مع تريس مخزنة المالحة (تبس) في درجة حرارة الغرفة.
    3. أيردري لمدة 5 دقائق في الظلام. تمحو أي تبس المتبقية مع ورقة خالية من الغبار.
    4. تغطية المقاطع العرضية مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI). ضع ساترة مقلوب على شريحة مجهر.
    5. الحصول على الصور باستخدام مجهر [كنفوكل]. إجمالي 20 X التكبير يكفي بوجه عام للكشف عن إشارة الزاهية الفلورسنت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الإعداد التجريبية لإجراء فحص سلامة BTB يرد في الشكل 1. سحب وشحذ microinjection الشعيرات الدموية مع ساحبة الشعرية وبيفيلير ميكروبيبيتي، على التوالي (الشكل 1A وج 1). سخان ترموستاتي ومعدات microinjection موضحة في الشكل 1 باء و دال 1.

الشكل 2 يعرض بعض الخطوات الرئيسية لحقن فيتك الا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يأخذ مكانة في ظهارة سيمينيفيروس الحيوانات المنوية وهو عملية مرتبة للغاية والدينامية التي تحكمها الخلايا الجرثومية وخلايا جسدية (مثلاً، خلايا سيرتولي)13. هيكل الفيرمونت، الذي يتكون من خلايا سيرتولي، يقسم ظهارة سيمينيفيروس القاعدية وحجرة قمي. تنمية الخلايا الجرثومية فرداني وهو يحدث في حجرة قمي الذي يشكل حاجز مناعي14.

يمكن أن يثير الشبهة الدالة الفيرمونت سميات أو بسبب وجود عيوب في الجينات المشاركة في تشكيل الوصلات الخلية، مما يؤدي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

هذا العمل كان يدعمها R مفتاح الوطنية & د البرنامج الصيني (2016YFA0500902)، الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (31471228, 31771653)، ومؤسسة العلوم جيانغسو "العلماء الشبان البارزين" (BK20150047)، العلوم الطبيعية مؤسسة من مقاطعة جيانغسو (BK20140897، 14KJA180005) والبرنامج المبتكرة والمشاريع الخاصة من مقاطعة جيانغسو إلى K.Z.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجتذب الشعيرات الدموية أداة سوتر (الولايات المتحدة الأمريكية)P-97
10x PBSHyclone (الولايات المتحدة الأمريكية)SH30258.01التخفيف إلى 1 & مرات ؛ في DDH 2< / sub >O
4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma (الولايات المتحدة الأمريكية)F6057
مجهر التصاقCITOGLAS (الصين)80312-3161
كلوريد الكادميومSigma (الولايات المتحدة الأمريكية)655198-5G
مجهر متحد البؤرZeiss (ألمانيا)LSM700
ورق خال من الغبارKimberly-Clark (الولايات المتحدة الأمريكية)34120
Inulin-FITCSigma (الولايات المتحدة الأمريكية)F3272
الشعيرات الدموية بالحقنالدقيق Zhengtianyi (الصين)BJ-401.0 مم & مرات 0.8 مم   & مرات 100 مم
ماصة دقيقة شطوفةNARISHIGE (اليابان)EG-400
أكتوبرساكورا (اليابان)4583
بارافورمالدهايدسيجما (الولايات المتحدة الأمريكية)P6148
بنتوباربيتال الصوديومميرك (ألمانيا)P11011
ماكينة حلاقة ياشين (الصين)
مجهر ستيريونيكون (اليابان)SMZ1000
السكروز سانجون للتكنولوجيا الحيوية (الصين)A610498
الأدوات الجراحيةأقوى (الصين)مقص ، ملقط ، حامل إبرة
حقنةKDL (الصين)201631505180.45 مم & مرات ؛ 0.16 مم RW LB
سخان ترموستاتيKELL (نانجينغ ، الصين)KEL-2010
<قوي>10x TBS ، درجة الحموضة 7.6< / قوي>
0.2 م تريسسانغون للتكنولوجيا الحيوية (الصين)A600194
1.37 م NaclSangon Biotech (الصين)A610476
شرائح

المراجع

  1. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
  2. Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042(2016).
  3. Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
  4. Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
  5. O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue? Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
  6. Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152(2012).
  7. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
  8. Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
  9. Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
  10. Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
  11. Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
  12. Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
  13. Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
  14. Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
  15. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
  16. Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
  17. Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis? Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
  18. Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
  19. Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).
  20. Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
  21. Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Inulin FITC Cryostat
أسلوب في فيفو لدراسة سلامة حاجز الدم-الخصية الماوس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.