Method Article

الاستخدام التكميلي للتقنيات المجهرية والقراءة الفلورية في دراسة تفاعلات Cryptococcus-Amoeba

DOI:

10.3791/58698

⸱

June 22nd, 2019

 , 
1Department of Microbial, Biochemical and Food Biotechnology, University of the Free State

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الورقة تفاصيل بروتوكول لإعداد ثقافة مشتركة من خلايا cryptococcal والأميبا التي يتم دراستها باستخدام الصور الفلورية لا يزال، والصور عالية الدقة نقل المجهر الإلكتروني. ويتضح هنا كيف يمكن للبيانات الكمية أن تكمل هذه المعلومات النوعية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لمحاكاة عدوى Cryptococcus، يمكن استخدام الأميبا، وهو المفترس الطبيعي لخلايا cryptococcal في البيئة، كنموذج للماكروفيج. هذا الكائن الحي المفترس، على غرار الضامة، يستخدم phagocytosis لقتل الخلايا الداخلية. مع مساعدة من مجهر الليزر المسح الضوئي، يتم التقاط الصور التي تصور لحظات تفاعلية بين خلايا cryptococcal والأميبا. قوة القرار من المجهر الإلكتروني يساعد أيضا على الكشف عن التفاصيل الهيكلية جدا من خلايا cryptococcal عندما المحاصرين داخل الفراغ الغذاء الأميبا. وبما أن الفياغوسية عملية مستمرة، ثم يتم دمج البيانات الكمية في التحليل لشرح ما يحدث في الوقت المناسب عندما يتم التقاط صورة. وعلى وجه التحديد، تُقرأ وحدات الفلورة النسبية من أجل تحديد كفاءة الأميبا في استيعاب خلايا الكريبتوك. لهذا الغرض، وملطخة خلايا cryptococcal مع صبغة التي تجعلها الفلورة مرة واحدة محاصرين داخل البيئة الحمضية من vacuole الغذاء. عند استخدامها معا، يمكن أن توفر المعلومات التي يتم جمعها من خلال هذه التقنيات معلومات حاسمة للمساعدة في استخلاص استنتاجات حول سلوك ومصير الخلايا عند استيعابها من قبل الأميبا، وربما، من قبل الخلايا الفيوسية الأخرى.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تطورت الميكروبات مع مرور الوقت لتحتل وتزدهر في منافذ إيكولوجية مختلفة مثل الحدود المادية المفتوحة للتربة والمياه، من بين أمور أخرى1. وفي هذه المنافذ، كثيرا ما تشارك الميكروبات في المنافسة المباشرة على الموارد المحدودة؛ الأهم من ذلك، للمغذيات التي يستخدمونها لدعم نموها أو الفضاء،والتي يحتاجونها لاستيعاب السكان الآخذة في التوسع 2،3. في بعض الحالات، قد بعض الكائنات الثلاثية الأبعاد مثل الأميبا حتى predate على خلايا cryptococcal كوسيلة لاستخراج المواد الغذائية من الكتلة الحيوية الخاصة بهم4،5. وهذا بدوره يسمح لهذه الكائنات بترسيخ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعتبر النيوفورمانات Cryptococcus وبعض سلالات Acanthamoeba castellanii كمسببات الأمراض من المستوى 2 للسلامة الأحيائية (BSL-2)؛ وبالتالي، يجب على الباحثين اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند العمل مع هذه الكائنات الحية. على سبيل المثال، يجب أن يكون لدى موظفي المختبرات تدريب محدد ومعدات حماية شخصية (PPE) مثل معاطف المختبر والقفازات وحماية العين. وينبغي استخدام مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (المستوى 2) للإجراءات التي يمكن أن تسبب العدوى14.

1. زراعة وتوحيد الخلايا الفطرية (المعدلة من Madu وآخرون 15 )

  1. خط من سلالات الفطرية اختبار (أي C. neoformans UOFS Y-1378 و C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميكروبات هي كائنات مجهرية لا يمكن تصورها بالعين المجردة. ومع ذلك، قد يؤدي تأثيرها إلى أمراض واضحة سريرياً يمكن ملاحظتها، مثل الالتهابات الجلدية. عند دراسة جوانب معينة من الميكروبات، تتراوح بين مورفولوجيا، والمنتجات الثانوية، والتفاعلات، والقدرة على تقديم الأدلة التصويرية والفيديو هو من الأهمية القصوى.

لقد سعينا أولاً إلى تصور التفاعل بين خلايا الكريبتوكوال والأميبا. ولهذا الغرض، تمت دراسة الصور ذات المجال الساطع التي أظهرت 2 ح.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الورقة، تم استخدام تقنيات مختلفة بنجاح للكشف عن النتيجة المحتملة التي قد تنشأ عندما تتفاعل الأميبا مع خلايا cryptococcal. أيضا، كنا مهتمين لإظهار آثار الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي على نتيجة تفاعلات Cryptococcus-الأميبا.

وكانت التقنية الأولى المستخدمة هي الفحص المجهري البؤري، الذي قدم صورا ثابتة. وكان العيب الرئيسي لهذه التقنية هنا أنه قدم لنا فقط المعلومات التي تقتصر على نقطة زمنية معينة. وأي استنتاج يمكن استخلاصه استنادا إلى النتائج يفسح المجال للمنطق الاستقرائي، حيث يمكن للمرء أن .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وحظي العمل بدعم من منحة مقدمة من المؤسسة الوطنية للبحوث في جنوب أفريقيا (رقم المنحة: UID 87903) وجامعة الدولة الحرة. كما أننا ممتنون للخدمات والمساعدة التي يقدمها بيتر فان ويك وهانلي غروبلر خلال دراساتنا المجهرية.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1،4-Diazabicyclo- [2.2.2] -أوكتانسيجما-ألدريتشD27802-1.5-مل
أنبوب بلاستيكي   ؛الطردScientific 69715-15-mL
 Thermo Fisher Scientific7252018-50-mL
 ثيرمو فيشر العلمي
1132017-8-بئر غرفة الشريحةالحرارية فيشر العلمية
1109650-الأسيتونميركSAAR1022040LC-الأميبا
سلالةATCCÒ < / sup>30234 < sup>TM < / sup>-
ATCC متوسط 712ATCC < sup> & Ograve ؛ < / sup>712TM< / sup>الأميبا متوسطة
اللون الأسود 96 بئر لوحة ميكروتيترثيرمو فيشر العلمية152089
الطرد المركزيHermle-
الكلوروفورمسيجما ألدريتشC2432مجهر
متحد البؤرنيكون نيكونTE 2000-راتنجات
الايبوكسي:
[1] NSA[1] ALS[1] R1054-
[2] DER 736[2] ALS[2] R1073-
[3] ERL Y221راتنج [3] ALS[3] R1047R-
[4] S1 (2-dimethylaminoethanol)[4] ALS  [4] R1067-فلوريسين
إيزوثيوسياناتسيجما ألدريتشF4274-حمض
الفورميكسيجما-ألدريتش489441-فلوروسكان
أسينت فلوريداثيرمو فيشر العلمي374-91038Cقارئ صفيحة
دقيقة جلوكوزسيجما ألدريتشG8270-جلوتارالديهايد
ALSR1009-
مقياس الدمBoeco-
سترات الرصاصALSR1209-
الكتلة الكروماتوغرافياالحراري فيشر العلمي-
الميثانولسيجما - ألدريتشR 34،860-
شاكر مداريلاسيك & nbsp ؛-
رابع أكسيد الأوزميومALSR1015-pHrodo
Green Zymosan A BioParticlesLife TechnologiesP35365هذا هو الحل العازلة الفسيولوجي للصبغة الحساسة للأس الهيدروجيني
Sigma-AldrichP4417-50TAB-
شاكر دوارLabcon-
عازلة فوسفات الصوديوم:
[1] ثنائي الصوديوم هيدروجين أورثوفوسفات ثنائي الهيدرات [1] ميرك[1] 106580-
[2] ثنائي هيدروجين الصوديوم ثنائي فوسفات ثنائي هيدروجين[2] ميرك [2] 106345
مجهر إلكتروني ناقلالحركة PhilipsPhilips EM 100 & nbsp ؛-
تريبان أزرق سيجما ألدريتشT8154-Ultramicrotome
LeicaEM UC7-Uranyl
acetateALSR1260A-Vacuum
dessicatorLasec --
قارورةسيجما ألدريتش29651-U-YNB
Lasec & nbsp ؛239210-YPD
أجارسيجما-ألدريتشY-1500-
أنبوب المركزي Thermo Fisher أنبوب الطرد المركزي مقياس طيف السائلة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
  2. Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
  3. Comolli, L. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryptococcus Amoeba InteractionsConfocal MicroscopyTransmission Electron MicroscopyPhagocytosis AssayFluorescence ReadingpHrodo StainingFungal Cell CultureAmoeba ViabilityCo culture PreparationUltrastructural Analysis

Related Articles