استخدام النظم الآلية للعملية وتضمين Colonic موريني عينات لإجراء تحاليل نسيجية

Summary

الافتقار إلى التوحيد القياسي لتجهيز الأنسجة موريني يقلل نوعية التحليل نسيجية موريني مقارنة بالعينات البشرية. نقدم هنا، وضع بروتوكول لتنفيذ دراسة نسيجية مورين الأنسجة colonic ملتهبة وأونينفلاميد لإظهار جدوى نظم الروبوتية المستخدمة بصورة روتينية لتجهيز وتضمينها العينات البشرية.

Abstract

فهم الأمراض البشرية قد اتسع إلى حد كبير بفضل دراسة نماذج حيوانية. ومع ذلك، يلزم نسيجية تقييم نماذج تجريبية دقيق الذي طبق للعينات البشرية. في الواقع، استخلاص نتائج موثوق بها ودقيقة حاسمة تتأثر بنوعية إعداد قسم الأنسجة. هنا، نحن وصف بروتوكول نسيجية تحليل الأنسجة موريني الذي يقوم بتنفيذ عدة خطوات الآلي أثناء الإجراء، من إعداد أولية لتضمين البارافين العينات موريني. يسهم في الحد المتغيرات المنهجية من خلال توحيد بروتوكول صارم من إجراءات التشغيل الآلي إلى زيادة الموثوقية العام للتحليل الباثولوجي مورين. على وجه التحديد، يصف استخدام التجهيز الآلي لهذا البروتوكول وتضمين أنظمة روبوتية، المستخدمة بشكل روتيني لمعالجة الأنسجة وتضمين البارافين العينات البشرية، لمعالجة العينات مورين من التهاب الأمعاء. نخلص إلى أن موثوقية نسيجية فحص الأنسجة مورين هو زيادة كبيرة عند إدخال تقنيات موحدة ومؤتمته.

Introduction

في العقود الأخيرة، وضعت عدة نماذج تجريبية لتشريح الآليات المسببة للأمراض المؤدية إلى الأمراض البشرية^1،2. من أجل تقييم مدى خطورة المرض، يجب تقييم تأثير العلاج الباحثين ودراسة الاختلافات المعمارية الخلوية وغذائها أو مقدار التهاب³. هناك حاجة لتنفيذ تلك النماذج التجريبية، تحليلاً مفصلاً نسيجية، غالباً ما مقارنة العينات مورين والبشرية^4،5.

بالإضافة إلى ذلك، عادة تجهيز العينات البشرية وسجل بالمرافق الأساسية التشريح المرضى والباثولوجيا البشرية ذوي الخبرة من خلال معايير نسيجية وأساليب موحدة. على العكس من ذلك، الأنسجة موريني هي عادة ثابتة والمضمنة وتحليلها من قبل الباحثين ذوي الخبرة المحدودة للبروتوكولات نسيجية. نوعية وموثوقية لدراسة نسيجية يبدأ بإعداد أقسام الأنسجة عالية الجودة. هناك عدة عوامل تساهم حاسمة في زيادة أو انخفاض نوعية التحليل النهائي، بما في ذلك التثبيت، العيانية تمزيقها، والتجهيز، البارافين التضمين، والتضمين من عينات^6،7.

وتخضع جميع هذه المقاطع التي تنطوي على التلاعب بالعينة الأخطاء اليدوية، بما في ذلك الدمج اليدوي للعينات، وإلى حد أقل، مبضع اليدوي تمزيقها وتلطيخ. في الوقت الحاضر، تعتمد العملية برمتها من إعداد الأنسجة مورين للتقييم النسيجي على البروتوكولات التي تختلف من مختبر إلى مختبر والبروتوكولات اليدوي. والهدف من هذه الدراسة لتنفيذ بروتوكولات موحدة الآلي لتقليل الأخطاء وتقلبه في دراسة نسيجية موريني.

على حد علمنا، يصف لنا هنا البروتوكولات الأولى للأنسجة مؤتمتة بالكامل تجهيز وتضمينها للتقييم النسيجي للأنسجة مورين؛ هذه تستخدم بشكل روتيني في وحدات علم الأمراض لتحليل العينات البشرية. كمثال عملي لجدوى هذه الطريقة، نموذج موريني من التهاب الأمعاء قد تم تحليلها، أي,، النموذجي التهاب القولون المزمن الناجم عن الإدارة المتكررة من كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) في مياه الشرب^{8 ،9}. هذا الإعداد التجريبية عن كثب يشبه التهاب الأمعاء البشرية من الأمراض (بنك التنمية بين الأمريكتين)¹⁰ منذ DSS معاملة الحيوانات يحمل علامات التهاب الأمعاء، مثلاً، فقدان الوزن، البراز فضفاضة أو الإسهال، وتقصير القولون وكذلك التليف ^89،،11. كما لاحظ للبشرية بنك التنمية بين الأمريكتين المرضى، يولد العلاج مفاجآت دورة مرض معقدة. في هذا السياق، يلزم وضع تقييمات النسيجي فهم التغيير العميق لهندسة الأنسجة. وبالتالي، تنفيذ البروتوكولات وصف لزيادة جودة إعداد عينة قد تفيد الباحثين الاعتماد على تفسير النسيجي والمناعي ويحلل لإعدادات التجريبية موريني. مورين نماذج تجريبية من الأمراض البشرية التي تنطوي على التعديلات لهندسة الأنسجة، وجود ارتشاح النسيج الخلوي أو التهاب في مختلف الأنسجة والأعضاء (الأمعاء، المخ، الكبد، الجلد) يمكن استخدام زيادة نوعية إعداد نموذج لدراسة نسيجية.

Protocol

إجراءات الحيوان كانت وافقت عليها وزارة الصحة (المصادقة 127/15، 27/13) الإيطالية واتبعت المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان للمعهد الأوروبي لعلم الأورام إياكوك (لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان مؤسسية)

1. المزمن التهاب القولون التعريفي بالإدارة المتكررة مفاجآت صيف دبي

1. العمر منفصلة والجنس مطابقة الفئران في المجموعات 2 (العلاج DSS مقابل السيطرة ح₂س، ليتيرماتيس الفئران على الأقل 5 كل مجموعة تجريبية).
2. إدارة 2.5% DSS (كاتشين 40) في مياه الشرب 7 أيام لمجموعة العلاج والمياه للسيطرة على المجموعة.
   ملاحظة: يدفع هذا النموذج التهاب الأمعاء مزمن ترانسمورال⁹.
3. بعد 7 أيام، وقف العلاج DSS وإعطاء المياه لكلا الفريقين لمدة 14 يوما. كرر هذه العملية 3 مرات.
   ملاحظة: الإدارة المتكررة من مفاجآت الحث على التعديلات في الغشاء المخاطي colonic تشبه البشرية بنك التنمية بين الأمريكتين، أي، التليف⁹.
4. التضحية الفئران وفقا للإجراءات التي إذن بها IACUC المؤسسية، أي، باستنشاق أول أكسيد الكربون₂ .
5. فتح البطن الماوس والغشاء البريتوني مع مشرط.
   ملاحظة: أوصى بالعقم ولكن لا يتطلبه.
6. فصل القولون من الأمعاء بالملقط وملاقط. المكوس القولون بملاقط والملقط.
   ملاحظة: قياس طول القولون (الشكل 1A) أسلوب لتحديد إذا حدث التهاب القولون في الفئران المعالجة بمفاجآت صيف دبي.
7. شطف القولون في طبق بتري مع 10 مل من البرد 1 × الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (PBS)، واضغط برفق لإزالة المواد البرازية.

2-مورين الأنسجة التثبيت

1. تزج كل عينة القولون مورين في 10 مل من 10% محايدة مخزنة الفورمالين (NBF) في الرايت (درجة حرارة الغرفة).
   ملاحظة: أوصى بالعقم ولكن لا يتطلبه.
2. إصلاح الأنسجة ح 18 – 24 في الرايت

3-القولون تمزيقها وإعداد الأنسجة

1. إزالة الأنسجة الثابتة من الحاوية NBF بملاقط صغيرة، ووضعها في طبق بتري. وضع النقطتين على لوحة عمل تقطيع بملاقط صغيرة.
2. قص نقطتين في الأجزاء (سم 0.2 إلى 0.3 سم أطوال) مع مشرط معقم. طول هذا الجزء الأمثل كي لا يتجاوز سمك الكاسيت.
3. التقاط قطعة واحدة القولون بملاقط صغيرة (الشكل 2A). إدراج مقطع واحد القولون في واحدة من البلاستيك جاحظ نصائح البارافين الموجه التضمين كاسيت بملاقط صغيرة (الشكل 2).
4. كرر العملية (3.2-3.3) مع أجزاء القولون 3 إضافية كل كاسيت. تجنب إدراج الشرائح في نصائح بارزة المتاخمة، للتقليل من التداخل في الأنسجة
5. أحكام إغلاق الكاسيت عن طريق دفع بعناية الحواف الأربع (الشكل 2). تجنب الضغط على الأنسجة لمنع تلف الأنسجة.
6. إدراج الشبكة في إطار دعم بلاستيك. قم بتسمية الإطار الداعم لتحديد العينة. كرر لكل عينة بيولوجية.

4-الأنسجة المعالجة

1. قم بتشغيل المعالج التلقائي بالضغط على زر الطاقة (الشكل 3 أ، 3).
2. الحارة ح 1 لضمان ذوبان شمع البارافين. الانتظار حتى يؤكد الصك ذاب تماما البارافين، ملاحظاً وجود رمز مخصص (الشكل 3).
3. إدراج كل توجه كاسيت (التي تحتوي على عينات الأنسجة) يدوياً في سلة معدنية يقدمها المعالج الآلي (3D الشكل). ضع أشرطة الكاسيت عمودياً ببطانة لهم قريبة من واحدة إلى أخرى لتحسين شغل سلة.
4. إغلاق سلة معدنية (3E الشكل).
5. افتح غطاء المعوجة (3F الشكل). المعوجة هو المكان حيث يتم إدراج السلة في الجهاز. إدراج السلة في مساكن مخصصة للمعالج (الشكل 3). أغلق غطاء المعوجة (الشكل 3 ح).
6. استخدام شاشة تعمل باللمس على الكمبيوتر أداة لتعريف البروتوكول العامل (الرقم 3I). اختر التسلسل للحلول وتوقيت ودرجة الحرارة التي ستنفذ وفقا للنظام المنصوص عليه في الجدول 1.
7. تعيين البروتوكول ليتم تشغيلها في المعوجة التي تحتوي على السلة بالنقر على أيقونة كمبيوتر مخصص (3J الشكل). بدء تشغيل البروتوكول بالنقر فوق الزر ابدأ (الشكل 3 لتر).
8. الانتظار حتى الصك يؤكد نهاية البروتوكول، ملاحظاً وجود رمز مخصص وسماع نغمة إنذار قادمة من الجهاز.
9. قم بفتح الغطاء معوجة. إزالة السلة من المعالج (الشكل 3 م).

5-الأنسجة التضمين

1. قم بتشغيل امبيدير الآلي بالضغط على زر الطاقة (الشكل 4 أ).
2. الحارة ح 1 لضمان ذوبان شمع البارافين. الانتظار حتى يؤكد هذا الصك البارافين ذاب تماما بمراقبة درجة حرارة حمام البارافين يتبين من الحرارة الداخلية للصك.
3. نقل جميع أشرطة الكاسيت المجهزة يدوياً من سلة المعالج إلى رف امبيدير. يمكن أن تحتوي كل حامل الأشرطة يصل إلى 32. (الشكل 4 باء، ج 4).
4. افتح غطاء امبيدير الرئيسي (الشكل 4، 4 د، 4E).
5. استخدام شاشة تعمل باللمس على الكمبيوتر أداة للإشارة إلى الآلية للنظام الذي رف يتم إدراجها (4F الشكل).
6. افتح غطاء مدخل السكن (الشكل 4). إدراج الرف في مدخل السكن. يمكن أن تحتوي كل امبيدير على رفوف تصل إلى 4 في وقت واحد (الشكل 4 ح، 4I). أغلق الغطاء الإسكان مدخل (الرقم 4J).
7. استخدام شاشة تعمل باللمس على الكمبيوتر أداة لبدء إجراء الدمج، وفقا الجدول 2 (الشكل 4 ك).
   ملاحظة: يأخذ كل حامل الأشرطة 32 45 دقيقة تكون مضمنة.
8. الانتظار حتى الصك يؤكد نهاية البروتوكول، ملاحظاً وجود رمز مخصص (الشكل 4 لتر).
9. قم بإزالة الحامل منفذ (الشكل 4 م). أغلق الغطاء امبيدير الرئيسي.
10. إزالة كتل مضمن (التي تحتوي على خطوط الاتجاه) من على الرف. نقل كتل المضمنة في صندوق من الورق المقوى تخزين.

6-ميكرومتر تمزيقها

1. قم بتشغيل لوحة التبريد مبضع. ضبط درجة حرارة بين-8 و-10 درجة مئوية.
2. قم بتشغيل حوض ماء ترموستاتي مبضع، الذي يحتوي على 2 لتر ماء المقطر. تعيين درجة حرارة الحمام المياه بين 42-45 درجة مئوية.
3. مكان البارافين تضمين كتل على لوحة التبريد. انتظر على الأقل 5 دقائق للسماح للكتل لتبرد.
4. تأخذ كتلة واحدة من لوحة التبريد ووضعه داخل حامل كتلة مبضع.
5. تعيين مبضع قطع سمك إلى 10 ميكرون. تقليم الكتلة بقطع عليه 6 مرات في 10 ميكرون سمك.
6. تغيير إعداد سمك مبضع من 10 ميكرون إلى 3 ميكرومتر. قطع واحد 3 ميكرومتر قسم لتوضع وويوزين تلطيخ (H & E).
7. جمع القسم 3 ميكرومتر مع فرشاة صغيرة. وضع القسم 3 ميكرومتر في حوض ماء، زرعها بعناية على سطح الماء لتقليل التجاعيد الأنسجة. جمع قسم الأنسجة من حمام المياه التي تسيطر عليها حرارياً على شريحة زجاجية واحدة.
   1. إذا لزم الأمر، قص مقاطع إضافية.
8. تسمية الشريحة الزجاجية بكتابة تحديد العينة.
9. وضع الشرائح في فرن 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل.
10. وضع الشرائح الزجاجية في رفوف للتحليلات الفورية أو في صناديق تخزين.

7-توضع وتلطيخ ويوزين (H & E)

1. التبديل الملطخ الآلي بالضغط على زر الطاقة. السماح التهيئة للذراع الروبوتية، وعن طريق مراقبة التغيير لتحميل شريط على الشاشة أداة.
2. إدراج الشرائح الزجاجية في الرف الملطخ، عمودياً إدراج شرائح يصل إلى 30.
3. قم بتسمية الحامل مع علامة تعريف (RFID) تردد الراديو المناسبة البلاستيك. ونظام تحديد البروتوكول المصبوغة الصحيح تحميله إلى الكمبيوتر الملطخ علامات RFID.
4. إدراج الملطخ الرف. السماح للكمبيوتر بتحميل وبدء تشغيل البروتوكول المصبوغة وفقا للاعتراف بالعلامة تتفاعل تلقائياً.
   ملاحظة: البروتوكول لتلطيخ ح & ه يرد في الجدول 3-

8-المناعي تلطيخ

1. أداء المناعي و Mallory trichrome تلطيخ كما هو موضح سابقا⁷.

Results

التجريبية التهاب القولون المزمن الناجم عن الإدارة المتكررة لإدارة السلامة والأمن في مياه الشرب نموذج موريني من التهاب الأمعاء تشبه^8،بنك التنمية بين الأمريكتين البشرية⁹. ويصف الشكل 1 آثار العلاج إدارة السلامة والأمن، بما في ذلك القولون تقصير (الشكل 1A)، معلمة تستخدم على نطاق واسع لنقاط وجود التهاب المستحثة بمفاجآت صيف دبي، والتعبير colonic برو التحريضية الجينات بما في ذلك ...

Discussion

فنحن نستخدم مختلف الخطوات الآلي أثناء إعداد الأنسجة مورين لتحليل الأنسجة. ويهدف هذا البروتوكول توفير تلميحات التقنية لزيادة في إمكانية تكرار نتائج والتوحيد للعملية برمتها، ومن ثم تعزيز الجودة الشاملة للتقييم النهائي نسيجية. قمنا بتنفيذ الصكوك الآلي وأساليب الإعداد والتضمين من الأنسجة، وتستخدم بشكل روتيني في علم الأمراض المرافق الأساسية لدراسة العينات البشرية.

وللتدليل على إمكانية تطبيق هذا الأسلوب، اخترنا إعداد تجريبية مورين مزمنة من التهاب الأمعاء، يسمى نموذج التهاب القولون المزمن الناجم عن م...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
الإيثانول المطلق اللامائي	كارلو إربا	كاشف 414605
المطلق ETOH	Honeywell	02860-1L
كاشف كبريتات البوتاسيوم الألومنيوم	SIGMA	A6435	كاشف
أنيلين الأزرق	SIGMA	كاشف 415049
كاربول فوشين	SIGMA	C4165	كاشف
CD11b (استنساخ M1 / 70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	الجسم المضاد
CD20 IHC (استنساخ SA275A11)	Biolegend	150403	الجسم المضاد
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	الجسم المضاد
CD4 (GK1.5) BD	Biosciences	552051	الجسم المضاد
CD45.2 (استنساخ 104) BioLegend		109837	الجسم المضاد
CD8 (53-6.7)	دينار بحريني Biosciences	553031	الأجسام المضادة
Citrate Buffer درجة الحموضة 6 10x	SIGMA	C9999	كاشف
Dab	Vector Laboratories	كاشف SK-4100	كاشف
DPBS 1x	Microgem	L0615-500	كاشف
DSS	TdB Consultancy	DB001	كاشف
EDTA	SIGMA	E9884	كاشف
EnVision Flex كاشف حجب البيروكسيديز	DAKO		compreso في GV80011-2
EnVision Flex Substrate	DAKO		compreso في GV80011-2
EnVision Flex / HRP	DAKO		compreso في GV80011-2
EnVision Flex + Rat Linker	DAKO		compreso في GV80011-2
Eosin	VWR	1.09844	كاشف
F4 / 80 (استنساخ BM8)	BioLegend	123108	الجسم المضاد
الفورمالين	PanReac	2،529،311،215	كاشف
حمض الخليك الجليدي	SIGMA	71251	كاشف
الماعز المضاد للجرذان HRP	Agilent DAKO	P0448	الجسم المضاد
للهيماتوكسيلين	DIAPATH	C0303
كاشف LEICA الروتاري الميكروتوم (RM2255)	لايكا	RM2255	المعدات
Ly6g (استنساخ 1A8)	BD Biosciences	551459	الجسم المضاد
Mercury II أكسيد	SIGMA	كاشف
203793 Omnis Clearify عامل المقاصة	DAKO	CACLEGAL	الكاشف
Omnis EnVision Flex TRS	DAKO	GV80011-2	كاشف
البرتقال G	SIGMA	O3756	كاشف
البارافين	كاشف ساكورا	7052
معدات بيلوريس	ليكا
كاشف Percoll	SIGMA	P4937
RPMI 1640 بدون كاشف L-Glutamine	Microgem	L0501-500	كاشف
STS020	معدات Leica
Tissue-Teck Paraform كاسيت قابل للتقسيم	SAKURA	7022	معدات
Tissue-Tek تضمين البارافين الآلي	معدات ساكورا
كاشف Xylene	JT Baker	8080.1000