Method Article

تنقية خطوة واحدة من المجمعات الجزيئات باستخدام الحمض النووي الريبي يعلق على البيوتين ورابط صور كليفابل

DOI:

10.3791/58697

⸱

January 3rd, 2019

 ,  , 
1Integrative Program for Biological and Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجيش الملكي النيبالي/البروتين المجمعات تنقيته باستخدام استراتيجية ستريبتافيدين botin هي التيد للحل في ظل الظروف يشوه بشكل غير مناسب لمزيد من التنقية والتحليل الوظيفي. وهنا يصف لنا تعديل هذه الاستراتيجية التي تستخدم رابط صورة كليفابل في الجيش الملكي النيبالي، وخطوة شطف الأشعة فوق البنفسجية لطيف، تسفر عن مجمعات الجيش الملكي النيبالي/البروتين الأصلي وتعمل بكامل طاقتها.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لسنوات عديدة، استخدمت بنجاح قوية على نحو استثنائي وشكلت سرعة تفاعل البيوتين وستريبتافيدين لتنقية جزئية هامة بيولوجيا الحمض النووي الريبي/البروتين المجمعات. إلا أن هذه الاستراتيجية تعاني من عيب رئيسي واحد يحد من استخدامها الأوسع: تفاعل البيوتين/ستريبتافيدين يمكن كسرها إلا بمعرفة الظروف التي تعطل أيضا سلامة مجمعات الوتيد، ومن ثم تحول دون بهم تحليل وظيفي اللاحقة و/أو تنقية كذلك بطرق أخرى. وباﻹضافة إلى ذلك، العينات التيد غالباً ملوثة بالبروتينات الأساسية التي تربط نونسبيسيفيكالي بالخرز streptavidin، تعقيد تحليل المجمعات المنقي تلطيخ الفضة والطيف الكتلي. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير البديل من البيوتين/ستريبتافيدين الاستراتيجية التي يتم إرفاق البيوتين الركيزة الحمض النووي الريبي عن طريق رابط صورة كليفابل ومجمعات معطلة على الخرز streptavidin هي التيد بشكل انتقائي للحل في النموذج الأصلي بموجة طويلة الأشعة فوق البنفسجية، تاركاً البروتينات الخلفية في الخرز. يمكن توليفها أقصر من ركائز ربط الحمض النووي الريبي كيميائيا مع البيوتين ورابط الصورة كليفابل تساهمي يعلق على نهاية 5 ' من الجيش الملكي النيبالي، بينما أطول الحمض النووي الريبي ركائز يمكن أن تقدمها مع الفريقين اليغنوكليوتيد تكميلية. تم اختبار هذه نوعين مختلفين من الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية لتنقية U7 سنرنب-تعتمد على تجهيز المجمعات أن تنشق هيستون قبل-مرناس في نهاية 3 ' وكلاهما أثبت إيجابية مقارنة بأخرى قبل وضع أساليب تنقية. عينات التيد الأشعة فوق البنفسجية الواردة مبالغ سنرنب U7 التي كانت خالية من الملوثات الرئيسية البروتين ومناسبة للتحليل المباشر من الطيف الكتلي والاختبارات الوظيفية سهولة الاكتشاف. يمكن تكييفها لتنقية مجمعات ربط الحمض النووي الريبي الأخرى الأسلوب الذي وصف بسهولة واستخدامها بالاقتران مع مواقع مفرد، ومزدوج تقطعت الحمض النووي ملزم لتنقية البروتينات الخاصة بالحمض النووي ومجمعات الجزيئات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حقيقيات النوى، يخضع السلائف مرناً ولدت الثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي (قبل-مرناس) عدة أحداث نضج في النواة قبل أن تصبح قوالب مرناً تعمل بكامل طاقتها تخليق البروتين في السيتوبلازم. واحد من هذه الأحداث نهاية تجهيز 3 '. للغالبية العظمى من قبل-مرناس، تتضمن 3 ' المعالجة نهاية الانقسام بالإضافة إلى بوليادينيليشن. هذا رد فعل خطوتين هو تحفزها وفيرة نسبيا معقدة تتألف من أكثر من 15 البروتينات1. معالجة ما قبل الحيوانية المعتمدة على النسخ المتماثل هيستون-مرناس في نهاية 3 ' بواسطة إليه مختلفة التي الدور الرئيسي الذي تؤديه سنرنب U7، وفرة منخفضة معقدة تتألف من سنرنا U7 ~ 60 النيوكليوتيدات والبروتينات متعددة2،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد الركيزة

ملاحظة: ركائز رنا أقصر من النيوكليوتيدات ~ 65 يمكن توليفها كيميائيا مع البيوتين (ب) ورابط الصورة كليفابل (pc) (المشار إليها معا البيوتين صور كليفابل أو ثنائي الفينيل متعدد الكلور) تساهمي يعلق على الحمض النووي الريبي 5 ' نهاية (تكوينرابطة الدول المستقلة ). بحاجة لأن يتم إنشاؤه في المختبر بالنسخ T7 (أو SP6) ركائز الجيش الملكي النيبالي الذي يحتوي على مواقع الربط أطول بشكل ملحوظ وتعتيق في وقت لاحق إلى اليغنوكليوتيد قصيرة محول تكميلية المحتوية على ثنائي الفينيل متعدد الكلور moiety في نهاية 5 ' (عبر التكوين) (الشكل 1).

  1. لمواقع الربط التي تتكون من أقل من 65 ~ النيوكل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اختبار طريقة الأشعة فوق البنفسجية-شطف مع اثنين من ركائز الجيش الملكي النيبالي مركباً كيميائيا يعلق تساهمي في النهاية 5 ' لمجموعة ثنائي الفينيل متعدد الكلور (تكوينرابطة الدول المستقلة ): ثنائي الفينيل متعدد الكلور-SL (الشكل 1) وثنائي الفينيل متعدد الكلور-dH3/5 م الكشف (الشكل 2). 31-النوكليوتيدات ثنائي الفينيل متعدد الكلور-SL الرنا تحتوي على بنية جذعية-حلقة متبوعاً بذيل 5-النوكليوتيدات الذين تقطعت بهم السبل وحيدة ولها ت.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأسلوب الموصوفة هنا واضحة وإلى جانب إدراج رابط صورة كليفابل والأشعة فوق البنفسجية-شطف والخطوة لا تختلف عن الأساليب شيوعاً التي تستفيد من تفاعل قوي جداً بين البيوتين وستريبتافيدين. الخطوة الأشعة فوق البنفسجية-شطف فعال جداً، عادة الإفراج عن أكثر من 75% من الجيش الملكي النيبالي المعطل تداولها والمرتبطة البروتينات من الخرز streptavidin، تاركة وراءها خلفية عالية من البروتينات التي تربط الخرز غير على وجه التحديد. بالقضاء على هذه الخلفية، غلة الخطوة الأشعة فوق البنفسجية-شطف عينات نقية ملحوظ مناسبة للتحليل المباشر تلطيخ الفضة و.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر زملائنا والمتعاونين على مساهمتهم لعملنا. أيد هذه الدراسة المعاهد الوطنية للصحة منح جنرال موتورز 29832.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ستربتافيدين أغاروزسيجماS1638-5ML
مصباح الأشعة فوق البنفسجية عالي الكثافة وطويل الموجةكول بارمرUX-97600-00
لمبة بديلةكول بارمرUX-97600-19100 واط لمبة الزئبق H44GS-100M تنبعث منها 366 نانومتر من ضوء الأشعة فوق البنفسجية (سيلفانيا)
الحمض النووي الريبي وقليل النوكليوتيدات التي تحتوي على البيوتين والرابط القابل للانقسام الضوئي في cis< / em>دارماكون (لافاييت ، كولورادو) أو شركة Integrated DNA Technologies، Inc. (كورالفيل ، آي إيه)استكشاف اقتباس في Dharmacon
Beckman GH 3.8 دوار دلو متأرجحBeckman
RiboMAX أنظمة إنتاج الحمض النووي الريبي على نطاق واسع (بوليميراز T7)واسع PromegaP1300
RiboMAX (SP6 بوليميراز)مجموعة PromegaP1280
Pierce Silver Stain Kitثيرموفيشر العلمي24612
أنظمة إنتاج الحمض النووي الريبي على نطاق

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Protein Complex PurificationBiotin Streptavidin InteractionPhoto cleavable LinkerUV Elution MethodStreptavidin Agarose BeadsMass Spectrometry AnalysisSilver StainingHistone Pre mRNA ProcessingU7 snRNP ComplexSingle step Purification

Related Articles