مقالة منهجية

إيمونوبلوتينج كمية من خطوط الخلايا كمعيار للتحقق من صحة الفلورة للتحديد الكمي للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات الأنسجة الروتينية

DOI:

10.3791/58735

⸱

يناير 7, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's Cancer Research Institute, 3Queen's Laboratory for Molecular Pathology, Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف لنا استخدام الكمية إيمونوبلوتينج للتحقق من صحة الأنسجة الفلورة مقترنة بتحليل الصورة كوسيلة لتحديد كمية وتين فائدة في عينات الأنسجة (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين. نتائجنا تثبت فائدة علم الأنسجة الفلورة للتحقق من الكمية النسبية للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات خزعة الروتينية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحديد الكمي للبروتينات ذات الاهتمام في عينات الأنسجة (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين مهم في السريرية وبحوث التطبيقات. طريقة مثلى للقياس الكمي دقيق، ولديها مجموعة واسعة نطاق ديناميكي خطي ويحافظ على وحدة الهيكلية العينة للسماح للتعرف على أنواع الخلايا الفردية. الأساليب الحالية مثل إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) والطيف الكتلي immunoblotting كل تعجز عن الوفاء بهذه الشروط بسبب طبيعتها القاطع أو بحاجة إلى مجانسة العينة. كأسلوب بديل، نقترح استخدام الفلورة (إذا كان) وتحليل الصور لتحديد الوفرة النسبية لبروتين فائدة في الأنسجة FFPE. هنا نظهر أن هذا الأسلوب هو الأمثل بسهولة، وتؤدي دينامية واسعة نطاق، وهو خطيا قابلة للقياس بالمقارنة مع معيار الذهب immunoblotting الكمية. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يسمح بالحفاظ على السلامة الهيكلية للعينة، ويسمح للتمييز من مختلف أنواع الخلايا، التي قد تكون حاسمة في التطبيقات التشخيصية. وعموما، هذا هو وسيلة قوية للتحديد الكمي النسبي للبروتينات في عينات فب ويمكن تكييفها بسهولة لتناسب السريرية أو احتياجات البحوث.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحاجة إلى تحديد كمية البروتينات في عينات خزعة الأنسجة (FFPE) الفورمالين--الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين موجود في العديد من المجالات الطبية. على سبيل المثال، يستخدم التقدير الكمي للعلامات البيولوجية البروتينات في عينات خزعة الروتينية توضيح التوقعات وأبلغ العلاج ل مرضى السرطان1. ومع ذلك، الأساليب الحالية هي عادة ذاتية وتفتقر إلى التحقق من صحة.

تستخدم بشكل روتيني في مختبرات علم الأمراض إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) ويتوقف عموما على جسم الأولية الموجهة في البروتين المستهدف وجسم ثانوي مترافق مع تسمية الانزيمية مثل الفجل البيروكسيديز2. المدينة التقليدية حساسة، يمكن أن تجعل استخدام دقيقة عينات ويحافظ على سلامة المورفولوجية لعينات الأنسجة مما يسمح بتقييم التعبير البروتين ضمن سياقها نسيجية ذات الصلة. ومع ذلك، نظراً للإشارات اللونية التي تم إنشاؤها بواسطة المدينة الاختزالي، يعاني من مجموعة ديناميكية ضيقة نسبيا وإمكانات محدودة للإرسال المتعدد2،،من34. الليزر ساعد مصفوفة التصوير (استخدام-MSI) الطيف الكتلي الامتزاز/التأين يحافظ على سلامة المورفولوجية. بيد أن هذه التكنولوجيا النامية يرتبط بالقرار المورفولوجية متواضعة وتتطلب المعايرة كبيرة والتطبيع وجدواه في الاستخدام السريري الروتيني5،،من67إضعاف. وتشمل تقنيات بديلة تحديد كمية البروتين في عينات الأنسجة immunoblotting8والطيف الكتلي9،،من1011والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا)12، كل من الذي يبدأ المتجانس عينة الأنسجة. عينات الأنسجة الأساسية غير متجانسة في أنها تحتوي على العديد من أنواع الخلايا. ولذلك، لا تسمح التقنيات التي تنطوي على المجانسة العينات التحديد الكمي للبروتين في عدد سكان خلية معينة من الاهتمام مثل الخلايا السرطانية.

مثل المدينة، إذا كان قابلاً للتطبيق على الصغيرة فب عينات ويسمح بالاحتفاظ بسلامة غذائها13. ومع ذلك، بفضل طبيعة المواد المضافة إشارات الأسفار، إذا قابلة لتطبيق متعددة الأجسام الأولية وتسميات الفلورسنت. وهكذا، قد كمياً وتين فائدة نسبيا داخل خلايا معينة أو مقصورات الهاتف الخلوي (على سبيل المثال، نواة مقابل السيتوبلازم) المحددة باستخدام الأجسام المضادة الأخرى. إشارات الأسفار أيضا تتميز أكبر مجموعة ديناميكية13،14. التفوق، وإمكانية تكرار نتائج، والإمكانيات المتنوعة إذا طبقت على عينات فب قد أظهرت13،،من1415.

هذه الوثيقة يصف لنا استخدام الكمية إيمونوبلوتينج باستخدام خطوط الخلايا المحددة كمعيار الذهب للتأكد من طبيعة الكمية إذا اقترنت بتحليل الصور الحاسوب في تحديد الوفرة النسبية لبروتين فائدة في مقاطع نسيجية من عينات الأنسجة FFPE. وقد قمنا بتطبيق هذا الأسلوب بنجاح في اتباع نهج متعدد لقياس العلامات البيولوجية البروتينات في خزعة السريرية عينات16،،من1718.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على موافقة على استخدام عينات الأنسجة البشرية الأساسية من "العلوم الصحية" والتابعة للمستشفيات التعليمية بحوث أخلاقيات المجلس (هسريب) في جامعة كوينز.

1-بناء خط خلية أنسجة ميكرواري (تي أم أية)

  1. خلايا الحصاد، والمياه والصرف الصحي.
    ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول على مختلف خطوط الخلايا مخلدة المنشأة (مثل الحلة، جوركات، RCH-أوستريا).
    1. للخلايا ملتصقة، الحصاد حوالي 1.3 × 107 الخلايا بمجرد أن تصل إلى ما يقرب من 80% كونفلوينسي. فصل الخلايا باستخدام كاشف مناسبة لأن خط الخلية.
      ملاحظة: حمض الإيثيلين (يدتا) المفضل عموما أكثر التربسين للحد من خطر تدهور البروتينات السطحية. في حالة استخدام التربسين، تحييد التربسين استخدام مصل الدم البقري الجنين (FBS) مباشرة بعد الحصاد في الخلايا.
    2. لتعليق الخلايا، الحصاد حوالي 8 × 107 خلايا في السجل-مرحلة النمو.
    3. جمع الخلايا تحصد/فصل من سينتريفوجينج لمدة 5 دقائق في 225 x ز في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
    4. صب المادة طافية وإعادة تعليق بيليه في 10 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 225 x ز وصب المادة طافية.
      ملاحظة: 1 X برنامج تلفزيوني يتكون من 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 10 مم نا2هبو4، 1.8 مم خ2ص4 في الماء المقطر؛ ضبط pH إلى 7.4.
  2. إصلاح الخلايا في فورمالين وبيليه لهم.
    1. تعليق بيليه خلية داخل الأنبوبة المخروطية في 10 مل من 10% فورمالين مخزنة محايدة (NBF).
      ملاحظة: يمكن تحضير NBF بتمييع 1 مل من 37% فورمالدهيد حل الأسهم في 9 مل من 1 X PBS.
      تحذير: استخدام الحذر عند التعامل مع الفورمالين وفورمالدهايد. استخدام غطاء دخان للخطوات التي تنطوي على الفورمالين وفورمالدهايد.
    2. احتضان الخلايا على الروك في 24 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها (حوالي 17 ساعة).
    3. إعداد حل 1% [اغروس] نقطة انصهار منخفضة في برنامج تلفزيوني (0.01 غرام من [اغروس] كل 1 مل برنامج تلفزيوني).
      1. تعد كافية بالنسبة 500 ميليلتر من حل [اغروس] كل نموذج خط الخلية.
      2. يحل [اغروس] في 80 درجة مئوية مياه حمام أو الحرارة كتلة، مع خلط أحياناً لمدة 2-5 دقائق. بمجرد حل، يبقى الحل في 37 درجة مئوية الماء كتلة حمام أو الحرارة لمنع تصلب.
    4. إزالة المادة طافية بيليه الخلايا الثابتة من خطوة سينتريفوجينج لمدة 5 دقائق في 225 غ. س 1.2.2 وريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x.
    5. نقل الخلايا إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة وبيليه سينتريفوجينج لمدة 5 دقائق في 290 x زاي Aspirate قبالة كل من المادة طافية.
  3. تحويل خلايا في [اغروس].
    1. إضافة ~ 500 ميليلتر من 1% [اغروس] حل (من الخطوة 1.2.3) لكل أنبوبة تحتوي على الخلايا. بلطف ولكن بسرعة، "الماصة؛" خليط صعودا وهبوطاً باستخدام ميكروبيبيتي P-1000 لمزيج.
      ملاحظة: قطع نهاية طرف الماصة تكبير الفتحة وتجنب تشكيل فقاعات. يبقى الحل [اغروس] العامل في حمام الماء 37 درجة مئوية لمنع تصلب.
    2. تتيح الحل [اغروس]-خلية تتصلب (5-10 دقيقة) في درجة حرارة الغرفة. أضف 1 مل 10% NBF لكل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة المحتوية على عينة والحفاظ على درجة حرارة الغرفة حتى البارافين التضمين (تصل إلى 24 ساعة).
  4. إعداد المكونات [اغروس] لتضمين البارافين.
    1. نضح قبالة NBF من العينة.
    2. إزالة المكونات الخلية باستخدام شفرة حلاقة لقطع أنبوب ميكروسينتريفوجي، ضع المكونات في كاسيت النسيج البلاستيكية. تخزين أشرطة الكاسيت في 10% NBF في درجة حرارة الغرفة.
  5. معالجة العينات بين عشية وضحاها أما يدوياً أو باستخدام معالج نسيج الآلي، وتضمين في شمع البارافين استخدام الأساليب القياسية علم الأنسجة.
    ملاحظة: انظر فيشر وآخرون. 19 بروتوكول مثال.
  6. استخدام متخصصة الصك "نسيج أرايير"، والحصاد النوى 0.6 مم مكررة من البارافين كتلة من كل خط الخلية وإدراجها، في الصفوف، في كتلة فارغة بارافين المتلقية من أجل إنشاء خط خلية الجمعية التونسية للأمهات.
    ملاحظة: يجب استخدام الأساليب القياسية مثل تلك الموصوفة في فيدور ودي مارزو20.
  7. دمج النوى من العينات الأولية تمثل 2-3 أنواع الأنسجة إضافية (مثلاً، لوزة، القولون، الخصيتين، إلخ) كعناصر إيجابية أو سلبية في الجمعية التونسية للأمهات. اختر الأنسجة المناسبة لبروتين الفائدة.
  8. استخدم مبضع لإعداد هذين الفرعين النسيجي، تقريبا من 4 إلى 6 ميكرون سميكة، من خط خلية الجمعية التونسية للأمهات. تحميل المقطع على شريحة علم الأنسجة والجاف لأنه ديبارافينيزي (كما هو موضح في فيدور ودي مارزو20).

2-عينة تلطيخ من الفلورة

  1. تحسين تخفيف جسم الأولية.
    ملاحظة: توجد البروتوكولات القياسية للاستفادة المثلى من المدينة أو إذا كان لأقسام الأنسجة FFPE كما هو الحال في كاجيمورا et al. 21-لمحة موجزة عن النهج الذي يرد هنا.
    1. إعداد تخفيف 4-5 من جسم الرئيسي لبروتين الفائدة التي تسترشد بإرشادات الشركة المصنعة.
    2. تحديد نوع عنصر تحكم أنسجة من مصدر الحيوان أو الإنسان الذي يعبر عن البروتين للاهتمام بالسكان خلية شكلياً يمكن التعرف عليه. تعد أجزاء من الأنسجة وجبل لهم على شريحة اتباع الإجراء immunohistochemistry القياسية كما هو الحال في فيدور ودي مارزو20.
      ملاحظة: عدد المقاطع المطلوبة هو عدد الأجسام المضادة الأساسي تخفيف زائد واحد إضافي.
    3. استخدام نظام الآلي أو اليدوي إيمونوهيستولوجي، اختبار تخفيف جسم أساسي من الخطوة 2.1.1 كل على شريحة من الخطوة 2.1.2. حذف تطبيق جسم أساسي من الشريحة الإضافية واستخدامها كعنصر سلبي.
    4. وخلال عملية المصبوغة، وصمة عار كافة الشرائح مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) كونتيرستين نووية وجسم ثانوية المعلمة فلوريسسينتلي. إذا كان مطلوباً بقدر أكبر من الحساسية، استخدام برنامج الصحة الإنجابية (الفجل البيروكسيديز)-مترافق جسم الثانوية ونظام تضخيم الإشارات على أساس تيراميدي (انظر المكدس et al. 13).
      ملاحظة: عند الإرسال المتعدد الأجسام الأولية، يتم استخدام تسمية فلورسنت مختلفة لكل البروتين.
    5. مسح الشرائح إيمونوستينيد باستخدام أداة مناسبة قادرة على توليد ملف صور رقمية باستخدام موجات الإثارة والكشف المناسب إلى فلوروفوريس التي تم استخدامها.
    6. استخدام البرمجيات المناسبة لعرض الصور الرقمية واختر تجريبيا إضعاف جسم الأولية التي يحسن كثافة إشارة بالنسبة إلى الخلفية الفلورية.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، هذا التحسين يمكن أن يحدث باستخدام جسم ثانوي مترافق HRP، 3، 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB) والفحص المجهري برايتفيلد.
  2. أداء إذا تلطيخ على خط الخلية الجمعية التونسية للأمهات.
    1. استخدام نظام تلقائي أو يدوي إيمونوهيستولوجي وصمة عار شريحة خط الخلية الجمعية التونسية للأمهات مع إضعاف جسم الأولية الأمثل (كما هو محدد في الخطوة 2، 1). حذف تطبيق جسم أساسي من الشريحة الثانية واستخدامه كعنصر سلبي.
    2. وخلال عملية المصبوغة، وصمة عار كافة الشرائح مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) كونتيرستين نووية، وجسم الثانوية وتيراميدي كما هو الحال في الخطوة 2.1.4.
    3. مسح الشرائح إيمونوستينيد باستخدام أداة مناسبة قادرة على توليد ملف صور رقمية باستخدام موجات الإثارة والكشف المناسب إلى فلوروفوريس التي تم استخدامها.
    4. استخدام حزمة برامج تحليل صور لتحديد مقصورة الخلوية للفائدة (أي السيتوبلازم مقابل نواة) وقياس كثافة fluorescence يعني (MFI) لكل خط الخلية.
      ملاحظة: يمكن استخدام حزم البرامج المختلفة لهذا الغرض وكثير تناقش في المكدس et al. 13.

3-الكمية إيمونوبلوتينج من خطوط الخلايا

  1. إعداد ليساتيس للخلايا.
    1. حصاد الخلايا 2 مليون لكل خط الخلية، كما هو موضح في الخطوات 1.1.1 إلى 1.1.3.
    2. تدور الخلايا إلى الأسفل لمدة 5 دقائق في 650 x ز في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. صب المادة طافية.
    3. تغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني المثلج. ريسوسبيند في 1 مل من المثلج برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. الطرد المركزي وفقا للخطوة 3.1.2 وصب وترك الخلايا على الجليد.
    4. إضافة حوالي 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل راديويمونوبريسيبيتيشن الباردة (RIPA) مع مثبطات البروتياز (10 ميليلتر من مثبطات X 100 كل مل من المخزن المؤقت لتحلل ريبا) إلى الخلايا، ودوامه، واحتضان في الثلج لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يختلف بحسب خط الخلية مبلغ تحلل المخزن المؤقت المطلوب لتحلل فعالة ويمكن تحديده تجريبيا. المخزن المؤقت للمعهد الملكي يتكون من 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم يدتا، 50 مم تريس، 1.0 NP-40%، 0.5% ديوكسيتشولاتي الصوديوم، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% في الماء المقطر.
    5. لضمان تحميل نسبيا حتى في إيمونوبلوتس، قياس مجموع البروتين في عينة 20 ميليلتر من كل استخدام ليستي طريقة مناسبة مثل المقايسة برادفورد. إضافة ميليلتر حوالي 40 X Laemmli 6 تحلل المخزن المؤقت للفترة المتبقية (حوالي 180 ميليلتر) لكل خلية ليساتي ويغلي عند 100 درجة مئوية في حمام كتلة أو الماء حرارة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: 6 X لايملي المخزن المؤقت يتكون من 300 ملم تريس-HCl (6.8 درجة الحموضة)، 4% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، والغليسيرول 60%، 0.6% (w/v) بروموفينول الأزرق، ديثيوثريتول 50 ملم (DTT) في الماء المقطر.
    6. تخزين العينات في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  2. أداء إيمونوبلوت جميع خطوط الخلايا لتحديد خط الخلية التي يحتوي البروتين الأكثر وفرة من الفائدة.
    ملاحظة: اتبع الإجراء الموضح في محمود، ت. ويانغ، جهاز كمبيوتر. 22، مع إدخال التعديلات التالية.
    1. الخلية قاسمة ليستي (أعد الخطوة 3.1) التي تحتوي على 10-50 ميكروغرام من البروتين (اعتماداً على وفرة البروتين للفائدة) في أنابيب ميكروسينتريفوجي. إضافة ميليلتر 2.5 6 X لايملي المخزن والمخزن المؤقت لتحلل ريبا كافية جعل حجم ما يصل إلى 15 ميليلتر.
    2. تحميل 5% التراص و بتركيز مناسب (مثلاً، 10% للبروتينات بين 15-100 كاتشين) حل جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة مع سلم بروتين والعينات المأخوذة من الخطوة 3.2.1. تحميل المخزن المؤقت X Laemmli 1 إلى الآبار فارغة. تشغيل التيار الكهربائي في الإعدادات المناسبة، عادة 125 الخامس، لمدة 80 دقيقة أو حتى صبغ بروموفينول الأزرق يصل إلى الجزء السفلي من اللوحة.
    3. إجراء عملية نقل بروتين شبه جاف كما هو موضح في فيدمان et al. 23.
      ملاحظة: لنتائج تمثيلية، غشاء النيتروسليلوز (التي لا تحتاج إلى أن تكون غارقة في الميثانول)، واستخدمت بيرم شافر-نيلسن (بي إس) الباردة نقل المخزن المؤقت. المخزن المؤقت بي إس يتكون من 48 مم تريس، 39 مم جليكاين، 20% ميثانول في الماء المقطر.
    4. بعد التحويل، استخدم شفرة حلاقة لقطع الغشاء أفقياً لفصل الجزء الذي يحتوي على بروتين اهتمام بروتين مراقبة داخلية مناسبة، مثل جابده.
    5. المضي قدما إلى عرقلة وجسم إينكوباتيونس استخدام المخزن المؤقت حظر الذي أوصت به الشركة المصنعة للأجسام المضادة الأولية.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف جسم الأولية الأمثل تخفيف هائلة اعتماداً على وفرة البروتين وحساسية. للممثل النتائج أدناه، المطلوبة جسم مضاد للبروتين لمصلحة إضعاف 1:1,000 بينما جابده عنصر التحكم المطلوب إضعاف 1:40,000. وكان التخفيف من الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة 1:3، 000.
    6. بعد إينكوبيشنز جسم والغسيل للغشاء، ضع الشرائط الغشاء في غمد بلاستيك الشفاف مثل كيس ساندويتش.
    7. إعداد الخليط تشيميلومينيسسينسي (القامة) enchanced اتباع إرشادات الشركة المصنعة. استخدام ماصة P-1000 لتغطي الغشاء مع خليط القامة وإغلاق الغمد، واحتضان الشرائط الغشاء مع الخليط في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة.
    8. ضع غمد الغشاء في منصة تصوير رقمي. استخدام تشيميلومينيسسينسي والكشف عن علامة قياس الألوان لالتقاط التعرض المختلفة للغشاء.
      ملاحظة: سوف تختلف أوقات التعرض استناداً إلى الكمية من البروتين تحميل، وفرة بروتين المستهدف، تقارب جسم إلخ تبدأ مع تعرض تلقائي (عادة بضع ثوان)، واختبار التعرض مرات أعلى وأسفل بزيادات لبضع ثوان.
    9. تجريبيا، أو استخدام برنامج تحليل الصور، تحديد خط الخلية التي تعرب عن أهم هدف البروتين.
  3. البحث عن النطاق الديناميكي الخطي لكل جسم الأولية باستخدام إضعاف مسلسل.
    1. نفذ الخطوات 3.2.1-3.2.8 باستخدام سلسلة من تخفيف المسلسل من خط الخلية التي تعبر عن تركيز أعلى من البروتين المستهدف (المحددة في الخطوة 3.2.9).
    2. استخدام برنامج تحليل الصور مثل إيماجيج لإجراء قياس كثافة على الصور التعرض.
      1. على سبيل المثال، باستخدام إيماجيج، استخدام أداة تحديدات مستطيلة لتحديد لين أول من جل للقياس الكمي. تحليل الذهاب إلى | المواد الهلامية | حدد أول لين. استخدم الماوس لتحريك المستطيل الناتج فوق إلى الممر التالي. تحليل الذهاب إلى | المواد الهلامية | حدد التالي لين. مرارا وتكرارا نقل المستطيل إلى الممر التالي وحدد لين لما تبقى الممرات.
      2. تحليل الذهاب إلى | المواد الهلامية | ارسم الممرات. استخدام أداة الخط المستقيم لرسم خطوط عبر أسس كل ذروة لإزالة الضوضاء الخلفية. استخدام أداة العصا لتحديد كل ذروة، وجمع كثافة كل الذروة، من الآن فصاعدا يشار إلى كثافة الفرقة، من إطار النتائج .
    3. استخدام قياس كثافة الناتج لإنشاء سكاتيربلوت للفرقة كثافة مقابل مبلغ إجمالي البروتين تحميلها لكل جسم الأولية. استخدام خط الاحتواء الأفضل والتفتيش البصري، تحديد الموقع (كثافة النطاق) النطاق الديناميكي الخطي لكل جسم.
    4. اختر تركيز بروتين الذي يقوم بإنشاء قيمة في الطرف الأعلى من النطاق الخطية إلى أن تركيز المضي قدما مع جميع خطوط الخلايا.
      ملاحظة: نظراً لهذا التركيز أقل من مستوى التشبع في خط الخلية مع أكبر قدر من هذا البروتين، ينبغي لا خطر على فضح العصابات لخطوط خلية أخرى.
  4. أداء إيمونوبلوت استخدام تركيز البروتين اخترته في الخطوة رقم 3.3.4 لجميع خطوط الخلايا، وكرر الخطوات 3.2.1-3.2.8.
    1. إجراء قياس كثافة على بالأشعة الرقمية كما هو الحال في الخطوة 3.3.2. اختيار الصور التعرض التي تعطي إشارات ضمن النطاقات الخطي لكل جسم المحددة في الخطوة 3.3.3.
    2. استخدام إشارات كثافة الفرقة من التعرض المثالي من 3.4.1، حساب نسبة كثافة الفرقة البروتين المستهدف لتحميل التحكم الفرقة كثافة لكل خط الخلية. تشير هذه القيم نسبة إلى الوفرة النسبية للبروتين المستهدف للفائدة.
    3. إجراء اختبار ارتباط بيرسون (يمكن القيام به باستخدام حزمة برامج إحصائية) للربط بين القيم التي تم الحصول عليها من تحليل الصور إذا المصبوغة (الخطوة 2، 2) لتلك التي تم الحصول عليها من إيمونوبلوتينج (الخطوة 3.4.2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان استخدام هذا البروتوكول لتأكيد قدرة IF لتحديد الكمية النسبية لمكافحة أبوبتوتيك البروتين Bcl-2 في خطوط الخلايا إلى كتل الأنسجة FFPE. ويمكن توضيح آليات النمطان Bcl-2 تحديد بشكل انتقائي في الخلايا السرطانية ويمكن أن تكون مفيدة في تشخيص المرضية وإبلاغ قرارات الإدارة السريرية24. وبشكل أكثر تحديداً، Bcl-2 يلعب دوراً في التنمية بليمفوسيتي السليمة والتعبير عن عادة التحقيق في سياق لمفوما25،،من26

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بوصف أسلوب الذي يجعل من استخدام الكمية immunoblotting (IB) لإثبات جدوى الفلورة (إذا كان) للتحقق من الوفرة النسبية للبروتين المستهدف في عينات الأنسجة FFPE. أساليب القياس الكمي البروتين الحالية محدودة بطبيعتها القاطعة، مثل المدينة اللونية2،3، أو بالحاجة إلى مجانسة عينات، ومنع التحقيق في نموذج الهيكل وخلية السكان، مثل مع IB والكتلي8،9،،من10

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل جزئيا فردريك بانتنغ وتشارلز أفضل كندا الدراسات العليا المنح الدراسية (صباحا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
697DSMZACC 42خط الخلية
JeKo-1ATCCCRL-3006خط الخلية
JurkatATCCTIB-152خط الخلية
RCH-ACVDSMZACC 548خط الخلية
Granta-519DSMZACC 342خط الخلية
REHDSMZACC 22خط الخلية
راجيATCCCCL-86خط الخلية
HeLaATCCCCL-2خط الخلية
محلول التربسين / EDTAInvitrogenR001100 لفصل الخلايا اللاصقة
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Wisent Inc.81150لتحييد التربسين
بروتوكول الفورمالين المحايد المخزن245-684لتثبيت كريات الخلية
UltraPure منخفضة نقطة الانصهار agaroseInvitrogen15517-022لصب كريات الخلايا
الفأر أحادي النسيلة المضاد للإنسان Bcl-2 الجسم المضاد ، استنساخ 124Dako (Agilent)cat #: M088729-2 ، RRID: 2064429للكشف عن Bcl-2 عن طريق الحساسية المناعية واللطخة المناعية (lot #:  00095786
Ventana Discovery XTRoche-لأتمتة تلطيخ التألق المناعي
EnVision + System - البوليمر المسمى HRP (مضاد للماوس)Dako (Agilent)K4000لتضخيم إشارة التألق المناعي
EnVision + System - البوليمر المسمى HRP (مضاد للأرانب)Dako (Agilent)K4002لتضخيم إشارة التألق المناعي
السيانين 5 كاشف التيراميدPerkin ElmerNEL745001KTلتضخيم إشارة التألق المناعي
Aperio ImageScopeLeica Biosystems-لعرضالشرائح الممسوحة ضوئيا
برنامج تحليل الصور HALOIndicaLabs-لتقدير
مثبطات البروتياز المناعي (كوكتيل مثبط البروتياز ، 100X)Thermo Scientific1862209للإضافة إلى RIPA عازلة
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)BioShopEDT001للمخزن المؤقت
RIPA NP-40BDH Limited56009للعازلة RIPA
ديوكسي كولات الصوديومسيجما-ألدريتشD6750ل RIPA عازلة
جلسرينفيشرالتكنولوجيا الحيويةBP229ل Laemlli عازلة
بروموفينول الأزرقBioShopBRO777من أجل Laemlli buffer
Dithiothreitol (DTT)Bio-Rad161-0611ل Laemlli buffer
Albonin مصل الأبقار (BSA)BioShopALB001لغسل اللطخة
المناعية سلم البروتين (معايير Precision Plus Protein Dual Color)Bio-Rad161-0374لتشغيل هلام البروتين
ورق ترشيح (ورق لطخة سميك للغاية)Bio-Rad1703969للنشاف نقل
غشاء النيتروسليلوزBio-Rad162-0115لنقل النشاف
خلية نقل شبه جافة عبر لطخة SDBio-Rad1703940لتحويل شبه جاف
الحليب الخالي من الدسم (حليب جاف خالي الدسم)إشارات الخلية9999Sلحجب العازلة
Tween 20BioShopTWN510لغسل العازلة
أرنب GAPDH الجسم المضاد أحادي النسيلةEpitomics2251-1الجسم المضاد الأساسي لبروتين التحكم (الكثير #: YE101901C)
الماعز المضاد للفأر IgG (HRP المترافق مع HRP) الجسم المضادabcamcat #: ab6789 ، RRID: AB_955439الجسم المضاد الثانوي للبقعة المناعية
للماعز المضاد للأرانب IgG (HRP مترافقة) الجسم المضادabcamcat #: ab6721 ، RRID: AB_955447الجسم المضاد الثانوي للبقعة المناعية (القطعة #: GR3192725-5)
كلاريتي الغربية ركائز ECLBio-Rad1705060للكشف عن إشارة اللطخة المناعية
Amersham Imager 600GE Healthcare LifeSciences 29083461للكشف عن إشارة اللطخة المناعية
برنامج ImageJمجاني ، NIH-لتحليلقياس الكثافة
مسحوق تقنية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
  4. Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
  5. Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
  6. Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging? Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
  7. Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
  8. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  9. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  10. Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
  11. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
  12. Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
  13. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  14. Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
  15. Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
  16. AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
  17. Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
  18. Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
  19. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
  20. Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
  21. Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
  22. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  23. Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
  24. Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
  25. Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
  26. Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
  27. Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
  28. The Human Protein Atlas BCL2. , https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018).
  29. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  30. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).
  31. Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
  32. Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
  33. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13(2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة