مقالة منهجية

تحقيق تبعيات الجينية باستخدام فحوصات كريسبر-Cas9-تعتمد المنافسة

DOI:

10.3791/58710

⸱

يناير 7, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tumor Initiation and Maintenance Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 3Department of Bioengineering, University of California, San Diego

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه المخطوطة وصف أسلوب كريسبر-Cas9-تعتمد متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر (كريسبر) للتحقيق بسيطة وسريعة لدور متعددة الجينات المرشحة في سرطان الدم النقوي الحاد (AML) انتشار الخلايا في موازية. هذه التقنية قابلة للتطوير ويمكن تطبيقها في خطوط خلايا السرطان الأخرى كذلك.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت الدراسات اضطراب الجينات على نطاق واسع التحقيق في دور الجينات الفردية في أمراض مكافحة غسل الأموال. لتحقيق اضطراب الجينات كاملة، قد جعلت العديد من هذه الدراسات استخدام نماذج خروج المغلوب الجينات المعقدة. في حين تقدم هذه الدراسات مع خروج المغلوب الفئران نظاما للتحقيق في علاقات التركيب الوراثي للنمط الظاهري أنيقة واجتازت اختبار الزمن، طريقة سريعة وقابلة للتطوير لتقييم المرشح الجينات التي تلعب دوراً في انتشار خلية مكافحة غسل الأموال أو البقاء على قيد الحياة في نماذج مكافحة غسل الأموال سيساعد على التعجيل باستجواب موازية متعددة الجينات المرشحة. وعززت التقدم الذي أحرز مؤخرا في تكنولوجيا الجينوم تحرير كبير قدرتنا على أداء الاضطرابات الوراثية على نطاق لم يسبق له مثيل. واحد مثل هذا النظام لتحرير الجينوم هو الأسلوب كريسبر-Cas9-تعتمد التي يمكن استخدامها لإجراء تغييرات سريعة وفعالة في جينوم الخلية المستهدفة. بسهولة وقابلية لحذف الجينات كريسبر/Cas9-بوساطة يجعلها واحدة من التقنيات الأكثر جاذبية لاستجواب عدد كبير من الجينات في فحوصات المظهرية. هنا، فإننا نعرض مقايسة بسيطة باستخدام كريسبر/Cas9 بوساطة الجينات-تعطل جنبا إلى جنب مع المنافسة القائمة على التدفق الخلوي الفائق فحوصات للتحقيق في دور الجينات التي قد تلعب دوراً هاما في انتشار أو البقاء على قيد الحياة للإنسان و موريني خطوط خلية مكافحة غسل الأموال.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وشهدت العقود القليلة الماضية جهود بحثية عديدة ركزت على تحديد مساهمة رئيسية المسارات الجزيئية في أمراض سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). تقليديا، تم أداء تعطيل الجينات في خلايا مكافحة غسل الأموال باستخدام الفئران خروج المغلوب الشرطي أو دبوس الشعر القصير الحمض النووي الريبي (شرنا). بينما الفئران خروج المغلوب توفر نظام متطور لمراقبة الزمانية للجينات-الحذف، توليد جينات الفئران خروج المغلوب ذات العمالة الكثيفة، وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة. وعلاوة على ذلك، جين-الضربة القاضية باستخدام استراتيجيات جزئ ليست قابلة للتطوير بسهولة؛ هذه الاستراتيجيات لا تصلح أيضا لاستجواب جينات عدة بالتوازي. وبعد اكتشاف أساليب تدخل الجيش الملكي النيبالي إلى مرناس الذاتية تدق لأسفل باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA) أو شرنا، بدأت العديد من المجموعات باستخدام تقنيات الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في دور جينات محددة في مجال مكافحة غسل الأموال. منذ خلايا مكافحة غسل الأموال مورين والبشرية على السواء، يصعب ترانسفيكت باستخدام الأساليب التقليدية تعداء على أساس المادة الدهنية، معظم الدراسات شرنا العاملين لينتيفيرالي أو ترميز ريتروفيرالي لدراسة وظيفة الجينات في خلايا مكافحة غسل الأموال. الاكتشاف الأخير لتجمع يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) وثورة nucleases Cas المرتبطة بها (كريسبر-Cas9) استهداف الجين التكنولوجيات1،،من23. استخدام كريسبر-Cas9، جينات معينة أو مناطق الجينوم يمكن حذف، وتحرير أو الموسومة بكفاءة وسهولة. كريسبر-Cas9-تعتمد تحرير الجينات يظهر الآن كأسلوب الاختيار للتحقيق في علاقات التركيب الوراثي للنمط الظاهري في أنواع الخلايا المختلفة بسبب البساطة والفعالية، وانطباق واسع النطاق لهذا الأسلوب. كما أصبحت أساليب كريسبر-Cas9-تعتمد الأسلوب المفضل في مكافحة غسل الأموال، ليس فقط لاستجواب الجينات الفردية، ولكن أيضا كوسيلة لاستهداف جينات متعددة في الشاشات الوراثية المنتشرة أو المجمعة بهدف التحقيق في جينات عدة بالتوازي إمكانات مكافحة غسل الأموال-تبعيات4،،من56.

في هذه المخطوطة، يصف لنا مقايسة نمو تنافسي بسيطة لقياس أثر اضطراب الجينات في نمو خلايا مكافحة غسل الأموال، استناداً إلى مستقر كريسبر-Cas9-بوساطة الجينات تحرير تليها الفائق التدفق الخلوي. هذا الأسلوب بسيطة وفعالة، وقابلة للتطوير للتجارب الإنتاجية المتوسطة للتحقيق في دور الجينات عدة بالتوازي في خلايا مكافحة غسل الأموال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-خلية مكافحة غسل الأموال توليد خط الحيوانات المستنسخة مع التعبير عالية من Cas9 مستقر ونشط

  1. إنتاج لينتيفيروس Cas9
    1. اليوم 0: لوحة 4 × 106 293T الخلايا في 10 مل دميم مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين ولام الجلوتامين في طبق استنبات الأنسجة 10 سم في السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) معتمد هود ثقافة الخلية. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية.
    2. يوم 1: ينبغي أن تكون الخلايا 293T مطلي روافد 70 – 80% في يوم 1. أداء تعداء استخدام بروتوكول التالية في فترة ما بعد الظهر.
    3. حرارة متوسطة تعداء ووسائط الثقافة وكاشف تعداء لدرجة حرارة الغرفة. ذوبان الجليد كل والبلازميدات المطلوبة تعداء.
    4. 9 ميكس ميكروغرام psPAX2، 0.9 ميكروغرام من pMD2.G و 9 ميكروغرام من البلازميدات بلينتي-Cas9 مع 500 ميليلتر من تعداء المتوسطة في أنبوب 5 مل.
    5. إضافة مل 1.7 من تعداء المتوسطة إلى مل 14 جولة الأنبوبة السفلي. إضافة 57 ميليلتر من تعداء الكاشف مباشرة في المتوسط تعداء في أنبوب لتجنب لمس جدار الأنبوبة.
    6. بلطف إضافة مزيج بلازميد كامل للحل كاشف تعداء وتخلط بلطف التنصت على الأنبوب على الجانب. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 – 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه، تغير المتوسط من لوحة 293T المصنف.
    7. إضافة مزيج تعداء dropwise اللوحة والصخور بلطف لوحة جانبية لخلط تتسم بالكفاءة. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية.
    8. يوم 2: نضح المادة طافية من لوحة تعداء بلطف أن الخلايا لا بالانزعاج أو فكها من اللوحة. تجاهل المادة طافية. إضافة 10 مل من 10% جديدة دميم المتوسطة بالانزلاق إلى أسفل بلطف من الجانبين من لوحة لتجنب إزاحة الخلايا.
    9. يوم 3: جمع الفيروس الذي يحتوي على المادة طافية من لوحة تعداء ببطء برسمه في محقن معقم 10 سم. بعد أن يتم جمع المادة طافية في المحاقن، إرفاق فلتر 0.45 ميكرومتر عقيمة للمحاقن وعقد بحقنه وتصفية عبر أنبوب مخروطي البوليبروبيلين العقيمة، طازجة 15 مل. بلطف يغرق المحاقن لتصفية الفيروس التي تحتوي على المادة طافية من خلال عامل التصفية 0.45 ميكرومتر في أنبوب مخروطي البوليبروبيلين 15 مل.
    10. تخزين متوسطة مكيفة الفيروسية في مختبرين من 2 مل في 2 مل كريوفيالس في-80 درجة مئوية.
  2. توصيل خطوط خلية مكافحة غسل الأموال
    1. اليوم-1: تمييع 1 ملغ/مل فيبرونيكتين البشري الماشوب يفتت الأسهم إلى 10 ميكروغرام/مل مع المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS). معطف زراعة الأنسجة تعامل 6 لوحة جيدا مع 2 مل من 10 ميكروغرام/مل فيبرونيكتين البشري الماشوب بلغة العامل الحل في غطاء ثقافة خلية BSL2 وافق. التفاف اللوحة في التفاف تتشبث لتجنب الخسارة في التبخر وتخزين في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
    2. اليوم 0: ذوبان المادة طافية الفيروسية التي تحتوي على Cas9. نضح الحل بلغة فيبرونيكتين البشري الماشوب تماما من اللوحة مغلفة تماما قبل سبينفيكشن. إضافة 2 مل من الفيروسية متوسطة مكيفة مع Cas9 إلى اللوحة وأنها تدور في س 1,300 ز لمدة 90 دقيقة عند 35 درجة مئوية. وهذا يساعد على الجسيمات الفيروسية نعلق على سبينفيكتيد جيدا.
    3. وفي الوقت نفسه، عد الخلايا تكون ترانسدوسيد وتدور أسفل 2 × 106 خلايا في أنبوب مخروطي البوليبروبيلين 15 مل. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة جديدة.
    4. وبعد سبينفيكشن، إزالة جميع المادة طافية الفيروسية من سبينفيكتيد جيدا وتجاهل. يتم إرفاق جزيئات الفيروسات التراجعية من المادة طافية إلى الجزء السفلي من سبينفيكتيد جيدا. حسنا، هذا إضافة الخلايا6 2 x 10 حراكه في 2 مل متوسطة من الخطوة أعلاه.
    5. تدور اللوحة مرة أخرى في 1,300 س ز بإيجاز شديد (1-2 دقيقة) كافية للسماح للخلايا لتستقر في الجزء السفلي. ضع اللوحة العودة إلى الحاضنة وترك بين عشية وضحاها لتوصيل مع الجسيمات الفيروسية سبينفيكتيد المرفقة للبئر.
    6. يوم 1: اعتماداً على كثافة الخلية، إضافة أكثر المتوسطة للخلايا ترانسدوسيد لتجنب فرط.
    7. يوم 2: إضافة منذ بلازميد بلينتي-Cas9 علامة مقاومة بلاستيسيدين، بلاستيسيدين بجرعة 10 ميكروغرام/مل إلى ترانسدوسيد وأونترانسدوسيد (مراقبة) MOLM13 أو خلايا اللوكيميا الماوس MLL AF9 لاختيار Cas9 الإعراب عن الخلايا.
      ملاحظة: ويعتبر التحديد بلاستيسيدين من خلايا سرطان الدم ترانسدوسيد Cas9 MOLM13 أو MLL AF9 كاملة عندما أزيلت كافة الخلايا الموجودة في عنصر التحكم أونترانسدوسيد. لخطوط الخلايا عدا سرطان الدم MOLM13 و MLL AF9، منحنى استجابة جرعة يجب أن يتم قبل هذه التجربة حيث أنه يمكن أن تستخدم جرعة مثلى. يمكن أيضا إجراء المعايرة من المادة طافية الفيروسية في حالة معدلات منخفضة-توصيل.
  3. استنساخ تحديد الخلايا وإذ تعرب عن Cas9 عالية.
    ملاحظة: لقد لاحظنا أن بعض خطوط خلية مكافحة غسل الأموال، قد لا يكون التحديد استنساخ اللازمة: معظم السكان Cas9-بلاستيسيدين مختارة مسبقاً قد عالية الكفاءة تحرير الجينوم. وفي هذه الحالة، من الممكن تخطي 1.3 الخطوة والانتقال إلى الخطوة 1.4 تقييم التعبير Cas9 في خلايا مكافحة غسل الأموال المجمعة Cas9-بلاستيسيدين بواسطة النشاف الغربية. سيكون هاما لتقييم كفاءة تحرير الجينات في تلك الخلايا المجمعة Cas9-مكافحة غسل الأموال (الخطوة 1.5) قبل الانتقال إلى فحوصات المنافسة. أننا نخلص أن يقلل اختيار استنساخ واحدة عالية-Cas9 تقلب تحرير الجينوم، وأهمية خاصة عند اختبار عدد من دليل واحد مختلفة الكشف (سجرناس).
    1. أداء خلية واحدة نوع من Cas9-بلاستيسيدين تحديد خلايا سرطان الدم MOLM13 و MLL AF9 من الآن فصاعدا تسمى MOLM13-Cas9 وخلايا MLL-AF9-Cas9، على التوالي، باستخدام أرز نظام مراقبة الأصول الميدانية الواردة في غطاء BSL2 وافق. يمكن إجراء الفرز في 5-10 جولة أسفل غير زراعة الأنسجة المعالجة 96 جيدا لوحات.
    2. مرة واحدة MOLM13-Cas9 واستنساخ MLL-AF9-Cas9 تم انتقاؤها واسمه على حدة، توسيع استنساخ 10 – 20 مع 10 ميكروغرام/مل من بلاستيسيدين في ثقافة وسائل الإعلام لضمان الحفاظ على التعبير Cas9.
  4. التعبير تحقق استقرارا Cas9 البروتين إيمونوبلوتينج.
    1. جعل النووية مقتطفات من جميع المستنسخين بلاستيسيدين مختارة من اللوكيميا MOLM13 و MLL AF9 باستخدام "مجموعة استخراج النووية" وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. تحقق من Cas9 البروتين التعبير استخدام المضادة العلم جسم M2 منذ Cas9 في بلازميد بلينتي-Cas9 مرتبط حانمه الطرفي ن علم.
    2. تحميل 50 ميكروغرام من البروتين الكلي من كل استخراج النووية على % 10 مكررا-تريس جل وتشغيل الهلام في 120 الخامس حتى يتم فصل النطاقات العليا كذلك.
    3. كتلة الغشاء مع الحل الحليب 5% في تبسة المخزن المؤقت لح 1.
    4. احتضان الغشاء مع تخفيف 1:1,000 من جسم M2 المضادة العلم بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    5. وفي اليوم التالي يغسل الغشاء مع المخزن المؤقت تبسة واحتضان مع برنامج الصحة الإنجابية جسم الماوس المضادة مترافق الثانوية في إضعاف 1:5,000 (تركيز النهائي 0.16 ميكروغرام/مل) في درجة حرارة الغرفة ح 1.
    6. يغسل الغشاء جيدا مع تبسة ووضع وصمة عار استخدام الركيزة القامة.
    7. اختيار استنساخ 3-4 مع تعبير البروتين أعلى من Cas9 كما يراها النشاف الغربية لمزيد من التحليل الوظيفي (الشكل 1).
  5. ضمان ارتفاع النشاط Cas9 في استنساخ المحدد
    1. إعداد المادة طافية لينتيفيرال من متجه ترميز سجرنا مع سجرناس التي تستهدف الإنسان أو الماوس موضع الملاذ الأمن AAVS1 كما هو موضح في "الخطوة 1، 1".
    2. ترانسدوسي أعلى MOLM13 الإعراب عن Cas9 أو استنساخ اللوكيميا MLL AF9 مع مكافحة--AAVS1 سجرنا لينتيفيرال المادة طافية باستخدام الأسلوب سبينفيكشن الموصوفة أعلاه. حدد مع 2.5 ميكروغرام/مل بوروميسين لمدة 4 أيام.
    3. تنقية الحمض النووي من المستنسخين اللوكيميا MOLM13-Cas9 أو MLL-AF9-Cas9 بعد التحديد بوروميسين جنبا إلى جنب مع كل منهما البرية من نوع عناصر التحكم باستخدام أدوات استخراج "الحمض النووي" وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. استخدام 50 نانوغرام من الحمض النووي كقالب لأداء بكر مع AAVS1_test_primers استخدام 2 x ميكس الرئيسي بوليميراز Polymerase والبرنامج بكر المدرجة في الجدول 1.
    4. تشغيل المنتج بكر على 2% [اغروس] هلام وجل تنقية الفرقة 268 زوج قاعدي باستخدام مجموعة أدوات استخراج جل وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. سانغر التسلسل الهلام تنقية المنتج PCR باستخدام الدليل التمهيدي AAVS1_target-frag_F.
    5. تقييم كفاءة التحرير بالمقارنة AAVS1 تحريرها وتسلسل wildtype استخدام الأدوات المستندة إلى ويب على الإنترنت (الشكل 2).

2-الاستنساخ وتوصيل سجرناس في "خلايا" مكافحة غسل الأموال-Cas9

  1. الإنتاجية المتوسطة استنساخ سجرناس
    1. تصميم سجرناس 4 – 6 للجينات للاهتمام باستخدام برامج تصميم كريسبر المستندة إلى ويب. هناك عدد من أدوات التصميم كريسبر المتاحة على الإنترنت مثل http://crispr.mit.edu/وتوليد متواليات سجرنا استناداً إلى تسلسل الحمض النووي إدخال.
      1. تعبئة معلومات مناسبة في حقول مع علامات نجمية. انقر فوق على الجينوم المستهدفة لتصميم سجرنا. لصق تسلسل الهدف في مربع تسلسل وانقر على زر إرسال .
    2. للاستنساخ في (بسي)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 W سجرنا التعبير بلازميد، prepend النيوكليوتيدات "كاكك" إلى اليغو الشعور و "آآك" إلى اليغو العقاقير تستكمل عكس قبل أن يأمر. أوليجوس الإحساس والشعور بمناهضة النظام ممزوجة مسبقاً في صفيحة 96-جيدا المسمى اليغو-مزيج من شركة توليف اليغنوكليوتيد.
      ملاحظة: وقد أحرزنا استخدام (بسي)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 بلازميد ث، الذي لديه موقع تقييد بسي لاستنساخ سجرنا. في حالة استخدام أخرى والبلازميدات التعبير سجرنا، يتدلى المستخدمة النوكليوتيد سجرنا الحاجة إلى تغييرها تبعاً لذلك.
    3. أن لوحة 96-جيدا أسفل يو منفصلة تسمى لوحة الصلب. جعل مزيج رئيسي من 1 ميليلتر بنك T4، 1 ميليلتر من 10 × المخزن المؤقت لربط الحمض النووي T4 و 6 ميليلتر من الماء كل الصلب رد فعل.
    4. إضافة 8 ميليلتر من مزيج الرئيسي لكل من لوحة انلينغ جيدا. أضف 1 ميليلتر من كل 100 ميكرومتر، والشعور واليغو العقاقير (أو 2 ميليلتر من المختلطة الشعور-مكافحة--معنى أوليجوس) إلى مزيج الرئيسي. "الماصة؛" 2 – 3 مرات بلطف مزيج جيد، تدور لوحة بإيجاز للحصول على خلطات إلى الجزء السفلي من الآبار.
    5. استخدام برنامج انلينغ التالية على جهاز PCR: 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 2 دقيقة 30 ثانية عند 95 درجة مئوية متبوعاً بالتبريد البطيء إلى 22 درجة مئوية بمعدل 0.1 ° C/s. بعد الصلب، تأخذ لوحة 96-بئر جديدة المسمى أوليجوميكس المخفف. في هذه اللوحة، تخفف من أوليجوس فوسفوريلاتيد والملدنه من رد فعل أعلاه مع الماء (1: 200) استخدام ماصة متعددة القنوات.
    6. ملخص 5 ميكروغرام من pKLV2-U6gRNA5 (بسي)-PGKpuro2ABFP-ث مع ناقل ميليلتر 1.5 بسي إنزيم التقييد (10,000 وحدة/مل) استخدام مخزن مؤقت لمناسبة في 37 درجة مئوية ح 2 لينيريزي فإنه لربط في وقت لاحق.
    7. تأخذ طبق جيدا طازجة 96 المسمى ربط لوحة وإضافة 20 نانوغرام من بسي يهضم (بسي)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 ث متجهة إلى بئر واحدة لربط سجرنا المرجوة. يضاف إلى ذلك، 2 ميليلتر من أوليجوس فوسفوريلاتيد، الملدنة من لوحة أوليجوميكس المخفف .
    8. إضافة 1 ميليلتر من المخزن ليجاسى x T4 10 و 1 ميليلتر من الإنزيم ليجاسى الحمض النووي T4. بلطف "الماصة؛" مع ماصة متعددة القنوات واحتضان هذا المزيج ربط في درجة حرارة الغرفة ح 2.
      ملاحظة: ويمكن تخزين يمزج ربط في-20 درجة مئوية لخطوة التحول في وقت لاحق.
    9. وفي الوقت نفسه، الخلايا ميليلتر ذوبان 90 من كيميائيا المختصة كولاي على الجليد 10 دقيقة قبل نهاية الخطوة عملية ربط.
    10. استخدام ماصة متعددة القنوات، جعل 10 ميليلتر مختبرين للخلايا المختصة في كل من لوحة منفصلة 96 جيدا جيدا.
    11. إضافة ربط الخليط من الخطوة 2.1.8 إلى جيدا يتضمن الخلايا المختصة، ماصة صعودا وهبوطاً بلطف واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    12. ماصة 5 ميليلتر مزيج الحمض النووي البكتيريا مباشرة من رد فعل أعلاه إلى 6 أيضا لوحة تتضمن أجار رطل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. كرر لكل من ردود فعل التحول.
    13. لوحة كل رد فعل التحول إلى تلصق عليها بطاقات بشكل منفصل أيضا من لوحة 6-جيدا. إضافة حوالي 5 – 8 الزجاج الخرز إلى كل خير ويهز لوحة كاملة 6-جيدا 8 – 10 مرات في حركة دائرية.
    14. اختيار المستعمرات واحدة 1 – 2 من كل بئر مع تلميح ماصة معقمة 20 ميليلتر ومتتالية في بقعة توسم بعناية على معقم 10 سم طبق بيتري مع أجار رطل و 100 مغ/مل الأمبيسلّين. بعد streaking في لوحة رطل، ببساطة إخراج تلميح المستخدمة لاستنساخ streaking في 3 مل من رطل-الأمبيسلّين المتوسطة تحتوي على مل 14 جولة الأنبوبة أسفل علامة مع عدد استنساخ البكتيرية المقابلة.
    15. إرسال لوحة البكتيرية مباشرة سانغر التسلسل مع التمهيدي مروج U6 البشرية إلى الأمام.
    16. وبعد تأكيد تسلسل سجرناس المستنسخة، تنقية الحمض النووي من أنبوب 14 مل المقابلة باستخدام مجموعة أدوات الإعداد المصغر وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    17. قياس تركيز ونوعية كل من ميني-محضرات مع جهاز المطياف الضوئي. تطبيع كل الإعدادية المصغر لتركيز 15 نانوغرام/ميليلتر وماصة في صفيحة جيدا 96 المسمى سجرنا "لوحة الحيوانات المستنسخة".
      ملاحظة: هذه اللوحة يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية أو تستخدم مباشرة في إعداد الفيروس.
  2. إنتاج الفيروسية سجرنا بنيات وتوصيل
    1. لإنتاج جزيئات سجرنا لينتيفيرال في شكل 96-جيدا، اتبع "شرنا/سجرنا/ORF إنتاجية عالية الإنتاج الفيروسية (96 جيدا)" بروتوكول من "منصة اضطراب الوراثية" (GPP web Portal) معهد واسع (URL: https:// portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols).
    2. نقل 200 ميليلتر من المادة طافية الفيروسية لأنابيب معقمة وتجمد فورا في-80 درجة مئوية.
    3. اليوم-1: معطف لوحة مسطحة قاع الأنسجة عدم جيدا 96 ثقافة تعامل مع 100 ميليلتر فيبرونيكتين البشري الماشوب جزء بتركيز 10 ميكروغرام/مل في غطاء ثقافة خلية BSL2. التفاف لوحة استخدام التفاف تتشبث لتجنب فقدان التبخر وتركه على مقاعد البدلاء بين عشية وضحاها.
    4. اليوم 0: إزالة الجزء فيبرونيكتين البشري المؤتلف من كل بئر. ذوبان المادة طافية الفيروسية لكل سجرنا في درجة حرارة الغرفة. إضافة 50 ميليلتر من المادة طافية الفيروسية من كل أنبوبة لكل المغلفة جيدا من لوحة توصيل. تدور لوحة توصيل في س 1,300 ز لمدة 90 دقيقة عند 35 درجة مئوية.
    5. نهاية سبينفيكشن، عد الخلايا MOLM13-Cas9 (استنساخ B3) من قارورة الثقافة. استخدام خلايا 10,000 كل بئر في 100 ميليلتر الحجم. عد الخلايا لجميع الآبار توصيل، مراعاة حجم القتلى.
    6. وبعد سبينفيكشن 90 دقيقة، إزالة المادة طافية من جميع الآبار باستخدام ماصة الأقنية تعديلها إلى 50 ميليلتر ببطء عن إمالة اللوحة. إضافة 100 ميليلتر لثقافة MOLM13-Cas9 استنساخ B3 الخلايا لكل انزلاق جيدا ببطء إلى أسفل من الحافة.
    7. تدور اللوحة في 1,300 س ز 2 دقيقة على 35 درجة مئوية للسماح للخلايا تسوية إلى الأسفل. نقل اللوحة للحاضنة الصف زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية.
    8. يوم 1: إضافة 100 ميليلتر الطازجة المتوسطة وكل سجرنا أيضا تحتوي على ترانسدوسيد Cas9-MOLM13 أو خلايا اللوكيميا Cas9-MLL-AF9 أن متوسطة الحجم النهائي هو 200 ميليلتر.

3-تنافسية النمو بالانزيم

  1. يوم 3:72 ح (اليوم 3) وظيفة توصيل، والتحقق من النسبة المئوية سجرنا التي تحتوي على خلايا حزب الحرية الإيجابية في كل بئر بالتدفق الخلوي (نظام مراقبة الأصول الميدانية). استخدام صبغة بقاء خلية للاحتفال واستبعاد الخلايا الميتة من التحليل.
  2. مواصلة إعادة طلاء نسبة من الخلايا في آبار جديدة مع متوسطة جديدة بعد كل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتجنب فرط أثناء الفحص.
  3. كرر كل 2 – 3 أيام تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية للتحقق من نسبة الخلايا إيجابية (حزب الحرية + ve) حزب الحرية بالمقارنة مع حزب الحرية السلبية (حزب الحرية-ve) النظراء (الشكل 3). تحليل النسبة المئوية لخلايا حزب الحرية الإيجابية لكل نقطة الوقت (باستخدام فلوجو أو برامج مماثلة في تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية).
    1. اسحب الملفات Fcs لكل عينة للبرمجيات فلووجو. انقر نقراً مزدوجاً فوق أي ملف عينة واحدة والمؤامرة دوت وصمة عار للأمام مبعثر (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) مع منتدى التعاون الأمني في X المحور، والتعاون بين بلدان الجنوب على المحور ص. بوابة كافة الخلايا.
    2. انقر نقراً مزدوجاً فوق الخلايا مسور وارسم لهم على استمرارية وصمة عار (على المحور ص) مقابل منتدى التعاون الأمني الطول (H) أو منطقة (A) دوت وصمة عار. بوابة صلاحية وصمة سلبية الخلايا (لايف).
    3. انقر نقراً مزدوجاً فوق الخلايا الحية مسور ومؤامرة حزب الحرية (على المحور ص) مقابل "منتدى التعاون الأمني" (أ) على محور س. بوابة حزب الحرية + ve الخلايا. تنطبق جميع هذه البوابات لجميع العينات بواسطة سحب العينة المختارة جميع العينات تحت علامة التبويب مجموعة .
    4. انقر فوق محرر الجدول جعل جدول بتحليل جميع العينات. سحب حزب الحرية + ve العد من عينة واحدة للجدول، وانقر فوق الزر عرض في محرر الجدول لإنشاء تقرير دفعة لجميع العينات مع جدول عرض النسبة المئوية لخلايا حزب الحرية + ve . حفظ الجدول كما xls.
  4. حساب الزيادة النسبية أو نقصان في حزب الحرية % الخلايا إيجابية داخل السكان خلية حية على مر الزمن ومقارنة هذه النسبة بنسبة لخلايا حزب الحرية الإيجابية في سجرناس عنصر تحكم (مثل لوسيفراس، سارعت أو سجرنا التجارة والنقل).
  5. ارسم نسبة خلايا حزب الحرية الإيجابية سجرناس مختلفة بما في ذلك gene(s) للفائدة، فضلا عن عناصر التحكم باستخدام يوم 3 كخط الأساس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفي دراستنا، نحن أولاً ترانسدوسيد MOLM13 البشرية AML الخلية السطر الذي يحمل إزفاء MLL AF9 مع الفيروس عالية-عيار ترميز بلازميد لينتيفيرال Cas9-بلاستيسيدين. في أيدينا، جل المفرز MOLM13-Cas9 الخلايا لم يتم عرض التعبير Cas9 مستوى عال من النشاف الغربية وأيضا لم يكن أداؤها جيدا عند جزيئي للجينات كفاءة التحرير-استخدام الأسلوب الموصوفة سابقا7. ولذلك، شرعنا في إنشاء استنساخ خلية واحدة فقط وحدد فقط استنساخ مع مستويات عالية من Cas9 كما يراها الغربية النشاف (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المخطوطة، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة للقيام فحص كريسبر-Cas9-تعتمد نمو تنافسي التحقيق في دور الجينات المرشحة في خطوط خلية مكافحة غسل الأموال باستخدام التدفق الخلوي في الخلايا البشرية/الفاري مكافحة غسل الأموال (الشكل 5). الهدف المتمثل التحليل تحديد تأثير حذف الجينات في الصيانة من انتشار خلية مكافحة غسل الأموال أكثر من أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع على نطاق متوسط الإنتاجية. تحتاج بعض الخطوات الحاسمة التي يتعين اتباعها بعناية لتسهيل توسيع نطاق البروتوكول وصف. في إنتاج Cas9 lentivirus، من الضرور...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.J.D خبير استشاري للمستحضرات الصيدلانية A2A (نيو جيرسي) والمداواة سالجوميد (سان دييغو). مؤلفين آخرين قد أية تعارضات تعلن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بلازميد pCW-Cas9 وكان هدية من إريك لاندر & ديفيد ساباتيني (بلازميد أدجيني # 50661) و (بسي)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 ث بلازميد من مختبر يوسا (بلازميد أدجيني #67974. نود أن أشكر الأساسية "التدفق الخلوي" في معهد الاستراتيجية والخطة الاستشرافية الاكتشاف الطبي للمساعدة في الوقت المناسب مع تحليل تدفق والفرز. ونود أن نعترف بالدعم من "مؤسسة النصب التذكاري تاتا سيدة" إلى ميلادي ونود أن نعترف أيضا بدعم مصادر التمويل التالية: المعاهد الوطنية للصحة/NCI P30 CA030199 السرطان مركز رعاية منحة، والخامس-المؤسسة ومراكز السرطان NCI سان دييغو (C3) #PTC2017to A.J.D.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
FLAG-M2 الأجسام المضادةسيجما-ألدريتشF3165 ، الكمية # SLBS3530V
الأجسام المضادة للفأرInvitrogen31446 ، الكمية # TA2514341
SuperSignal West Femto أقصى حساسية الركيزةThermo Fisher34095
نظام التصوير ChemiDocBIO RAD17001401
Sorvall Legend RT جهاز طردمركزي Thermo Scientific
بلاستيسيدينثيرمو فيشرR21001
SYTOX ريدثيرمو فيشرS34859
Opti-MEMثيرموفيشر 31985062
DMEMثيرمو فيشر11965-092
RPMIثيرمو فيشر11875-093
البنسلين الستربتومايسينثيرمو فيشر15140122
L-Glutamine (200 ملم)Thermo Fisher25030081
مصل بقري الجنين (FBS) SAFC12303C
ناقل gRNA أحاديAddgene # 67974pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) -PGKpuro2ABFP-W
طقم الاستخراج النووي CelLyticسيجما ألوريتشNXTRACT
XtremeGENE 9سيجما ألوريتش6365787001
RetronectinTakaraT100B
مقياس التدفقBD Biosciences
T4 PNKNEBioLabsM0201S
T4 مخزن ربط الحمض النوويNEBioLabsB0202S
T4 إنزيم DNA LigaseNEBioLabsM0202S
أمبيسلينفيشر العلميBP1760-25
LB أجارفيشر العلميBP9724-500
رطل مرقفيشر العلميBP9731-500
Qiagen طقم الإعدادية المصغرةQiagen27104
NanoDrop مقياس الطيف الضوئيالحراري فيشرنانو دروب واحد
المؤتلف الفئران IL-3Peprotech213-13
المؤتلف الفئران IL-6Peprotech216-16
الفأر المؤتلف M-CSFPeprotech315-02
الخلايا المختصة المستقرةNEBiolabsC3040I
10 سم أطباق زراعة الأنسجةفيشر353003
العلمي لتحلل الخلاياQiagen158906
محلول ترسيب البروتينQiagen158910
محلول ترطيب الحمض النوويQiagen158914
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
BbSINew England BioLabsR0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix KitGenessee Scientific42-138
PuromycinFisher ScientificBP2956100
50 مل أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبيلينفيشر علمي1495949A
15 مل أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبلينفيشر العلمية1495970C
الخلوي الحل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  3. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  4. Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
  5. Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
  6. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
  7. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  8. Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).
  9. Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
  10. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
  11. Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
  12. Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
  13. Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
  14. Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
  15. Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
  16. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  17. Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR Cas9Flow CytometryCompetition AssayGene KnockoutAML Cell LinesSingle Guide RNALentiviral TransductionBFP Positive CellsFlow Cytometry AnalysisGenetic Dependencies

مقالات ذات صلة