Method Article

تنقية خطوة واحدة من المجمعات الجزيئات باستخدام الحمض النووي الريبي يعلق على البيوتين ورابط صور كليفابل

DOI:

10.3791/58697

⸱

January 3rd, 2019

 ,  , 
1Integrative Program for Biological and Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجيش الملكي النيبالي/البروتين المجمعات تنقيته باستخدام استراتيجية ستريبتافيدين botin هي التيد للحل في ظل الظروف يشوه بشكل غير مناسب لمزيد من التنقية والتحليل الوظيفي. وهنا يصف لنا تعديل هذه الاستراتيجية التي تستخدم رابط صورة كليفابل في الجيش الملكي النيبالي، وخطوة شطف الأشعة فوق البنفسجية لطيف، تسفر عن مجمعات الجيش الملكي النيبالي/البروتين الأصلي وتعمل بكامل طاقتها.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لسنوات عديدة، استخدمت بنجاح قوية على نحو استثنائي وشكلت سرعة تفاعل البيوتين وستريبتافيدين لتنقية جزئية هامة بيولوجيا الحمض النووي الريبي/البروتين المجمعات. إلا أن هذه الاستراتيجية تعاني من عيب رئيسي واحد يحد من استخدامها الأوسع: تفاعل البيوتين/ستريبتافيدين يمكن كسرها إلا بمعرفة الظروف التي تعطل أيضا سلامة مجمعات الوتيد، ومن ثم تحول دون بهم تحليل وظيفي اللاحقة و/أو تنقية كذلك بطرق أخرى. وباﻹضافة إلى ذلك، العينات التيد غالباً ملوثة بالبروتينات الأساسية التي تربط نونسبيسيفيكالي بالخرز streptavidin، تعقيد تحليل المجمعات المنقي تلطيخ الفضة والطيف الكتلي. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير البديل من البيوتين/ستريبتافيدين الاستراتيجية التي يتم إرفاق البيوتين الركيزة الحمض النووي الريبي عن طريق رابط صورة كليفابل ومجمعات معطلة على الخرز streptavidin هي التيد بشكل انتقائي للحل في النموذج الأصلي بموجة طويلة الأشعة فوق البنفسجية، تاركاً البروتينات الخلفية في الخرز. يمكن توليفها أقصر من ركائز ربط الحمض النووي الريبي كيميائيا مع البيوتين ورابط الصورة كليفابل تساهمي يعلق على نهاية 5 ' من الجيش الملكي النيبالي، بينما أطول الحمض النووي الريبي ركائز يمكن أن تقدمها مع الفريقين اليغنوكليوتيد تكميلية. تم اختبار هذه نوعين مختلفين من الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية لتنقية U7 سنرنب-تعتمد على تجهيز المجمعات أن تنشق هيستون قبل-مرناس في نهاية 3 ' وكلاهما أثبت إيجابية مقارنة بأخرى قبل وضع أساليب تنقية. عينات التيد الأشعة فوق البنفسجية الواردة مبالغ سنرنب U7 التي كانت خالية من الملوثات الرئيسية البروتين ومناسبة للتحليل المباشر من الطيف الكتلي والاختبارات الوظيفية سهولة الاكتشاف. يمكن تكييفها لتنقية مجمعات ربط الحمض النووي الريبي الأخرى الأسلوب الذي وصف بسهولة واستخدامها بالاقتران مع مواقع مفرد، ومزدوج تقطعت الحمض النووي ملزم لتنقية البروتينات الخاصة بالحمض النووي ومجمعات الجزيئات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حقيقيات النوى، يخضع السلائف مرناً ولدت الثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي (قبل-مرناس) عدة أحداث نضج في النواة قبل أن تصبح قوالب مرناً تعمل بكامل طاقتها تخليق البروتين في السيتوبلازم. واحد من هذه الأحداث نهاية تجهيز 3 '. للغالبية العظمى من قبل-مرناس، تتضمن 3 ' المعالجة نهاية الانقسام بالإضافة إلى بوليادينيليشن. هذا رد فعل خطوتين هو تحفزها وفيرة نسبيا معقدة تتألف من أكثر من 15 البروتينات1. معالجة ما قبل الحيوانية المعتمدة على النسخ المتماثل هيستون-مرناس في نهاية 3 ' بواسطة إليه مختلفة التي الدور الرئيسي الذي تؤديه سنرنب U7، وفرة منخفضة معقدة تتألف من سنرنا U7 ~ 60 النيوكليوتيدات والبروتينات متعددة2،3 . زوج قاعدي سنرنا U7 مع تسلسل معين في هيستون قبل-مرناً وواحدة من الوحدات فرعية سنرنب U7 يحفز رد فعل الانقسام، وتوليد هيستون الناضجة ذيل مرناً دون poly(A). هيستون-مرناً قبل نهاية تجهيز 3 ' يتطلب أيضا حلقة الجذعية ملزمة البروتين (سلبب)، الذي يربط حلقة جذعية مصانة يقع المنبع لموقع الانقسام ويعزز تجنيد سنرنب U7 إلى الركيزة2،3. الدراسات الرامية إلى تحديد المكونات الفردية سنرنب U7 كانت صعبة بسبب تركيز منخفض من سنرنب U7 في الخلايا الحيوانية، واتجاه المجمع ننأى أو الخضوع proteolysis الجزئي أثناء تنقية نتيجة استخدام المنظفات خفيفة4،،من56ويغسل الملح عالية و/أو متعددة الخطوات الكروماتوغرافي7،،من89.

لتحديد تكوين الآلية U7-تعتمد على المعالجة، وكان المحتضنة جزء قصير من هستون مرناً قبل المحتوية على البيوتين في 3 أو 5 ' مع خلاصة نووية مؤخرا، وتم القبض على مجمعات المجتمعون في المغلفة ستريبتافيدين [اغروس] الخرز5،،من610. بسبب تفاعل قوية على نحو استثنائي بين البيوتين و streptavidin، الوتيد تحت يشوه الظروف من الغليان في الحزب الديمقراطي الصربي بروتينات معطلة على الخرز ستريبتافيدين وتحليلها بواسطة تلطيخ الفضة والطيف الكتلي. بينما هذا النهج بسيطة حددت عددا من عناصر سنرنب U7، أسفرت عن عينات بدائية نسبيا، وغالباً ما تكون ملوثة بعدد كبير من البروتينات الخلفية نونسبيسيفيكالي ملزمة بالخرز ستريبتافيدين، يحتمل أن إخفاء بعض عناصر إليه معالجة ومنع الكشف عنها على الفضة الملون الهلام5،،من610. الأهم من ذلك، يمنع هذا النهج أيضا أي الدراسات الفنية مع المواد المعزولة وفي تنقية إضافية إلى التجانس بطرق إضافية.

واقترح عددا من التعديلات على مر الزمن لمعالجة الطبيعة تقريبا لا رجعة فيه تفاعل البيوتين/streptavidin، مع معظمهم ويجري تصميم أما يضعف التفاعل أو تقديم ذراع مباعدة كيميائيا كليفابل في المحتوية على البيوتين الكواشف11،12. وكان الجانب السلبي لجميع هذه التعديلات أنها تقلل إلى حد كبير كفاءة الأسلوب و/أو الشروط غير الفسيولوجية المطلوبة غالباً أثناء الخطوة شطف، يعرض للخطر سلامة أو نشاط البروتينات المنقاة.

وهنا يصف لنا مقاربة مختلفة لحل المشكلة الكامنة استراتيجية البيوتين/ستريبتافيدين باستخدام الحمض النووي الريبي نهاية ركائز التي أرفقت البيوتين تساهمي إلى 5 ' عبر ' 1 صور--كليفابل-(2-نيتروفينيل) moiety إيثيل هو حساسة للأشعة فوق البنفسجية13،14موجه طويلة. وقمنا باختبار هذا النهج لتنقية إليه تجهيز U7-تعتمد على الحد من المورفولوجية والثدييات النووية مقتطفات15. معطلة في الخرز streptavidin عقب حضانة قصيرة من هستون مرناً قبل المحتوية على البيوتين ورابط صور كليافابلي مع خلاصة نووية، مجمعات المعالجة المجمعة وغسلها جيدا وصدر برفق للحل في مسقط النموذج قبل التعرض للضوء ~ 360 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية. أسلوب الأشعة فوق البنفسجية-شطف جداً فعالة وسريعة وواضحة، مما أسفر عن كميات كافية من سنرنب U7 تصور مكوناته بالشظية تلطيخ من قدر ضئيل من 100 ميليلتر من استخراج15. المواد التيد الأشعة فوق البنفسجية خال من البروتينات أساسية ومناسبة لتحليل الطيف الكتلي المباشر وخطوات تنقية إضافية وفحوصات الانزيمية. قد اعتمدت نفس الأسلوب لتطهير المجمعات الحمض النووي الريبي/البروتين الأخرى التي تتطلب مواقع ربط الحمض النووي الريبي قصيرة نسبيا. البيوتين ورابط الصورة كليافابلي يمكن أيضا تساهمي إرفاق إلى واحد-ومزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي، واحتمال توسيع نطاق الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية لتنقية مختلف الحمض النووي/البروتين المجمعات.

التوليف الكيميائي للحمض النووي الريبي الركازات المحتوية على تساهمي تعلق البيوتين ورابط الصورة كليفابل العملي فقط مع تسلسل التي لا تتجاوز النيوكليوتيدات ~ 65، أصبحت مكلفة وغير فعالة لتسلسل أطول بشكل ملحوظ. ولمعالجة هذه المشكلة، وضعنا أيضا نهج بديل مناسب لأهداف ملزمة الحمض النووي الريبي أطول بكثير. في هذا النهج، والجيش الملكي النيبالي من أي طول والنوكليوتيدات تسلسل الذي تم إنشاؤه في المختبر بالنسخ T7 أو SP6 وتعتيق إلى اليغنوكليوتيد تكميلية قصيرة التي تحتوي على البيوتين ورابط الصورة كليفابل في 5 ' نهاية (ترانس التكوين). مزدوج الناتجة بعد ذلك، تستخدم لتنقية البروتينات الربط الفردي أو مجمعات الجزيئات في الخرز streptavidin بعد البروتوكول نفسه وصف لركائز الجيش الملكي النيبالي المحتوية على البيوتين كليفابل الصور المرفقة تساهمي (رابطة الدول المستقلة التكوين). مع هذا التعديل، يمكن استخدام البيوتين صور كليفابل بالاقتران مع في المختبر التي تم إنشاؤها بالنصوص التي تحتوي على مئات النيوكليوتيدات، توسيع نطاق الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية للتنقية لنطاق واسع من الجيش الملكي النيبالي/البروتين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد الركيزة

ملاحظة: ركائز رنا أقصر من النيوكليوتيدات ~ 65 يمكن توليفها كيميائيا مع البيوتين (ب) ورابط الصورة كليفابل (pc) (المشار إليها معا البيوتين صور كليفابل أو ثنائي الفينيل متعدد الكلور) تساهمي يعلق على الحمض النووي الريبي 5 ' نهاية (تكوينرابطة الدول المستقلة ). بحاجة لأن يتم إنشاؤه في المختبر بالنسخ T7 (أو SP6) ركائز الجيش الملكي النيبالي الذي يحتوي على مواقع الربط أطول بشكل ملحوظ وتعتيق في وقت لاحق إلى اليغنوكليوتيد قصيرة محول تكميلية المحتوية على ثنائي الفينيل متعدد الكلور moiety في نهاية 5 ' (عبر التكوين) (الشكل 1).

  1. لمواقع الربط التي تتكون من أقل من 65 ~ النيوكليوتيدات، استخدام منتج تجاري (جدول المواد) كيميائيا توليف الحمض النووي الريبي للفائدة مع ثنائي الفينيل متعدد الكلور تساهمي يعلق على الحمض النووي الريبي 5 ' نهاية (الشكل 1A و 2A الشكل). تذوب في الماء المعقم لتحقيق التركيز المطلوب وتخزينها في مختبرين الصغيرة في-80 درجة مئوية.
  2. لمواقع الربط إلى حد كبير أطول من النيوكليوتيدات ~ 65، النموذج الاتجاه جزئي في المختبر إنشاء الجيش الملكي النيبالي للفائدة واليغنوكليوتيد محول تكميلية التي تحتوي على مجموعة ثنائي الفينيل متعدد الكلور في 5 ' نهاية (الشكل 3A).
    1. إجراء النسخ T7 الحمض النووي بلازميد خطية أو قالب PCR مناسبة لإنشاء الجيش الملكي النيبالي مع الموقع ملزم للفائدة التي قدمتها في نهاية 3 ' ~ 20-النوكليوتيدات تسلسل تعسفي.
    2. استخدام منتج تجاري (جدول المواد) لتوليف كيميائيا محول اليغنوكليوتيد مكمل للملحق 3 'في الجيش الملكي النيبالي المولدة بواسطة T7 ويحتوي على ثنائي الفينيل متعدد الكلور في 5' نهاية (الشكل 3A).
      ملاحظة: يمكن وضع هما 18-ذرة الفواصل والنيوكليوتيدات غير مكملة 2-3 في 5 ' نهاية اليغنوكليوتيد للحد من إعاقة الفراغية المحتملة بين مجمع منضم والخرز ستريبتافيدين. من المستحسن أيضا أن اليغنوكليوتيد يتم تعديل شكل موحد مع 2 ' س-ميثيل مجموعة لتعزيز قوة مزدوج وتوفير المقاومة ضد nucleases مختلف.
    3. يصلب الجيش الملكي النيبالي المولدة بواسطة T7 إلى اليغنوكليوتيد محول ثنائي الفينيل متعدد الكلور.
      1. بمول ميكس 20 من الجيش الملكي النيبالي و pmol 100 من اليغنوكليوتيد ثنائي الفينيل متعدد الكلور محول (1:5 نسبة المولى) 1.5 مل أنبوب ميليلتر 100 تحتوي على ربط المخزن المؤقت على النحو التالي: 75 ملم بوكل، 15 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.9، والغليسيرول 15%، حمض الإيثيلين 10 ملم (يدتا).
        ملاحظة: من المهم استخدام الحد أدنى من اليغنوكليوتيد محول غير كافية لتشكيل ازدواج مع معظم (أن لم يكن كلها) الركيزة مرناً قبل استخدامها في رد فعل انلينغ. هذا يمكن أن مريح تحددها وسم الركازة الجيش الملكي النيبالي في نهاية 5 ' مع 32ف، الصلب الركيزة المسمى مع زيادة كميات من اليغنوكليوتيد محول باستخدام مختلف المخزن المؤقت الشروط ورصد الاحتفاظ إشارة المشعة على الخرز streptavidin بعد يغسل العديد من الخرز مع المخزن المؤقت ملزم.
      2. ضع الأنبوبة في الماء المغلي لمدة 5 دقائق.
      3. السماح للمياه ليبرد لدرجة حرارة الغرفة.

2-مجمع الجمعية

  1. الملحق 1 مل خلاصة نووية ماوس (أو استخراج آخر الاختيار) مع 80 مم يدتا درجة الحموضة 8 إلى تركيز نهائي 10 مم لحظر غير محدد نوكليسيس تعتمد على المعادن التي تكون موجودة في النص المقتبس.
    ملاحظة: هذا سيؤدي إلى ضبط المخزن المؤقت في الاستخراج لتكوين نفسه كالتي في المخزن المؤقت للربط (راجع الخطوة 1.2.3.1). لا تؤثر على المعالجة في المختبر من قبل هيستون-مرناس يدتا بل قد تكون ضارة في تنقية البروتينات أو البروتين المجمعات التي تجمع بطريقة تعتمد على المغنيسيوم. وفي هذه الحالات، ينبغي تجنب يدتا.
  2. إضافة 5-10 بمول من الجيش الملكي النيبالي الركيزة المعلمة مع مجموعة ثنائي الفينيل متعدد الكلور في رابطة الدول المستقلة (انظر الخطوة 1-1) أو عبر (راجع الخطوة 1.2.3.3) إلى 1 مل استخراج تحتوي على 10 مم يدتا.
    ملاحظة: كمية الحمض النووي الريبي يحتاج إلى تقييم بعناية في سلسلة من التجارب للمحاكمة. استخدام الكثير من الركازة الحمض النووي الريبي لتنقية معقدة تحد ربما يأتي بنتائج عكسية، زاد الخلفية للجيش الملكي النيبالي غير محدد ملزم البروتينات دون أي تأثير على إنتاج بروتينات معينة.
  3. احتضان الركيزة الجيش الملكي النيبالي باستخراج لمدة 5 دقائق في الجليد، وأحيانا خلط العينة.
    ملاحظة: كل من الوقت ودرجة الحرارة الحضانة بحاجة إلى إنشاء تجريبيا وقد تتباين تباينا كبيرا، تبعاً للطبيعة المحددة لمجمع الجيش الملكي النيبالي/البروتين.
  4. تدور الخليط حضانة في ميكروسينتريفوجي قبل يبرد لمدة 10 دقيقة في 10,000 ز x إزالة أي رواسب المحتملين، وجمع بعناية طافية تجنب نقل بيليه.

3-التثبيت من الحمض النووي الريبي/البروتين المجمعات على "الخرز ستريبتافيدين".

  1. نقل ~ 100 ميليلتر streptavidin [اغروس] تعليق حبة من مورد تجاري (جدول المواد) إلى أنبوب 1.5 مل وزيادة حجم المخزن المؤقت ملزم (75 ملم بوكل، 15 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.9، والغليسيرول 15 في المائة، 10 مم يدتا).
    ملاحظة: يجب أن يكون هذا المخزن المؤقت نفس تكوين في الخليط انلينغ واستخراج المستخدمة للجمعية المعقدة (الخطوة 2، 1).
  2. جمع الخرز في الجزء السفلي من الأنبوب بالغزل لمدة 2-3 دقيقة في 25 x ز ونضح المادة طافية.
  3. كرر نفس الإجراء الغسيل/الغزل 2-3 مرات حجته الخرز مع المخزن المؤقت ملزم.
    ملاحظة: في نهاية هذه الخطوة، بيليه الخرز ينبغي أن يكون حجم ~ 30 ميليلتر.
  4. تحميل المادة طافية تحتوي على مجمع المجمعة (2.4 خطوة) على الخرز [اغروس] streptavidin متوازن.
  5. قم بتدوير ح 1 في 4 درجات مئوية شل الجيش الملكي النيبالي ومجمعات منضم في الخرز.
  6. جمع الخرز في الجزء السفلي من الأنبوب بالغزل لمدة 2-3 دقيقة في 25 x ز.
    ملاحظة: استخدم سوينغ بالدوار لتجنب خسارة كبيرة من الخرز إذا أنها تميل إلى التمسك بجانب الأنبوب في دوار الزاوي.
  7. نضح المادة طافية وشطف الخرز مرتين مع 1 مل من المخزن المؤقت ملزم، باستخدام نفس شروط الطرد المركزي.
  8. أضف 1 مل من المخزن المؤقت ملزم وتدوير العينة ح 1 في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: هذه الخطوة يمكن اختصارها إذا المجمع شكلت الركيزة يميل إلى الانسحاب.
  9. تدور أسفل الخرز لمدة 2-3 دقيقة في 25 x ز وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت ونقل التعليق إلى أنبوب جديد.
  10. تدوير ح 1 إضافية أو أقصر، إذا كان المجمع غير مستقر وتدور إلى أسفل لمدة 2-3 دقيقة في ز 25 x ونقل الخرز إلى أنبوب 500 ميليلتر في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم.

4-الأشعة فوق البنفسجية-شطف.

  1. قم بتشغيل كثافة عالية مصباح الأشعة فوق البنفسجية التي تنبعث منها 365 نيوتن متر فوق البنفسجية لمدة 5-10 دقائق قبل أن تصل إلى تألق كامل.
    ملاحظة: وهذا ضروري لتحقيق الطاقة القصوى لانبعاث الأشعة فوق البنفسجية في البداية التشعيع.
  2. ملء الجزء السفلي من صحن بتري (100 ملم × 15 ملم) مع الجليد محكم معبأة وكومة من خلال غطاء للطبق.
  3. باختصار دوامة الأنبوب الذي يحتوي على المجمع المعطل تداولها، وضعه أفقياً على الجليد والغطاء مع مصباح المعالجون مسبقاً، ضمان أن العينة يقع ضمن مسافة 2-3 سم سطح المصباح.
    ملاحظة: إذا كانت المسافة كبيرة جداً، استخدام أطباق بيتري إضافية أو كائنات أخرى مناسبة لإحضار العينة أقرب إلى اللمبة.
  4. تشعيع لمدة 30 دقيقة، وكثيراً ما عكس وفورتيكسينج على أنبوب لضمان التعرض موحدة من التعليق للأشعة فوق البنفسجية ومنع الانهاك.
    ملاحظة: لتوفير مزيد من البرودة، خطوة شطف الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن تتم في غرفة باردة. قم بالتبديل إلى طبق بتري مع الجليد الطازجة في حالة ذوبان الجليد المفرط.
  5. وتدور أسفل الخرز لمدة 2-3 دقيقة في 25 x ز جمع المادة طافية.
  6. إعادة تدور المادة طافية باستخدام نفس الشروط وجمع المادة طافية.
    ملاحظة: ترك كمية صغيرة من المادة طافية في الجزء السفلي لتجنب نقل حبات المتبقية.

5-نموذج تحليل الفضة تلطيخ تليها الكتلي.

  1. استخدام مخزونات النشر الاستراتيجي/polyacrylamide هلام التفريد لفصل جزء من المادة طافية الوتيد الأشعة فوق البنفسجية والكسر نفس المواد التي تركت في الخرز بعد شطف الأشعة فوق البنفسجية.
    ملاحظة: قد تتضمن أيضا التحليل قاسمة الخرز سحبت من العينة قبل شطف الأشعة فوق البنفسجية.
  2. وصمة عار جل يحتوي على فصل البروتينات باستخدام فضة متاحة تجارياً تلطيخ طقم.
  3. تقييم كفاءة الأشعة فوق البنفسجية-شطف بمقارنة الكثافة البروتينات موجودة في المادة طافية التيد الأشعة فوق البنفسجية، وتلك التي تركت على الخرز بعد إشعاع الأشعة فوق البنفسجية.
  4. المكوس عصابات البروتين الفائدة وتحديد هوياتهم باستخدام البروتوكولات القياسية10،15الطيف الكتلي.

6-العالمية من تحليل عينة التيد الأشعة فوق البنفسجية من الطيف الكتلي.

  1. مباشرة تحليل جزء صغير من المادة طافية التيد الأشعة فوق البنفسجية من الطيف الكتلي لتحديد البروتين الكامل للمواد النقية بطريقة غير متحيزة.
    ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك قبل العلاج بحل من العينات النقية مع التربسين تليها البروتوكولات القياسية الطيف الكتلي تحديد الهوية لتوليد الببتيدات10،15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اختبار طريقة الأشعة فوق البنفسجية-شطف مع اثنين من ركائز الجيش الملكي النيبالي مركباً كيميائيا يعلق تساهمي في النهاية 5 ' لمجموعة ثنائي الفينيل متعدد الكلور (تكوينرابطة الدول المستقلة ): ثنائي الفينيل متعدد الكلور-SL (الشكل 1) وثنائي الفينيل متعدد الكلور-dH3/5 م الكشف (الشكل 2). 31-النوكليوتيدات ثنائي الفينيل متعدد الكلور-SL الرنا تحتوي على بنية جذعية-حلقة متبوعاً بذيل 5-النوكليوتيدات الذين تقطعت بهم السبل وحيدة ولها ت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأسلوب الموصوفة هنا واضحة وإلى جانب إدراج رابط صورة كليفابل والأشعة فوق البنفسجية-شطف والخطوة لا تختلف عن الأساليب شيوعاً التي تستفيد من تفاعل قوي جداً بين البيوتين وستريبتافيدين. الخطوة الأشعة فوق البنفسجية-شطف فعال جداً، عادة الإفراج عن أكثر من 75% من الجيش الملكي النيبالي المعطل تداولها والمرتبطة البروتينات من الخرز streptavidin، تاركة وراءها خلفية عالية من البروتينات التي تربط الخرز غير على وجه التحديد. بالقضاء على هذه الخلفية، غلة الخطوة الأشعة فوق البنفسجية-شطف عينات نقية ملحوظ مناسبة للتحليل المباشر تلطيخ الفضة و...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر زملائنا والمتعاونين على مساهمتهم لعملنا. أيد هذه الدراسة المعاهد الوطنية للصحة منح جنرال موتورز 29832.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ستربتافيدين أغاروزسيجماS1638-5ML
مصباح الأشعة فوق البنفسجية عالي الكثافة وطويل الموجةكول بارمرUX-97600-00
لمبة بديلةكول بارمرUX-97600-19100 واط لمبة الزئبق H44GS-100M تنبعث منها 366 نانومتر من ضوء الأشعة فوق البنفسجية (سيلفانيا)
الحمض النووي الريبي وقليل النوكليوتيدات التي تحتوي على البيوتين والرابط القابل للانقسام الضوئي في cis< / em>دارماكون (لافاييت ، كولورادو) أو شركة Integrated DNA Technologies، Inc. (كورالفيل ، آي إيه)استكشاف اقتباس في Dharmacon
Beckman GH 3.8 دوار دلو متأرجحBeckman
RiboMAX أنظمة إنتاج الحمض النووي الريبي على نطاق واسع (بوليميراز T7)واسع PromegaP1300
RiboMAX (SP6 بوليميراز)مجموعة PromegaP1280
Pierce Silver Stain Kitثيرموفيشر العلمي24612
أنظمة إنتاج الحمض النووي الريبي على نطاق

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
  3. Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
  4. Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
  5. Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
  6. Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
  7. Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
  8. Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
  9. Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
  10. Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
  11. Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
  12. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  13. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
  14. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
  15. Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
  16. Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
  17. Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
  18. Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
  19. Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
  20. Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
  21. Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
  22. Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
  23. Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
  24. Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
  25. Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Protein Complex PurificationBiotin Streptavidin InteractionPhoto cleavable LinkerUV Elution MethodStreptavidin Agarose BeadsMass Spectrometry AnalysisSilver StainingHistone Pre mRNA ProcessingU7 snRNP ComplexSingle step Purification

Related Articles