يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الميكانيكية ميكرونيزيشن من ليبواسبيراتيس للعلاج بالتجدد

7.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58765

⸱

مارس 15, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Cosmetic Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، وضع بروتوكول للحصول على كسر الأوعية الدموية stromal من الأنسجة الدهنية من خلال سلسلة من العمليات الميكانيكية، والتي تشمل استحلاب وسينتريفوجيشنز متعددة.

الملخص

كسر الأوعية الدموية stromal (SVF) أصبحت أداة التجدد للأمراض المختلفة؛ ومع ذلك، تنظم التشريعات صرامة التطبيق السريري لمنتجات الخلية باستخدام كولاجيناز. نقدم هنا، وضع بروتوكول لإنشاء أن خليط حقن الخلايا صندوق التبرعات الخاص والمصفوفة خارج الخلية الأصلية من الأنسجة الدهنية بعملية ميكانيكية بحتة. ليبواسبيراتيس موضع الطرد مركزي ونسج في س 1,200 ز لمدة 3 دقائق. الطبقة الوسطى التي جمعت وفصلها إلى طبقتين (الدهون عالية الكثافة في الجزء السفلي) والدهون منخفضة الكثافة في الجزء العلوي. هو مستحلب الطبقة العليا مباشرة بتحويل إينتيرسيرينجي، بمعدل 20 مل/s ل x 6 إلى 8 x. يتم فصل الدهون مستحلب في 2,000 س ز لمدة 3 دقائق، والمادة لزجة تحت طبقة النفط التي يتم جمعها ويعرف بأنه المصفوفة خارج الخلية (ECM)/صندوق التبرعات الخاص-جيل. يتم تجميع النفط في الطبقة العليا. إضافة إلى 15 مل الدهون عالية الكثافة حوالي 5 مل من زيت ومستحلب بتحويل إينتيرسيرينجي، بمعدل 20 مل/s ل x 6 إلى 8 x. يتم فصل الدهون مستحلب في 2,000 س ز لمدة 3 دقائق، وأيضا المادة لزجة ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل. بعد زرع الأعضاء من ECM/صندوق التبرعات الخاص-الجل في الفئران عارية، تحصد الاختلاس وتقييمها بدراسة نسيجية. وتبين النتيجة أن هذا المنتج لديه القدرة على التجدد في الأنسجة الدهنية العادية. هذا الإجراء إجراء الانفصال ميكانيكية بسيطة وفعالة لاختصار الخلايا صندوق التبرعات الخاص جزءا لا يتجزأ من بهم ECM داعمة الطبيعية لأغراض التجدد.

المقدمة

تقدم علاجات الخلايا الجذعية تحولاً نموذجياً لإصلاح الأنسجة وتجديدها حتى أنها قد توفر نظام علاجية بديلة لمختلف الأمراض1. الخلايا الجذعية (مثلاً، المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية والخلايا الجذعية الجنينية) إمكانيات علاجية كبيرة ولكن محدودة بسبب تنظيم الخلية والاعتبارات الأخلاقية. المستمدة من الدهنية الوسيطة stromal/الخلايا الجذعية (الخزفية) من السهل الحصول على من ليبواسبيراتيس ولا تخضع لنفس القيود؛ وهكذا، فقد أصبح على نوع خلية مثالية للطب التجديدي العملية2. وباﻹضافة إلى ذلك، فهي نونيمونوجينيك، ولديها موارد وفيرة من الدهون الذاتي3.

حاليا، يتم الحصول على الخزفية أساسا بوساطة كولاجيناز الهضم من الأنسجة الدهنية. ويتضمن الكسر الأوعية الدموية stromal (SVF) من الأنسجة الدهنية الخزفية والسلف غشائي الخلايا وبيريسيتيس والخلايا المناعية. على الرغم من أن الحصول على كثافة عالية من صندوق التبرعات الخاص/الخزفية انزيماتيكالي تبين أن تكون لها آثار مفيدة، ينظم التشريع في عدة بلدان دقة التطبيق السريري للمنتجات المستندة إلى الخلية باستخدام كولاجيناز4. هضم الأنسجة الدهنية مع كولاجيناز لمدة 30 دقيقة إلى ح 1 للحصول على خلايا صندوق التبرعات الخاص يزيد من خطر كل المواد الخارجية في إعداد والتلوث البيولوجي. ثقافة ملتصقة وتنقية الخزفية، التي تستغرق أيام لأسابيع، تتطلب معدات مختبرية محددة. وعلاوة على ذلك، وفي معظم الدراسات، تستخدم الخلايا صندوق التبرعات الخاص والخزفية في تعليق. دون الحماية من المصفوفة خارج الخلية (ECM) أو ناقل آخر، معرضة بالخلايا الحرة ويسبب احتفاظ بخلية فقراء بعد الحقن، وخرق النتيجة العلاجية5. كل هذه الأسباب الحد من تطبيق مزيد من العلاج بالخلايا الجذعية.

للحصول على الخزفية من الأنسجة الدهنية دون وساطة كولاجيناز الهضم، كانت عدة إجراءات التجهيز الميكانيكية، بما في ذلك الطرد المركزي، الميكانيكية تقطيع وتمزيق ونتائج وتنميق، نمواً6،7 , 8 , 9-ويعتقد أن هذه الطرق لاختصار الخزفية والأنسجة بتعطيل ميكانيكيا adipocytes ناضجة وهذه الحويصلات الحاوية للنفط. وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه الاستعدادات، التي تحتوي على تركيزات عالية من الخزفية، إمكانات علاجية كبيرة كنماذج الطب التجديدي في الحيوان8،،من910.

في عام 2013، قدم تونارد et al. نانوفات تطعيم التقنية، الذي ينطوي على إنتاج مستحلب ليبواسبيراتيس بتجهيز11إينتيرسيرينجي. يمكن كسر قوة القص تم إنشاؤها بواسطة إينتيرسيرينجي تحول بشكل انتقائي adipocytes ناضجة. استناداً إلى النتائج التي تتوصل إليها، قمنا بتطوير أسلوب معالجة ميكانيكية بحتة أن يزيل معظم الدهون والسوائل في ليبواسبيراتيس، ترك ECM هورمونات، وهو ECM/صندوق التبرعات الخاص-جيل12وخلايا التبرعات فقط. هنا، نحن تصف تفاصيل عملية ميكانيكية للأنسجة الدهنية المستمدة من الإنسان لإنتاج ECM/صندوق التبرعات الخاص-الهلام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأقر هذا البحث "مجلس المراجعة الأخلاقية" في مستشفى نانفانغ، مدينة قوانغتشو، الصين. وجمعت الأنسجة الدهنية من صحية المانحين الذين قدموا كتب الموافقة المستنيرة للمشاركة في الدراسة. وافقت عليها لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية مستشفى نانفانغ جميع التجارب على الحيوانات وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية "الوطنية للصحة" و "مجلس البحوث الطبية" (الصين).

1-ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل إعداد

  1. الدهون الحصاد.
    1. إجراء شفط الدهون على إنسان مع قنية متعددة المنافذ 3 مم، التي تحتوي على عدة ثقوب جانبية حادة من 1 مم في القطر، وفي-0.75 الصراف الآلي للضغط شفط.
    2. جمع 200 مل ليبواسبيراتيس في كيس معقم.
  2. تعد الدهون كولمان.
    1. نقل ليبواسبيراتيس إلى أربعة أنابيب 50 مل والسماح للدهون المقطوع الترشح لا يزال 10 دقيقة.
    2. جمع الدهون في الطبقة العليا إلى أنبوبين 50 مل باستخدام ماصة واسعة-نصيحة نقل، وتجاهل الجزء السائل في الطبقة السفلي.
    3. استخدام أنابيب 50 مل، سينتريفوجاتي طبقة الدهون في س 1,200 ز في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 دقائق.
    4. تعريف الطبقة العليا (حوالي 80 مل) الدهون كولمان.
    5. نقل الأعلى 2/3 من الدهون كولمان إلى أنبوب 20 مل باستخدام ماصة واسعة-نصيحة، وتعريف هذا الجزء الدهون منخفضة الكثافة.
    6. نقل 1/3 أقل من الدهون كولمان إلى آخر 20 مل الأنبوبة باستخدام ماصة واسعة-نصيحة، ويحدد هذا الجزء الدهون عالية الكثافة.
  3. إنتاج ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل من الدهون منخفضة الكثافة.
    1. استخدام المحاقن 20 مل اثنين متصلة بواسطة موصل أنثى والإناث اللوير لوك (مع قطرها داخلي 2.4 مم) إينتيرشيفت 20 مل الدهون منخفضة الكثافة.
    2. تبقى على سرعة تحول مستقر (في 20 مل/s) وكرر 6 x 8 x.
    3. سينتريفوجاتي الخليط في 2,000 س ز على RT لمدة 3 دقائق.
    4. جمع الجزء النفط على رأس في أنبوب 10 مل باستخدام ماصة واسعة-تلميح في RT لاستخدامها مرة أخرى.
    5. جمع المادة لزجة في الطبقة الوسطى، وهو ECM/صندوق التبرعات الخاص-هلام (الشكل 1أ)، باستخدام ماصة واسعة-نصيحة، وتجاهل السائل في الطبقة السفلي.
  4. إنتاج ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل من الدهون عالية الكثافة.
    1. إضافة 5 مل نفط (التي تم جمعها من الخطوة 1.3.4) إلى 15 مل الدهون عالية الكثافة.
    2. إينتيرشيفت الدهون مختلطة بين الحقن 6 x 8 x حتى يلاحظ فلوككولاتي داخل المستحلب.
    3. سينتريفوجاتي الخليط في 2,000 س ز على RT لمدة 3 دقائق.
    4. تجاهل الجزء النفط في الجزء العلوي.
    5. جمع المادة لزجة في الطبقة الوسطى (ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل) باستخدام ماصة واسعة-تلميح وتجاهل السائل في الطبقة السفلي.
    6. مزيج ECM/صندوق التبرعات الخاص-الجل من الخطوات 1.3.5 و 1.4.5.

2-نموذج ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل الاختلاس الماوس عارية

  1. تخدير الفئران عارية (8 أسابيع القديمة، والنساء) مع إيسوفلوراني (1%-3%) استنشاق التخدير في غرفة عمليات حيوانية.
  2. نقل ECM/صندوق التبرعات الخاص-الجل لحقنه 1 مل.
  3. قم بتوصيل حقنه 1 مل مع قنية تسلل كليلة.
  4. إدراج القنية تحت الجلد في الجناح كل من الماوس.
  5. حقن 0.3 مل من ECM/صندوق التبرعات الخاص-الجل.

3-الأنسجة الحصاد على 3، 15، و 90 يوما بعد حقن ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل

  1. تخدير الفئران مع إيسوفلوراني (1%-3%) التخدير استنشاق.
  2. التضحية الفئران بواسطة الأسلوب التفكك عنق الرحم.
  3. جعل شق في خط الوسط للجلد الظهرية للماوس مع المقص الجراحي.
  4. تشريح والحصاد ترقيع الدهون على كلا الجانبين من الماوس. تضمين ترقيع الدهون في بارافورمالدهيد 4 ٪ في الرايت بين عشية وضحاها.
  5. يذوي الأنسجة في زيادة تركيزات إيثانول: إيثانول 70%، اثنين من التغييرات، ح 1 وكل؛ الإيثانول 80%، وتغيير واحد، ح 1؛ الإيثانول 95%، وتغيير واحد، ح 1؛ 100 ٪ الإيثانول، ثلاثة تغييرات، 1.5 ح كل؛ زيلين نفط، ثلاثة تغييرات، كل 1.5 ح.
  6. اختراق الأنسجة مع شمع البارافين (58-60 درجة مئوية) واثنين من التغييرات، 2 حاء.
  7. تضمين الأنسجة إلى كتل البارافين. قطع المقاطع في سمك من حوالي 4 ميكرومتر ووضعها على الشرائح.

4-توضع وتلطيخ ويوزين

  1. ديبارافينيزي الشرائح كتلة البارافين التي نقع عليها في زيلين نفط الأول، والثاني، والثالث (10 دقيقة في كل).
  2. ترطيب أقسام الأنسجة بتمريرها من خلال خفض تركيزات (100%، 100%، 95%، 80%، 70%) حمامات الإيثانول لمدة 3 دقائق.
  3. شطف مقاطع الأنسجة في الماء المقطر (5 دقائق).
  4. وصمة عار مقاطع الأنسجة في توضع لمدة 5 دقائق.
  5. أشطف أقسام الأنسجة في إدارة مياه الحنفية عن 20 دقيقة ديكولوريزي في الكحول حمض 1% (1% HCl في الكحول 70%) شطف س. 5 في تشغيل ماء الصنبور حتى المقاطع الأزرق مرة أخرى.
  6. إضافة ثلاث قطرات صبغ ويوزين Y مباشرة على الشرائح واسطة ماصة، والسماح لصبغ تعيين لمدة 10 دقائق.
  7. يغسل الشرائح في ماء الصنبور لمدة 1-5 دقائق.
  8. يذوي الشرائح في زيادة تركيزات (70%، 80%، 95%، 100%، 100%) من الإيثانول لمدة 3 دقائق.
  9. مسح الشرائح في زيلين نفط الأول والثاني لمدة 5 دقائق.
  10. تحميل الشرائح في تركيب وسائط.

5-إيمونوفلوريسسينت تلطيخ

  1. ديبارافينيزي أقسام الأنسجة زيلين نفط الأول، والثاني، والثالث (5 دقيقة في كل).
  2. ترطيب أقسام الأنسجة التي يمر بها تركيزات مختلفة (100%، 100%، 95%، 95%، 70%) من الكحول وحمامات لكل 3 دقائق.
  3. احتضان المقاطع في حل 3 ٪ ح22 س في الميثانول في RT لمدة 10 دقائق.
  4. شطف الشرائح 2 x مع الماء المقطر، كل 5 دقائق.
  5. إسقاط الشرائح في سلة شريحة. إضافة 300 مل من 10 ملم سترات المخزن المؤقت (pH 6.0) واحتضان الشرائح في 95-100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. بارد شرائح RT لمدة 20 دقيقة.
  7. شطف الشرائح 2 x مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، كل 5 دقائق.
  8. إضافة 100 ميليلتر من 10% مصل بقرى الجنين على الشرائح واحتضان في دائرة هوميديفيد في الرايت ح 1.
  9. احتضان الفروع مع حل جسم الأولية (خنزير غينيا المضادة الماوس بيريليبين، 1: 400) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  10. شطف الشرائح مع برنامج تلفزيوني 3 س، 5 دقيقة.
  11. احتضان الفروع مع حل جسم الثانوي (مفتش الماعز خنزير غينيا المضادة-488) عن ح 2 في الرايت
  12. شطف الشرائح مع برنامج تلفزيوني 3 س، 5 دقيقة.
  13. تمحو الماء حول المقطع مع نظيفة المناديل الورقية.
  14. قطره 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) ومترافق 488 فلور أليكسا إيسوليكتين داخل الدائرة لتغطية القسم على الشريحة.
  15. جبل كوفيرسليبس والسماح لهم الجافة في الظلام.
  16. مراقبة الشرائح مع مجهر فلوري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد معالجة الدهون كولمان إلى ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل، يأخذ حجم النفط مهملة حتى 80 في المائة الحجم النهائي و 20% فقط من الأنسجة الدهنية للحفاظ عليها تحت طبقة النفط يعتبر ECM/صندوق التبرعات الخاص-هلام (الشكل 1أ). وقد ECM/صندوق التبرعات الخاص-جل مادة سائل يشبه سلس الذي يمكن أن تذهب من خلال إبرة غرامة ز 27؛ ومع ذلك، الدهون كولمان يتكون هيكل الدهنية لا يتجزأ مع ألياف كبيرة ويمكن أن تمر إلا 18 جرام قنية (الشكل 1

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وأظهرت القائمة على الخلايا الجذعية العلاج التجديدي فائدة محتملة كبيرة في أمراض مختلفة. الخزفية هي المرشحين العلاجية المعلقة لأنها سهلة للحصول على ولديهم القدرة على إصلاح الأنسجة وتجديد الأنسجة رواية15. ومع ذلك، هناك قيود على توسيع نطاق التطبيق السريري وأنها تتطلب إجراءات معقدة لعزل الخلايا وكولاجيناز لتجهيز6. ولذلك، من الضروري لتطوير تقنية بسيطة للحصول على خلايا جذعية دون استخدام كولاجيناز.

في هذه الدراسة، وقد عرضنا عملية ميكانيكية بحتة من الأنسج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيده عمل هذه المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعة من الصين (81471881, 81601702, 81671931)، ومؤسسة العلوم الطبيعية مقاطعة قوانغدونغ الصينية (2014A030310155)، و "مؤسسة مسؤول من مستشفى نانفانغ" (2014B009، 2015Z002، 2016Z010، 2016B001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alexa Fluor 488-congulgated isolectin GS-IB4المجسات الجزيئيةI21411
خنزير غينيا المضاد للفأر perilipinProgenGP29
DAPIThermofisherD1306
ماصة ذات طرف عريضCelltreat229211B
مجهر متحد البؤر   ؛Leica TCS SP2
عارية لطيفة جامعة جنوب Mdical/
المجهر الضوئي  أوليمبوس/
50 مل أنبوبكورنيج430828
كيس معقمLaishi/
microtomeLeica   ؛مركزي CM1900
Heraus
جهاز طرد

المراجع

  1. Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  2. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693(2012).
  3. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
  4. Halme, D. G., Kessler, D. A. FDA regulation of stem-cell-based therapies. New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).
  5. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  6. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  7. van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
  8. Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
  9. Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
  10. Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
  11. Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
  12. Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
  13. Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
  14. Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
  15. Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
  16. Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
  17. Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الكسر الوعائي السدويمعالجة المشفوطات الدهنيةهلام المادة الخلاليةتجديد الأنسجة الدهنيةالنقل بين المحاقنبروتوكول الطرد المركزيتحليل قياس التدفق الخلويالمجهر الإلكتروني الماسحالزرع في الفئران العارية
الميكانيكية ميكرونيزيشن من ليبواسبيراتيس للعلاج بالتجدد
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.