مقالة منهجية

تقييم التفاعل بين بروتين C1Q وحمض الهيالورونيكس في تعزيز التصاق الخلايا

DOI:

10.3791/58688

⸱

يونيو 15, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, University of Trieste, 2Institute for Maternal and Child Health, IRCCS (Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico) Burlo Garofolo, 3Department of Medical, Surgical and Health Science, University of Trieste

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مكون تكملة C1q هو جزيء الموالية للالتهابات أعرب بشدة في الأنسجة microenvironment التي يمكن أن تتفاعل مع مصفوفة خارج الخلية. هنا، ونحن نوصف طريقة لاختبار كيف C1Q ملزمة لحمض الهيالورونيكس يؤثر التصاق الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد ثبت بشكل متزايد أن البيئة الدقيقة الورم يلعب دورا نشطا في نمو الورم والانبثاث. من خلال مسارات مختلفة، يمكن للخلايا السرطانية تجنيد الخلايا الجذعية والمناعية والبطانية بكفاءة عن طريق إفراز العوامل المحفزة، والكيماويات والسيتوكينات. بدوره، يمكن لهذه الخلايا تغيير خصائص الإشارات للبيئة الدقيقة عن طريق الإفراج عن إشارات تعزيز النمو، المستقلبات ومكونات المصفوفة خارج الخلية للحفاظ على الانتشار العالي والكفاءة النقيلية. في هذا السياق، نحدد أن مكون تكملة C1q، الذي يعبر عنه محلياً مجموعة من الأورام الخبيثة البشرية، عند التفاعل مع حمض الهيالورونيكس المصفوفة خارج الخلية، يؤثر بشدة على سلوك الخلايا الأولية المعزولة عن الورم البشري العينات. هنا، ونحن نوصف طريقة لاختبار كيف C1q ملزمة حمض الهيالورونيكس (HA) يؤثر على التصاق الخلايا السرطانية، الكامنة وراء حقيقة أن الخصائص البيولوجية للمكونات الرئيسية للمصفوفة خارج الخلية (في هذه الحالة HA) يمكن أن تشكل ها بإشارات نشطة بيولوجيا نحو الورم التقدم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تؤثر البيئة الصغرية للورم (TME) على تطور السرطان وتطوره لأنه يمكن أن يوفر مكانة متساهلة لبقاء الخلايا ونموها وغزوها. قد يكون تحديد اللاعبين الرئيسيين الجدد في TME مفيدًا لاكتشاف أدوات جزيئية جديدة للعلاج المستهدف. TME يتضمن شبكة معقدة وديناميكية من الخلايا غير الخبيثة، مثل الخلايا البطانية، الخلايا الليفية وخلايا الجهاز المناعي، جزءا لا يتجزأ من مكونات المصفوفة خارج الخلية المحيطة (ECM) بما في ذلك الكولاجين، laminins، فيبرونيكتينس، البروتيوغليكانوهيون وهيالورونان. كل من الخلايا الورم ية وغير الورم توليف وإفراز مكونات ECM جنبا إلى جنب مع السيتوكينات, chemokines, عوامل النمو والالتهابات ومصفوفة إعادة عرض الإنزيمات التي تغير عموما الخصائص الفيزيائية, الكيميائية والإشارة من TME. ومن بين هذه المكونات، ظهر حمض الهيالورونيكس (HA) لممارسة دور حاسم في علم الأحياء الورم. على الرغم من تركيبتها الكيميائية البسيطة، يمكن ها، جنبا إلى جنب مع جزيئاتها ملزمة HA (hyaladherins)، تعديل الأوعية، واستجابة الجهاز المناعي وإعادة عرض ECM في حجم والتركيز طريقة تعتمد1.

كما أن نظام التكملة (جيم) هو أيضاً جزء من النظام المحلي للإدارة التكميلية، الذي حظي مؤخراً باهتمام متزايد. ويشمل نظام C مجموعة من البروتينات القابلة للذوبان والأغشية المرتبطة المشاركة في خط الدفاع الأول ضد الخلايا غير الذاتية والعناصر المضيفة غير المرغوب فيها ومسببات الأمراض. وظيفيا، وC يربط الأسلحة ذات تأثيرين من النظم الفطرية والتكيفية لتعزيز إما القتل المباشر للخلايا أو تصاعد استجابة التهابية2. يمكن تفعيل C قمع نمو الورم، عن طريق تدمير الخلايا السرطانية أو تثبيط نموها، ولكن أصبح من الواضح بشكل متزايد أنه يمكن أن تمتلك نشاط تعزيز الورم من خلال الحفاظ على التهاب مزمن، وتعزيز إنشاء وسط كبت المناعة، مما يحفز توليد الأوعية، وتفعيل مسارات الإشارات المتعلقة بالسرطان3. في هذا السياق، C1q، وقد ظهرت أول جزيء الاعتراف من المسار الكلاسيكي للنظام C لممارسة وظائف هامة في microenvironment الورم بشكل مستقل عن C تفعيل4. وقد تبين أن C1q يتم التعبير عنها محليا من قبل مجموعة من الأورام الخبيثة البشرية، حيث يمكن أن تفضل التصاق الخلايا السرطانية والهجرة والانتشار بالإضافة إلى تكوين الأوعية والانبثاث5. ومن المثير للاهتمام C1q يتفاعل مع أحد المكونات الرئيسية لـ ECM مثل HA.

لقد طورنا تقنية لعزل الخلايا السرطانية الأولية عن كتلة الورم. وعلاوة على ذلك، أنشأنا المصفوفة، والتي يمكن أن تحفز الورم microenvironment، وخاصة التفاعل بين C1q وارتفاع حمض الهيالورونيكس الجزيئي. C1q ملزمة إلى HA كان قادرا على الحث على التصاق الخلايا السرطانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم جمع عينات الأنسجة من المرضى بعد موافقة مستنيرة بعد موافقة المجلس المؤسسي للمستشفى الجامعي في تريستا، إيطاليا.

1. عزل ة ية الخلية والثقافة (اليوم 1)

  1. عزل خلايا ورم الظهارة المتوسطة البشرية من العينات الصلبة MPM. فرم ناعما الأنسجة مع قطع للحصول على شظايا من حوالي 2-3 مم2 في الحجم واحتضان في 5 مل من حل الهضم تتألف من حل الملح المتوازنة هانكس (HBSS) تستكمل مع 0.5 m Ca2 +/ ملغ2 +، 0.5٪ تريبسين و 50 ميكروغرام / مل DNase I، بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  2. عزل ةية الخلية والثقافة (اليوم الثاني)
    1. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، ضع الأنسجة المهمدة لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.
    2. استبدل محلول الهضم عند التمركز (250 x ز) مع 3 ملغ / مل كولاجينز نوع 1 إذاحل في 5 مل من متوسط 199 مع HBSS واحتضان مزيد لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.
    3. منع رد الفعل الأنزيمي عن طريق إضافة 10٪ من حرارة الجنين المعطلة عنقله مصل الأبقار (FBS). إعادة تعليق الخلايا بعناية فائقة مع أنبوب 5 مل لضمان أن يتم تحرير معظم الخلايا من الأنسجة. ثم قم بتصفية تعليق الخلية من خلال فلتر المسام 100 ميكرومتر.
    4. البذور الخلايا في 12.5 سم2 قارورة والثقافة لهم في 37 درجة مئوية مع الخلايا البطانية البشرية المتوسطة خالية من المصل (HESF)، مع FBS 10٪ وتستكمل مع EGF (10 نانوغرام / مل)، FGF الأساسية (20 نانوغرام / مل)، و 1٪ البنسلين- ستربتوميسين.
      ملاحظة: يستعاض عن هاوب الوسط الطازج كل يومين أو ثلاثة أيام.

2. ها طلاء (اليوم 1)

  1. إعادة تعليق الوزن الجزيئي العالي HA (1.5 kDa) في الماء المقطر المزدوج بتركيز 1 ملغ / مل6.
  2. حل مخزون HA المخفف إلى 50 ميكروغرام / مل في الكربونات / بيكربونات العازلة (0.1 متر، ودرجة الحموضة 9.6) مع الأنابيب لطيف.
  3. معطف لوحة 96 جيدا مع 100 ميكرولتر من حل مخزون ها المخفف في بئر جيدا بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: كان حمض الهيالورونيكس هدية طيبة من البروفيسور إيفان دوناتي،قسم علوم الحياة، جامعة تريست7 .

3. C1q طلاء (اليوم 2)

  1. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، فراغ يستنشق الآبار المعالجة وغسل لوحة 96 جيدا مع 100 لتر من PBS دولبيكو (dPBS) في البئر.
  2. السماح لC1q (25 ميكروغرام/مل أو تركيزات مختلفة لتجارب استجابة الجرعة) أو BSA (كتحكم سلبي) لربط البلاستيك المعطل-HA عن طريق احتضان هذه البروتينات في تركيز 25 ميكروغرام / مل في 100 ميكروغرام / لتر من dPBS + 0.5٪ BSA و 0.7 mCa2 +/ ملغ 2 + ملغ . ثم تحضن بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  3. فراغ يستنشق الآبار وغسل لوحة 96 جيدا مع 100 ميكرولتر / جيدا من dPBS.

4. وضع العلامات الخلية مع سريع دي

  1. إعادة تعليق 1 x 105 خلايا الورم في 500 ميكرولتر من dPBS تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من الصبغة الفلورسنت داي سريع. احتضان لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية في 5٪ V /v CO2 حاضنة لوضع العلامات، والاختلاط يدويا بعد 5 دقائق فترات.
    1. لإزالة فائض سريع ديي، إضافة 10 مل من dPBS، ماصة بلطف صعودا وهبوطا، والطرد المركزي في 250 x ز لمدة 7 دقائق.

5. التصاق الخلية على المصفوفات HA/ C1q (اليوم 1)

  1. فراغ يستنشق الآبار المغلفة مع المصفوفات المختلفة (كانت مغلفة الآبار في الخطوة 3.2).
  2. توزيع 100 μL من تعليق الخلية المسمى إلى الآبار المغلفة واحتضان لوحة لمدة 35 دقيقة في 37 درجة مئوية في 5٪ v/v CO2 حاضنة.
  3. إزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق اسبة supernatant. غسل مرة واحدة مع dPBS تحتوي على 0.5٪ BSA، 0.7 m Ca2+ و 0.7 m Mg2+.
  4. لالخلايا المعتنقة بإضافة 200 μL/well من 10 m Tris-HCl, pH 7.4 + 0.1% v/v SDS وقراءة لوحة 96-well على الفور مع قارئ الفلورسنت (544 نانومتر, انبعاث 590 نانومتر) باستخدام منحنى المعايرة التي تم إنشاؤها من خلال الليسيس من عدد متزايد من المسمى الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HA هو السكاريد عالي الوزن المشحون ة سلبيا، والذي يتكون من تكرار (β، 1-4) - حمض الغلوكورونيك -(β، 1-3) -N-أسيتيل-D-الجلوكوزامين d d d ddisaccharide الوحدات (الشكل1B)7. اختبر البروز من الالتصاق ال [ه] على ال [96-ولّ] لوحة [أس ولّ] الفعالية من [إيمّلّج] ه كان معزّزة من [بيتينّلتد] [ه] ([بيو-ه]). وقد أعيد تعليق تركيزات مختلفة من بيو - ها، تتراوح بين 10 ميكروغرام/مل و1 ملغم/مليلتر، في 100 مليكربونة/بيكربونات-حاجز درجة الحموضة 9.6 وتحنى بين ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف طريقة سهلة للتحقيق في كيفية تكملة مكون C1q، والتفاعل مع حمض الهيالورونيكس، قادرة على تعديل سلوك الخلايا الأولية المعزولة من أنسجة الورم البشري. كل من HA و C1q موجودة بوفرة في الأنسجة microenvironment سواء في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية، والمشاركة في العديد من العمليات البيولوجية الخلية. على سبيل المثال، وقد ثبت C1q أن تكون موجودة في البيئة الدقيقة من المشيمة حيث أنها تفضل غزو تروفيوبلاست خارج من نبالة الأم أثناء المشيمة8. كما يتم إيداع C1q في الجلد شفاء الجروح حيث أنه يعزز عملية الأوعية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر إيفان دوناتي على توفيرها لـ HA وليوناردو أماديو وغابرييلا زيتو (قسم أمراض النساء في المركز الدولي للدراسات الجنائية في المركز الدولي للدراسات الجنائية في مدينة "بيرلو غاروفولو"، في تريستا، إيطاليا) وأندريا رومانو (وحدة العمليات السريرية لعلم التشريح وعلم الأنسجة المرضية، مستشفى كاتينارا، تريست، إيطاليا ) لجمع عينة الأنسجة. كما نشكر نيكولو موروسيني على المساعدة في إعداد الفيديو وأليكس كوبولا، الصوت. وقد دعم هذا العمل منح من معهد صحة الأم والطفل، ومؤسسة "بيرلو غاروفولو"، ومؤسسة ترييستي، إيطاليا (RC20/16)، ومؤسسة كاسا دي ريسابروميو تريستا إلى ر. بولا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 & thinsp ؛ ومايكرو. مرشح المسام مBD Falcon352360
محلول الأمفوتريسين B (fungizone)Sigma-Aldrich   ؛1397-89-3
أساسيات FGFImmunological SciencesGRF-15595
كلوريد الكالسيومسيجما-ألدريتش & nbsp ؛C-4901
كولاجيناز النوع الأولشركة ورثينجتون للكيمياء الحيوية ، DBAMX1D12644
D-GlucoseSigma-Aldrich & nbsp ؛50-99-7
DNase I Roche10 104 159 001
EDTASigma-Aldrich 60-00-4
EGFالعلوم المناعيةGRF-10544
FAST DiIالمجسات الجزيئية ، Invitrogen ، Thermo Fisher ScientificD7756
مصل الأبقار الجنينيGibco ، & nbsp ؛ Thermo Fisher Scientific10270-106
FibronectinRoche11051407001
قارورة لزراعة الخلاياCorning430639معقم وجيد التهوية
Sigma-Aldrich & nbsp ؛G1397-10ML
هانك محلول الملح المتوازن (HBBS) سيجما ألدريتش H6648مكمل ب EDTA والجلوكوز والبنسلين والستربتاميسين والجنتاميسين والفطريات
الوزن الجزيئي حمض الهيالورونيكهدية لطيفة من البروفيسور إيفان دوناتي
مصل البطاني البشري المجاني المتوسطة Gibco,  ثيرمو فيشر العلمي11111-044مكمل ب EGF (5 & thinsp; نانوغرام / مل) ، FGF الأساسي (10 & thinsp ؛ ng / mL) ، و   ؛ 1٪ البنسلين & - ndash ؛ الستربتومايسين (سيجما ألدريتش)
كلوريد المغنيسيومكارلو إربا13446-18-9
متوسط 199 مع هانك s saltSigma-Aldrich M7653
البنسلين - الستربتومايسينسيجما - ألدريتش   ؛P0781
الفحص المجهري بفاصل زمني نيكون نظام التصوير: BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA ReaderFlow Labs
TrypsinSigma-Aldrich تي 4674
محلول Gentamicin عالية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
  2. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
  3. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
  4. Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346(2016).
  5. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23(2015).
  6. Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
  7. Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
  8. Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
  9. Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).
  10. Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
  11. Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).
  12. Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
  13. Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
  14. Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Complement Protein C1qHyaluronic AcidCell AdhesionExtracellular MatrixTumor MicroenvironmentEnzyme Linked Immunosorbent AssayFluorescent Cell LabelingStandard Curve GenerationCoating ProcedureCell Adhesion Assay

مقالات ذات صلة