وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

Summary

هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لمعالجة الترميز (مرناً) وانخفاض غير الترميز جلوبين (نكرنا) مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي من عينة واحدة من دم كله.

Abstract

حلول مبتكرة وقوية على نحو متزايد تقنيات التسلسل الجيل القادم وقد فتحت آفاقاً جديدة في القدرة على دراسة التعبير الجيني الأساسية المتصلة بالعمليات البيولوجية للفائدة. ليس فقط تسمح هذه الابتكارات الباحثين مراعاة التعبير من تسلسل مرناً أن التعليمات البرمجية للجينات أن الدالة effect الخلوية، ولكن أيضا جزيئات الحمض النووي الريبي (نكرنا) غير الترميز التي تظل غير مترجمة، ولكن لا تزال لديها مهام تنظيمية. على الرغم من أن الباحثين لديها القدرة على مراقبة التعبير مرناً ونكرنا، قد جرت العادة لدراسة التركيز على واحدة أو أخرى. ومع ذلك، عند الدراسات المهتمة بالتعبير مرناً ونكرنا، مرات عديدة يستخدمونها عينات منفصلة دراسة الترميز أو غير الترميز الكشف بسبب الاختلاف في الاستعدادات مكتبة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى الحاجة إلى مزيد من العينات التي يمكن أن تزيد من الوقت والمواد الاستهلاكية، والإجهاد الحيوانية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه قد يسبب الباحثين أن تقرر إعداد العينات لتحليل واحد فقط، وعادة ما تكون مرناً، مما يحد من عدد الأسئلة البيولوجية التي يمكن أن تحقق. ومع ذلك، تمتد نكرناس فئات متعددة مع الأدوار التنظيمية التعبير مرناً أثر ذلك. لأن نكرنا الهامة للعمليات البيولوجية الأساسية واضطراب في هذه العمليات في أثناء الإصابة، يجوز، ولذلك تقدم أهدافا جذابة للمداواة. يوضح هذه المخطوطة بروتوكول معدل لتوليد مرناً والحمض النووي الريبي غير الترميز التعبير المكتبات، بما في ذلك الجيش الملكي النيبالي الفيروسية، من عينة واحدة من الدم كله. الأمثل لهذا البروتوكول، تحسين نقاء الحمض النووي الريبي وزيادة ربط لانتعاش الكشف ميثليته وأغفلت حجم التحديد، للسماح بالتقاط أكثر الأنواع الجيش الملكي النيبالي.

Introduction

تسلسل الجيل القادم (خ ع) برز كأداة قوية لتحقيق التغيرات التي تحدث على مستوى الجينوم من الكائنات البيولوجية. إعداد نموذج لأساليب خ ع يمكن أن تختلف تبعاً للكائن الحي، ونوع الأنسجة، والأهم من ذلك الأسئلة الباحثون حريصون على العنوان. وقد تحول العديد من الدراسات إلى خ ع كوسيلة لدراسة الاختلافات في التعبير الجيني بين الدول مثل الأشخاص الأصحاء والمرضى^1،2،،من³⁴. تأخذ تسلسل وضع على أساس جينوم كله ويسمح لباحث الاستيلاء معظم، أن لم يكن كل، المعلومات الجينومية لعلامة الوراثية خاصة في وقت تشير.

العلامات الأكثر شيوعاً للتعبير و....

Protocol

بروتوكولات الحيوان أقرتها لجنة الاستخدام والمركز الوطني للأمراض الحيوانية (وزارة الزراعة-أرس-نادك) العناية بالحيوان.

1-جمع الدم الخنازير عينات

1. جمع عينات الدم في أنابيب الجيش الملكي النيبالي. جمع ~2.5 مل أو أكثر إذا كانت أكبر مجموعة أنابيب متوفرة.

2-تجهيز الدم الخنازير عينات

1. الطرد المركزي أنابيب الدم في 5,020 س ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية). إذا كان تجهيز تجميد عينات احتضان أنبوب في درجة حرارة الغرفة الحد الأدنى من ح 2 قبل الطرد المركزي.
2. إزالة المادة طافية وإضافة 8 مل مياه خالية من رناسي لبيليه. إغلاق ودوامه بيليه حتى أنه هو حل....

Results

هي عينات ممثلة في دراستنا جلوبين وعينات الدم كله المنضب ريبو. نتائج تمثيلية للبروتوكول يتكون من نموذج مكتبة المنضب جلوبين مع عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) أعلاه 7 (الشكل 1) و 260/280 nm نسب تركيز أو أعلى 2 (الشكل 1ب وج 1). تم إجراء التحقق من صحة نتائج العينة باستخدام جهاز المطياف الضوئي لإعطاء التركيز النهائي لكل مكتبة والقائم على رقاقة التفريد إعطاء رقم رين جنبا إلى جنب مع رسم بياني للقمم .......

Discussion

وشملت الخطوة الحاسمة الأولى في البروتوكول التي جعلت من الأمثل الخطوات استنفاد جلوبين المضافة، التي جعلت من الممكن الحصول على نوعية ما يلي من عينات الدم كله. واحدة من أكبر القيود المفروضة على استخدام الدم كله في تسلسل الدراسات هي أرقام عالية من يقرأ في العينة خريطة لجزيئات جلوبين والحد من القراءات التي يمكن تعيينها إلى جزيئات أخرى لفائدة¹⁸. ولذلك، في الاستفادة المثلى من البروتوكول لأن نوع العينة، أننا بحاجة إلى إدراج خطوة استنفاد جلوبين لضمان أعلى ممكن مرناً والحمض النووي الريبي غير ترميز التقاط عن.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
أنابيب PAXgene	PreAnalytix	762165
البيولوجيا الجزيئية الصف المياه	ThermoFisher	10977-015
mirVana miRNA Isolation	Kit ThermoFisher	AM1560
Rneasy MinElute Clean Up	QIAGEN	74204
100٪ Ethanol	Decon Labs، Inc.	2716
0.2 مل أنابيب رقيقة الجدران	ThermoFisher	98010540
1.5 مل RNase / DNase - أنابيب خالية من	الأنابيب أي مورد
Veriti 96-well Thermocycler	ThermoFisher	4375786R
Globin Reduction Oligo (& alpha 1)	أي تسلسل مورد		GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Globin Reduction Oligo (& alpha ؛ 2)	أي تسلسل مورد		TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
اختزال الغلوبين أوليغو (Β 1)	أي تسلسل مورد		AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
الغلوبين أوليغو (Β 2)	أي تسلسل مورد		GGT TCA GAG AAA GGG CTC CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization
، درجة الحموضة 7.6	فيشر Scientific	BP1757-100-KCl
	Millipore Sigma	60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
؛ -Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.6	فيشر Scientific	BP1757-100
؛ -DTT	ThermoFisher	Y00147
؛ -MgCl 2 < / sub >	Promega	A351B
-البيولوجيا الجزيئية الصف المياه	ThermoFisher	10977-015
RNase H	ThermoFisher	AM2292
SUPERase-IN	ThermoFisher	AM2694	مثبط Rnase
EDTA	Millipore Sigma	E7889
أجهزة الطرد المركزي	الدقيقة أي مورد
؛ 2100 أداة الرحلان الكهربائي BioAnalyzer	Agilent Technologies	G2938C
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA  Kit	Agilent Technologies	5067-4626
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit مع Ribo-Zero & nbsp ؛	Illumina	RS-122-2201	mRNA ؛ مجموعة الإنسان / الماوس / الفئران A   ؛ (48 عينة ، 12 مؤشر)
TruSeq تقطعت بهم السبل إجمالي دليل تحضير عينة الحمض النووي	الريبي Illumina		متاح على الإنترنت
RNAحبات XP	BeckmanCoulter	A63987
AMPure XP Beads	BeckmanCoulter	A63880
MicroAmp البصري 8 أنابيب شريط	ThermoFisher	N8010580	0.2 مل أنابيب رقيقة الجدران MicroAmp
بصري 8 أنابيب شريط كاب	ThermoFisher	N801-0535
RNase / DNase - خزانات الكاشف الحرة	أي مورد
SuperScript II Reverse Transcriptase	ThermoFisher	18064-014
MicroAmp Optical 96 ألواح بئر	ThermoFisher	N8010560	تم استخدامها بدلا من ألواح .3 مل حسب الحاجة
لاصق بصري MicroAmp	ThermoFisher	4311971
NEBNext Multiplex مكتبة الحمض النووي الريبي الصغيرة مجموعة الإعدادية ل Illumina & reg ؛ (المجموعة 1)	مجموعة New England Biolabs	E73005	Small RNA
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina & reg ؛ (المجموعة 2)	مجموعة الحمض النووي الريبي الصغيرة من نيو إنجلاند Biolabs	E75805
طقم تنقية QIAQuick PCR	QIAGEN	28104
96S لوحة مغناطيس فائقة	ALPAQUA	A001322